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植物基因工程

叶绿体遗传转化系统研究进展

专业：植物

姓名：战战

学号：2010916254

叶绿体遗传转化系统研究进展

摘要：植物基因工程另一目标：叶绿体遗传转化。本文介绍了叶绿体的简介；叶绿体基因及基因组；叶绿体遗传转化的原理和方法；叶绿体转化的优点；叶绿体遗传转化的表达载体构建的简介以及关于叶绿体遗传转化国内外研究新进展。

关键词：叶绿体遗传转化叶绿体基因组叶绿体基因表达载体

近二十几年来核转化技术是植物基因工程的主要方法，培育出了高产、优质和抗逆性强的转基因新品种，取得了可喜成果。然而，外源基因在转基因植物中表达效率低，表达不稳定，基因易失活和基因随即插入而造成的位置效应等是该方法的不足之处。而且，转基因植物田间释放后，转基因随花粉转移到环境中，会造成“基因污染”，打破原有的生态种群平衡。近几年，Losey等人的实验表明抗虫转基因玉米的花粉对非目的昆虫蝴蝶能产生毒害，这更加重了人们对转基因植物的担忧。为减轻目的基因大量表达对植物造成的伤害，叶绿体基因工程成了人们新的关注焦点。近年来的研究表明，将外源基因导入叶绿体基因组有望克服核转化中存在的弊端。到目前为止，已在烟草、水稻、拟南芥、马铃薯和油菜5种植物中实现了叶绿体转化。这一转化体系已开始成为植物基因工程中新的增长点。

l 叶绿体简介

叶绿体是绿色植物光合作用的场所，来源于古代的衣藻类原核生物。在高等植物的细胞中，细胞核叶绿体和线粒体都含有DNA，它们构成了既相对独立又相互联系的遗传系统。以细胞核为外源基因受体的植物基因工程已被广泛地应用于重要农作物的改良。但核基因转化仍存在一系列难以解决的问题，如细胞核基因组大、背景复杂；外源基因的表达效率低，后代不稳定；环境安全难以保证等。为克服核基因转化存在的不足，1988年，Boynton等以衣藻为材料用基因枪进行源基因对叶绿体的转化，首次证实了叶绿体转化的可行性。这项工作使人们意识到植物的叶绿体不仅是光合作用的重要场所，也可以作为植物基因工程的新的

转化和表达受体叶绿体转化系统现已成为植物基因工程的新热点。

叶绿体转化系统研究进展1987年，自基因枪转化方法建立后，次年．Boynton等即利用该方法对衣藻的叶绿体用外源基因进行遗传转化，首次证明了植物叶绿体基因组可以被转化开始．目的基因导人叶绿体的方法一直作为研究重点除基因枪转化法外，还相继出现了一些新的将外源基因导人叶绿体的方法。但是，一系列的实验结果证实，基因枪转化法仍是最有救的叶绿体转化方法。

叶绿体含有双链环状DNA(Manning，1971)有IRA和IRB两个反向重复序列(分别位于A链和B链)，两者基因大小完全相同，只是方向相反，它们之间有一个大的单拷贝区(1arge single copy region，LSC)，大小约80kb，和一个小的单拷贝区(small single copy region，SSC)，大小约20kb。多数叶绿体DNA 大小在120～160kb，最大2000kb(伞藻)，最小85kb(刺海松)L1]。叶绿体基因组中的基因在漫长的进化历程中，有许多转移到了核中，遗留在叶绿体中的基因是功能必需的一些基因，有巨大的拷贝数(一个叶绿体中，基因拷贝数可达上百个；一个细胞中，基因的拷贝数可达上万个)，而且它们都是原核生物来源的，具有原核生物基因的特点叶绿体基因多为多顺反子转录单位，这些转录单位中基因的排列顺序是高度保守的。

最初，来自突变体的16s rRNA基因的壮观霉素抗性被作为筛选标记，但转化效率较低之后，Svab等选用编码壮观霉素和链霉素抗性的aadA基因作为筛选标记基因，在很大程度上克服了突变核糖体RNA筛选标记基因不易被检出的缺点，可将叶绿体转化率提高100倍，几乎达到核转化水平近几年，绿色荧蛋白(GYP)作为筛选标记应用于这一领域大大方便了筛选过程。GFP基因的表达产物存在于植物细胞质中时，会对其表型及生殖产生一定影响，但定位于叶绿体后，即使大量表达，受体植物也不会出现明显不良反应，这表明GYP适用于叶绿体转化系统。最近，Bateman等提出aphA-6基困编码的氨基糖苷磷酸转移酶可作为叶绿体转化筛选标记。

这些新的筛选标记的出现，使叶绿体转化受体植物范围扩大至一些因无合适组织培养筛选标记而不能进行叶绿津转化的植物，为其广泛应用打下了基础目前．叶绿体转化的植物种类也有所扩展，在高等植物中，除已获得稳定的转基因烟草植株外，还获得了在植物叶绿体中稳定表达GFP基因的转基因水稻、马铃薯植株。

2 关于叶绿体基因组和叶绿体基因

叶绿体是绿色植物进行光合作用重要细胞器，同时是一个半自主性的细胞器，含有自己的

DNA分子，能进行自我复制。大部分叶绿体DNA都是共价闭合的双链环状分子。少数为线状分子。叶绿体DNA分子一般长为120～160kb。每一叶绿体中一般含有多拷贝DNA，但拷贝数不等，据报道在20～9OO之间。DNA分子存在于叶绿体基质中。常以10—20个分子聚成一簇，与叶绿体的内膜或类囊体膜结合。叶绿体中的DNA约为片中全部DNA的10％～20％。叶绿体基因组不仅比核基因组小得多，就连大肠杆菌染色体基因组也要比它大出10余倍甚至20多倍。这无疑给叶绿体基因的克隆与遗传操作带来许多方便。另外大多数植物的叶绿体DNA都有一个突出的特点。即环状DNA分子上均存在两个反向重复序列(inverted repeat sequence)IAA和IRB。两个反向重复序列之间有一个大单拷贝区(1arge single—copy region，LSC)和一个小单拷贝区(small single—copy region，SSC)，前者一般长约80kb，后者长约20。豌豆和蚕豆等植物的叶绿体DNA中则没有反向重复序列。

3 叶绿体遗传转化的原理

叶绿体遗传转化的概念叶绿体遗传转化即以叶绿体基因组为外源DNA受体的一种遗传

转化。

叶绿体遗传转化的基本原理外源基因通过同源片段的双交换，定点整合到叶绿体基因组中

4 叶绿体遗传转化的方法

目前，叶绿体的遗传转化技术主要有：①基因枪法；②玻璃珠搅拌法；③紫外激光微束法：④PEG处理法；⑤气溶胶基因导入法等。但除基因枪法外，其余几种方法转化效率很低。基因枪法[即以外力驱动包裹有外源DNA的金属微粒(金粉或钨粉)，使其获得高速而冲击植物材料，从而把外源DNA导入叶绿体1因其安全性好、重复性好、残留在细胞上的有毒金属颗粒少、转化频率高而成为最成功的叶绿体遗传转化法。但由于基因枪是一种相当昂贵和复杂的仪器，一般实验室很难具备，因此通过离体叶绿体体外转化和细胞融合技术实现植物的转化因其廉价、简单可行而成为可能。而叶绿体的体外培养使其保持一定时间的活性是通过原生质细胞融合技术进行叶绿体转化的一个重要环节。

5 叶绿体转化的优点

叶绿体作为遗传转化受体具有诸多方面的独特性：高拷贝的叶绿体DNA分子可以提高外源基因的表达量：可以做到外源基因的定点整合；外源基因性状稳定快：直接表达原核基因；利于同时进行多基因

转化；产物区域化；生物安全性高。

6 叶绿体遗传转化的表达载体的构建

要实现外源基因在叶绿体基因组的整合及有效表达，载体的构建方法与细胞核表达载体有所不