免疫学实验一抗二抗的选择与搭配原则和方法
免疫组化一抗二抗原理
免疫组化一抗二抗原理一、免疫组化技术原理免疫组化技术是一种重要的生物化学检测方法，通过使用一抗和二抗的相互作用，来检测目标物质在细胞或组织中的分布和定量。
其原理主要包括以下几个步骤：1. 抗原表达和固定：首先，需要提取或制备出待检测物质的抗原，并将其固定在载玻片或微孔板上。
2. 样品处理：将待检测的细胞或组织样品处理，使其表达出目标物质。
3. 一抗处理：将经过特异性识别的一抗加入样品中，一抗能够与目标物质发生特异性结合，并形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗处理：加入与一抗来源物种不同的二抗，二抗能够与一抗发生特异性结合，并进一步增强抗原-抗体复合物的信号。
5. 检测信号放大：通过连接二抗的酶标记物或荧光标记物，可以进一步放大信号。
6. 显色或荧光检测：通过加入适当的显色剂或荧光探针，可以将特定信号转化为可见的颜色或荧光。
7. 显微镜观察：使用显微镜观察和分析样品中的标记信号分布情况，从而确定目标物质的位置和数量。
二、免疫组化技术应用免疫组化技术广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
具体应用包括：1. 细胞和组织定位：通过标记特定抗原或蛋白质，可以确定其在细胞或组织中的定位，帮助研究者了解其功能和相互作用。
2. 疾病诊断：免疫组化技术可以检测疾病标志物，如癌症标志物、病毒抗原等，用于早期诊断和病情监测。
3. 药物研发：免疫组化技术可用于评估药物在细胞或组织中的靶点表达和药效。
4. 免疫组织化学：通过标记细胞或组织中的特定分子，可以帮助鉴定组织类型、识别病理变化以及评估治疗效果。
5. 免疫组化芯片：免疫组化芯片技术结合了高通量技术和多路复用的优势，可以快速、准确地检测多个标志物，有望在个性化医疗中得到广泛应用。
三、免疫组化技术的发展前景随着生物技术和分子生物学的不断发展，免疫组化技术也在不断创新和改进。
未来的发展方向主要包括：1. 自动化和高通量：通过引入自动化设备和流程，提高实验的标准化和效率，同时实现多个标志物的高通量检测。
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验，这名字听起来就很炫酷，对吧？其实它就是一个让我们能同时看到两种不同标记物的实验。
没错，就是让我们在显微镜下像变魔术一样，看到细胞中的不同成分。
为了能让这个实验顺利进行，我们得好好挑选一抗和二抗，别小看这两个“小家伙”，它们可是实验成功的关键哦。
接下来，我们就来聊聊挑选一抗和二抗的那些事儿。
1. 选择一抗的基本要求首先，一抗是我们的“主角”，它负责直接和目标抗原结合。
为了让实验更靠谱，我们在挑选一抗的时候有几个基本要求。
首先，得确保一抗的特异性。
简单来说，就是一抗要能够准确地识别目标抗原，不会跟其他东西搭上关系。
你可以把它想象成找一个能只看中你家猫的侦探，千万别让它误认成了邻居家的狗狗。
此外，一抗的亲和力也很重要。
亲和力高的话，一抗就能牢牢地抓住目标抗原，不容易掉链子。
就像是找一个有“强烈吸引力”的好朋友一样，这样才能在关键时刻依靠得住。
1.1 一抗的来源选择一抗时，来源也要考虑清楚。
市面上的一抗分为很多种，有的是从小鼠身上提取的，有的是从兔子身上提取的，甚至还有从山羊身上提取的。
每种来源的一抗都有自己的优点和缺点。
例如，小鼠单克隆抗体常常具有高度的特异性，但可能在某些实验条件下效果不如其他来源的抗体好。
像兔子或者山羊的抗体则可能在灵敏度上表现得更好。
了解这些，才能找到最适合你实验的一抗。
1.2 一抗的纯度一抗的纯度也不能忽视。
想象一下，如果你的试剂里混杂了很多其他东西，就像是在派对上有太多不认识的人一样，肯定会让实验结果变得扑朔迷离。
因此，选择纯度高的一抗非常重要，它能让你减少实验中的干扰，提高结果的准确性。
选择纯度高的一抗，就像在举办一个小型的、只有好友参与的派对，所有人都知道自己干嘛的，大家都玩得开心。
2. 选择二抗的基本要求说完了一抗，接下来咱们聊聊二抗。
二抗是我们的“帮手”，它负责和一抗结合，并且带上荧光标记。
二抗的选择也有讲究，首先是它的特异性。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项免疫荧光双标技术（Immunofluorescence Double Staining Technique）是一种常用于生物医学研究中的实验技术，通过检测特定抗原和抗体的结合情况，可以对细胞或组织中的蛋白质进行定位和表达研究。
在进行免疫荧光双标实验时，为了确保实验结果的准确性和可靠性，有几个操作要点和注意事项需要特别关注和遵守。
一、试剂准备在开始实验之前，需要准备好以下试剂：1. 抗体：根据实验需要选择适当的一抗和二抗。
一抗用于识别待检测的抗原，二抗则与一抗结合形成免疫复合物，发出荧光信号。
2. 样品：包括细胞、组织等待检测的样品。
3. 荧光染色试剂：根据实验需要选择适当的荧光染色试剂。
常用的有荧光染料如荧光素、多聚荧光素等。
4. 细胞或组织培养基：提供细胞或组织的生长和营养。
二、标本处理1. 样品固定：使用适当的固定液对细胞或组织样品进行固定，一般常用的固定液有乙醛或甲醛。
2. 膜通透：使用适当的溶液对固定后的样品进行膜通透处理，常用的膜通透液有Triton X-100等。
三、抗体反应1. 一抗孵育：将适当稀释的一抗添加到样品中，充分反应一段时间，使一抗与待检测的抗原结合。
2. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的一抗。
3. 二抗孵育：将适当稀释的二抗添加到样品中，与已结合的一抗形成免疫复合物。
4. 再次洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的二抗。
四、荧光染色和观察1. 加入荧光染色试剂：将所选的荧光染色试剂加入样品中，使其与免疫复合物结合。
2. 温度和时间控制：根据荧光染色试剂的要求，控制反应温度和时间，确保荧光信号的强度和稳定性。
3. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的荧光染色试剂。
4. 观察和分析：使用荧光显微镜观察样品，记录和分析荧光信号的分布和强度。
注意事项：1. 试剂保存：保持试剂的储存条件和有效期，使用前检查试剂的颜色和透明度，避免使用已失效的试剂。
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求，听起来好像很专业的样子，但是其实很简单，就是让我们的实验数据更加清晰明了。
那么，我们该如何选择合适的一抗和二抗呢？接下来，就让我来给大家普及一下吧！我们要明确什么是一抗和二抗。
一抗，就是第一抗体，也就是我们要检测的目标物质；二抗，就是第二抗体，它可以与一抗结合，形成一种复合物，从而使我们能够看到目标物质的存在。
那么，如何选择合适的一抗和二抗呢？1.1 选择一抗选择一抗的时候，我们要考虑到以下几个方面：(1)特异性：一抗要能够准确地识别目标物质，不能误识别其他物质。
这就好比是我们要找一个人，但是他长得像很多人，我们不能因为他长得像别人就把他当成那个人。
(2)灵敏度：一抗要有足够的敏感性，能够在低浓度下检测到目标物质。
这就好比是我们要在人海中找到一个特定的人，但是他的出现频率很低，我们不能因为他出现的次数少就忽略了他。
(3)稳定性：一抗要具有一定的稳定性，不会因为外界因素的影响而失去活性。
这就好比是我们要找一个人，但是他总是在关键时刻消失不见。
选择合适的一抗就是要找到一个既能准确识别目标物质，又有足够敏感性和稳定性的人。
1.2 选择二抗选择二抗的时候，我们要考虑到以下几个方面：(1)特异性：二抗要能够准确地识别一抗，不能误识别其他一抗或者背景分子。
这就好比是我们要找一个人，但是他长得像很多人，我们不能因为他长得像某个特定的人就把他当成那个人。
(2)灵敏度：二抗要有足够的敏感性，能够在低浓度下检测到与一抗结合的复合物。
这就好比是我们要在人海中找到一个特定的人，但是他出现的频率很低，我们不能因为他出现的次数少就忽略了他。
(3)稳定性：二抗要具有一定的稳定性，不会因为外界因素的影响而失去活性。
这就好比是我们要找一个人，但是他总是在关键时刻消失不见。
选择合适的二抗就是要找到一个既能准确识别一抗，又有足够敏感性和稳定性的人。
2.1 一抗和二抗的选择时机在进行荧光双染实验时，我们需要根据实际情况来选择合适的一抗和二抗。
一抗的选择
随着生命科学的发展，围绕蛋白进行的研究越来越多，抗体试剂在实验中的重要性越来越举足轻重。
面临着纷呈复杂的抗体试剂市场，如何选择到适合自己实验的抗体就变得尤为重要。
当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。
抗体种类繁多，品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。
一、抗体选择总体原则1. 关于特异性的选择特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。
（1）蛋白特异性针对需要检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分，重组表达的蛋白和内源性蛋白的检测，对抗体的要求是不一样的，注意查看抗体说明书的检测说明。
如果重组蛋白不是全长表达，则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。
内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式，特殊表型的蛋白需要进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，查看交叉反应的情况。
磷酸化蛋白检测需要确定具体位点，不同位点的磷酸化意味着可能有不同的机制存在，不宜一概而论。
（2）种属特异性同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。
目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或设计多肽抗原的，根据蛋白的同源性情况与其他种属发生交叉反应。
需要参照说明书注明的可反应种属信息。
一些稀有种属很难找到抗体，可以通过蛋白的序列比对，选择同源序列免疫的抗体，不过一般这种情况生产商不会受理其关于质量的申诉，如果可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体选择。
（3）实验方法特异性目前使用抗体的实验方法有很多，不同的使用方法过程中，因为对蛋白样品的处理方式不一样，蛋白的含量有差异，对抗体的识别表位和效价要求都是不一样的。
具体的根据说明书注明的产品应用方法进行选择。
但是生产商一般不会将每个抗体都进行各种实验的检测，目前检测比较多的只是WB、IHC、IF等，如果针对具体的实验方法没有找到合适的抗体的，可以结合蛋白序列分析和抗体的抗原信息，选择尽可能有效果的抗体。
免疫荧光一抗二抗的选择及其技巧
免疫荧光一抗二抗的选择及其技巧据一抗种属及类型-如何选择二抗?如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，艾美捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
艾美捷能为您提供最全的抗不同种属的原装进口二抗，包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗。
【一抗的类别亚型】二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。
这通常是针对单克隆抗体而言。
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。
其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。
如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。
艾美捷能为您提供通用的IgG（H+L）二抗，或者特异性只结合IgM的Anti IgM （mu） Antibody、IgA的Anti IgA （alpha-Antibody、IgE的Anti IgE （epsilon） Antibody等。
免疫双标,抗体如何选择？
免疫双标，抗体如何选择？注意几点：1）最好是不同种属来源的一抗，而且最好都是单抗。
这样就要选择相应不同种属来源的二抗，避免同种属来源的二抗与两个一抗的交叉反应。
选择单抗也是避免交叉反应和假阳性。
好的抗体真的还是很重要。
2）如果条件所限，只找到一种抗体，而且说明书没有明确说可以做免疫荧光怎么办？这个可能不是说就一定不能做，也可能是厂家没做这方面的实验，可以大胆的try3)为何免疫双标一般是免疫荧光为主？一方面是不同抗体标记不同的荧光，图片漂亮；另一方面也是为了避免SP和ABC法中还要封闭内源性过氧化物酶等可能会引起假阳性反应。
4）是否可以用不同荧光染料直接标记的不同一抗来做？可以做，过程还可省一步。
但是注意没有二抗的放大效应，结果可能有时很难出来。
5）免疫双标荧光的图像如何整合？可以用扫描共聚焦，或者用园子的软件整合。
注意及时照相，荧光过段时间会淬灭。
免疫双标中，最为关键的是一抗、二抗的选择以及恰当的搭配：1. 免疫双标做得好的基本原则是：一抗种属不同，二抗匹配对应的一抗，二抗不同颜色标记，二抗之间无交叉反应2. 抗体的选择一般根据本实验相关的一些关键词（抗体名称、编号、目标动物种属、实验方法...）来检索一些档次较高的文献，看看图片较好的文献中研究者们用的哪个公司的什么编号抗体，不见得知名公司的抗体就一定做得出来，实践检验过了的才是金标准。
3. 封闭液的选择封闭液作用就是尽量封闭掉能与二抗结合产生非特异性染色的抗原。
所以，封闭液尽量选择与二抗种属同源的血清封闭液。
比如，二抗是“驴抗羊FITC、驴抗兔CY3”，那么最佳封闭液就是驴血清封闭液。
免疫双标一抗的选择主要有两种形式:第一：一抗种属来源相同：即一抗A和B都是小鼠抗大鼠，或者都是兔抗大鼠；对于这种情况，采用的双标方法是顺序法，即把免疫组化的过程走两遍，一抗不能同时加。
第二：一抗种属来源不同：比如一抗A是小鼠抗大鼠，一抗B是兔抗大鼠，即A的种属来源是小鼠，B的种属来源是兔；针对的组织是大鼠。
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验是一种常见的细胞生物学研究方法，它可以用于检测细胞内的蛋白质表达水平、定位细胞器分布以及研究信号通路等。
在进行荧光双染实验时，一抗和二抗的选择是非常重要的，因为它们直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
本文将从理论和实践两个方面，详细介绍荧光双染实验中一抗和二抗选择的基本要求。
我们来了解一下一抗和二抗的概念。
一抗(Antibody 1)是指用于检测特定抗原的单克隆抗体，它可以与抗原结合并形成免疫复合物，从而实现对抗原的定量或定位。
二抗(Antibody 2)是指与一抗互补的单克隆抗体，它的特异性可以增强一抗的亲和力和信号强度，从而提高实验的灵敏度和特异性。
在荧光双染实验中，选择合适的一抗和二抗是保证实验结果的关键。
以下几点是进行一抗和二抗选择的基本要求：1. 一抗和二抗的特异性要强特异性是指一抗和二抗只能与目标抗原或靶蛋白结合，而不能与其他分子发生反应。
为了保证实验的准确性和可靠性，一抗和二抗的特异性必须很强。
这可以通过对比不同一抗和二抗对同一样本的检测结果来实现。
如果大部分样本都能被一种特定的一抗和二抗识别并结合，那么这种组合就是具有较强特异性的。
2. 一抗和二抗的亲和力要适中亲和力是指一抗和二抗与目标抗原或靶蛋白结合的能力。
亲和力过低会导致一抗和二抗无法结合到目标抗原或靶蛋白上，从而影响实验结果；亲和力过高则可能导致过度结合，使得信号强度降低，影响后续分析。
因此，在选择一抗和二抗时，需要找到一个适中的亲和力值，使得它们能够有效地结合到目标抗原或靶蛋白上，同时又不会导致信号强度过低。
3. 一抗和二抗的稳定性要好稳定性是指一抗和二抗在储存和使用过程中是否会发生结构变化或失活。
如果一抗和二抗不稳定，那么它们的性能就会受到影响，从而导致实验结果不准确。
因此，在选择一抗和二抗时，需要考虑它们的稳定性，尽量选择那些经过严格质控、储存条件稳定的产品。
4. 一抗和二抗的价格要合理虽然一抗和二抗的质量非常重要，但价格也是一个不容忽视的因素。
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求，听起来好像很高大上，其实也就是让我们的实验结果更加准确、清晰。
那么，我们该如何选择合适的一抗和二抗呢？别着急，让我来给大家普及一下相关知识。
我们要明确什么是一抗和二抗。
一抗，就是单克隆抗体，它可以特异性地识别我们想要研究的蛋白质。
而二抗，就是针对一抗的抗体，它可以帮助我们检测一抗与目标蛋白的结合情况。
所以，一抗和二抗就像是一对默契的搭档，相互配合，共同完成实验任务。
那么，如何选择合适的一抗和二抗呢？这里我们要遵循以下几个原则：1. 一抗的选择要与目标蛋白高度匹配。
这意味着我们要选择能够特异性识别目标蛋白的一抗。
这样一来，当我们用一抗与样品中的蛋白结合时，只有目标蛋白会被一抗识别，其他无关蛋白则不会被结合。
这样可以避免背景干扰，提高实验准确性。
2. 二抗的选择要与一抗相匹配。
这是因为二抗是针对一抗设计的，它们之间有很强的互补性。
如果我们选择了与一抗不匹配的二抗，那么它们可能无法正确识别一抗与目标蛋白的结合情况，从而导致实验结果不准确。
所以，我们在选择二抗时，要确保它与我们选择的一抗相匹配。
3. 一抗和二抗的灵敏度要足够高。
这意味着它们能够在低浓度的目标蛋白存在时也能检测到信号。
这样一来，我们就可以在不同浓度的目标蛋白样品中进行实验，从而获得更全面的实验数据。
4. 一抗和二抗的特异性要高。
这意味着它们不能与其他蛋白质发生结合反应。
这样一来，我们就可以避免背景干扰，提高实验准确性。
5. 一抗和二抗的价格要合理。
虽然高质量的一抗和二抗价格可能会比较高，但我们需要权衡利弊。
如果我们选择了质量不高的一抗和二抗，那么实验结果可能会受到影响，从而导致实验失败。
所以，在选择一抗和二抗时，我们要综合考虑它们的价格、质量等因素。
选择合适的一抗和二抗是我们进行荧光双染实验的关键。
只有选择了高质量的一抗和二抗，我们的实验结果才能更加准确、清晰。
所以，大家在进行实验时，一定要注意选择合适的一抗和二抗哦！。
免疫学实验一抗,二抗的选择与搭配原则和方法
单克隆二抗
来自单一克隆细胞株，识别单 一表位，具有高特异性和一致 性。
二抗选择依据
种属来源
选择与一抗相同或相近种属来源的二 抗，以减少背景噪音。
抗体类型
根据实验需求选择IgG、IgM等类型 的二抗。
特异性与交叉反应
选择高特异性、低交叉反应的二抗， 以确保实验结果的准确性。
荧光标记
根据实验需求选择不同荧光标记的二 抗，如FITC、PE、APC等。
抗体鸡尾酒法
将多种抗体按一定比例混合后，与样品孵育 ，可同时检测多个抗原并降低背景噪音。
03
二抗选择与搭配原则二抗类型及特点 Nhomakorabea01
02
03
04
IgG类二抗
针对特定种属的IgG，如小鼠、 大鼠、兔等，具有高特异性和 亲和力。
IgM类二抗
主要用于检测IgM抗体，常用 于病毒感染等研究。
多克隆二抗
由多种克隆细胞株混合而成， 可识别多个表位，增加检测灵 敏度。
免疫学实验一抗二抗的选择与 搭配原则和方法
目
CONTENCT
录
• 引言 • 一抗选择与搭配原则 • 二抗选择与搭配原则 • 实验方法与技术 • 结果分析与解读 • 实验案例分享与讨论
01
引言
实验目的与意义
探究抗原与抗体之间的特异性结合关系，为免疫学研究和医学诊 断提供理论支持和实践指导。
通过一抗二抗的选择与搭配，实现对抗原的高灵敏度、高特异性 检测，提高实验的准确性和可靠性。
免疫学实验概述
免疫学实验是研究抗原与抗体 相互作用及其相关生物学效应 的重要手段，涉及免疫学、生 物化学、分子生物学等多个学 科领域。
免疫学实验包括抗原抗体反应 、免疫细胞功能检测、免疫分 子检测等多个方面，其中抗原 抗体反应是免疫学实验的核心 内容之一。
wb一抗二抗原理
wb一抗二抗原理WB一抗二抗原理是现代生物学和免疫学研究中重要的实验原理之一。
它是一种病毒性和细菌性感染疾病的检测方法，同时也是一种用来检测蛋白质的工具。
本文将从步骤、应用以及优缺点等方面介绍WB 一抗二抗原理。
一、步骤1、蛋白质提取首先，需要从细胞或组织中提取目标蛋白质。
其中，一些常用的蛋白质提取液包括SDS蛋白提取液、RIPA缓冲液等。
2、电泳分离其次，将提取的蛋白质用电泳进行分离，通常使用SDS-PAGE电泳技术，将蛋白质加入到聚丙烯酰胺凝胶中进行分离，根据蛋白质的大小进行分类。
3、转膜接着，需要将分离出的蛋白质通过转膜到聚丙烯酰胺膜中，同时将膜进行水化处理，保持一定的湿润度。
4、阻断转膜完成后，需要对膜进行非特异性的阻断处理，常见的方法是使用5%的非脂奶粉或者1%的BSA。
5、一抗探针检测将特异性一抗探针加入膜上，与目标蛋白质结合，这是一抗部分。
6、二抗HRP酶标签检测接下来，加入二抗HRP酶标签进行特异性检测，HRP酶标签用基质的比色法表征，这是二抗部分。
7、显色检测将膜浸泡在含有显色剂的缓冲液中，显色剂与HRP酶标签呈现出沉淀反应，出现适当的显色信号。
二、应用WB一抗二抗原理广泛应用于研究蛋白质的表达和功能调控、筛选治疗特定蛋白质功能障碍疾病的药物以及检测新药的动态变化等。
WB一抗二抗原理可以定量检测蛋白质，具有较高的灵敏度和特异性，能够实现高通量分析和自动化操作，为生物学和免疫学研究的推进提供了有力支持。
三、优缺点WB一抗二抗原理的优点在于其检测的灵敏度和特异性高、可检测大量蛋白质以及对蛋白质有定量分析能力等。
但其不足之处在于需要对蛋白质进行特异抗体的制备，成本较高，同时对蛋白质的完整性和活性也有要求。
总之，WB一抗二抗原理是广泛应用于生物学和免疫学研究中的一种重要实验方法。
特别是在疾病治疗和药物研发中具有重要的应用价值。
一抗、二抗的选择
IgA
正常情况，脐血IgA含量为0～50mg/L; 血内IgA含量新生儿为0～22mg/L，0.5～6个月为3～ 820mg/L，7个月～2岁为140～1080 mg/L，2～6岁为230～1900mg/L，6～12岁为290～2700mg/L， 12～16岁为810～2320mg/L，成人为760～3900mg/L。 IgA增高：在慢性肝病，亚急性或慢性感染性疾病（如结核、真菌感染等）、自身免疫性疾病（如 SLE、类风湿关节炎）、囊性纤维化、家族性嗜中性粒细胞减少症、乳腺癌、IgA肾病、IgA骨髓瘤 等情况下； IgA降低：在遗传性或获得性抗体缺乏症、免疫缺陷病、选择性IgA缺乏症、无γ－球蛋白血症、蛋 白丢失性肠病、烧伤、抗IgA抗体综合症、免疫抑制剂治疗、妊娠后期等情况下。
IgM
正常情况下，脐血IgM含量为40～240mg/L，血内IgM含量新生儿为50～300mg/L，0.5～6个月为 150～1090mg/L，6个月～2岁为430～2390mg/L，2～6岁为500～1990mg/L， 6～12岁为500～ 2600mg/L，12～16岁为450～2400mg/L，成人为400～3450mg/L。 IgM增高：在胎儿宫内感染、新生儿TORC H综合症、慢性或亚急性感染、疟疾、传染性单核细胞 增多症、支原体肺炎、肝病、结缔组织疾病、巨球蛋白血症，无症状性单克隆IgM病等情况下，； IgM降低：在遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合症、选择性IgM缺乏症、蛋白丢失 性肠病、烧伤、抗Ig抗体综合症（混合性冷球蛋白血症）、免疫抑制等情况下，。
一抗、二抗的选择
Байду номын сангаас
一抗的选择
• 1.分析实验应用类型 WB（Western Blot 免疫印迹 ） IHC （immunohistochemistry免疫组织化学） ELISA（enzyme-linked immunoadsordent assay 酶联免疫吸附试验 ）
一抗、二抗的选择
IgM
正常情况下，脐血IgM含量为40～240mg/L，血内IgM含量新生儿为50～300mg/L，0.5～6个月为 150～1090mg/L，6个月～2岁为430～2390mg/L，2～6岁为500～1990mg/L， 6～12岁为500～ 2600mg/L，12～16岁为450～2400mg/L，成人为400～3450mg/L。 IgM增高：在胎儿宫内感染、新生儿TORC H综合症、慢性或亚急性感染、疟疾、传染性单核细胞 增多症、支原体肺炎、肝病、结缔组织疾病、巨球蛋白血症，无症状性单克隆IgM病等情况下，； IgM降低：在遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合症、选择性IgM缺乏症、蛋白丢失 性肠病、烧伤、抗Ig抗体综合症（混合性冷球蛋白血症）、免疫抑制等情况下，。
IgM
• IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链， 具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五 个抗原结合价。IgM分子量约为900000，IgG分子量约为 150000。 • 机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗 体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG 抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。 • IgM抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此IgM抗体的 测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。 • IgM 是抗原刺激诱导体液免疫应答中最先产生的Ig ，IgM 不是细胞，但可结合补体，主要分布于血清中。由于IgM 有较高的结合价，所以是高效能的抗生物抗体，其杀菌、 溶菌、促吞噬和凝集作用比IgG 高500- 1000 倍，IgM 在 机体的早期防御中起着重要的作用。
【Anti-IgG还是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】
在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞 等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择AntiIgG, F（ab’）2 fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部 分与IgG的非特异性结合。 常规的Anti-IgG （H+L）二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即 与IgG的Fc的F（ab’）2片段都能结合； 由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG （H+L） 与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment经过了IgG Fc 片段的吸附，因此只与IgG的F（ab’）2片段结合。
一抗和二抗的选择
一抗的选择检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适的抗体，需要考虑如下几种因素：分析试验应用的类型l样本蛋白的结构性质l样本的种属l抗体宿主的种类l抗体的标记和检测l1.分析试验应用的类型一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。
2.样本蛋白的结构性质了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。
如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。
l 样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。
当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来l3.样本的物种应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy 和NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。
一抗和二抗的选择
一抗的选择检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适的抗体，需要考虑如下几种因素：分析试验应用的类型l样本蛋白的结构性质l样本的种属l抗体宿主的种类l抗体的标记和检测l1.分析试验应用的类型一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。
2.样本蛋白的结构性质了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。
如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。
l样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。
当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来l3.样本的物种应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy 和 NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。
如何选择一抗和二抗？
如何选择⼀抗和⼆抗？
1. ⼀抗选择
（1）确定抗体的名字，注意中英⽂名字、别名、亚型等信息。
（2）确定您的实验类型，Elisa，WB，IHC，ICC，或者是FACS。
⼀般抗体说明书都会列出抗体经验证过适⽤的实验类型，如果抗体说明书没有提及的应⽤类型，并不意味着该抗体不适⽤于此种分析应⽤类型，⽽仅是说明尚未经过此种实验验证。
（3）确定实验样本的种属，Human，Mouse，Rat等。
抗体说明书⼀般都会列出该抗体验证过的适⽤物种，可根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验需要的抗体。
（4）样本抗原蛋⽩的结构性质。
了解样本抗原蛋⽩的结构性质有助于选择最合适的抗体，待测样本蛋⽩的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性，蛋⽩空间构象的改变，会影响抗体的免疫亲和反应。
（5）单多克隆抗体的选择。
⼀般单克隆抗体特异性强，但亲和⼒相对⼩，检测抗原灵敏度相对就低；⽽多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和⼒强，灵敏度⾼，但易出现⾮特异性染⾊（可以通过封闭等避免）。
2. ⼆抗选择
（1）种属来源。
主要根据⼀抗种属来源⽽决定⼆抗来源，如⼀抗是⼩⿏来源，那⼆抗就买抗⼩⿏的即可（⽺、兔等均可）。
（2）标记物的选择。
有HRP、Biotin、荧光素等标记物。
免疫组化，WB⼆抗主要选择HRP，Biotin标记的⼆抗，⽽免疫荧光染⾊可按实验需要选择不同荧光素标记的⼆抗，如FITC、Cy3、PE等。
免疫荧光二抗选择原理
免疫荧光二抗选择原理一、免疫荧光二抗选择原理免疫荧光可是个超有趣的东西呢，二抗的选择也是很有讲究的。
咱先说说二抗是干啥的。
二抗就是要和一抗结合的抗体啦。
一抗是先和咱们要检测的抗原结合的，二抗再去找到一抗，就像小跟班找到大当家的一样。
那选择二抗的时候呢，要考虑它的来源。
比如说，如果一抗是鼠源的，那二抗就不能是鼠源的啦，不然它们就会自己玩自己的，不理会一抗和抗原的结合啦，这就像同类之间可能会互相竞争而不是合作一样。
二抗的特异性也很重要哦。
特异性高的二抗就像一个超精准的小侦探，只找特定的一抗，不会和其他乱七八糟的东西结合。
要是特异性不高，就可能会出现假阳性的结果，那就糟糕啦，就好像认错人一样，把不是目标的东西当成目标了。
还有二抗的标记物。
有些二抗是带荧光标记的，这个荧光标记的种类也有很多选择呢。
不同的荧光标记在显微镜下会发出不同颜色的光。
比如说，FITC标记的二抗会发出绿色的荧光，TRITC标记的可能是红色的荧光。
我们要根据自己的实验需求来选择合适的标记物。
如果想要同时检测多种抗原，就可以选择不同标记物的二抗，这样就能在同一个视野里看到不同颜色的荧光，就像在一个大派对里，不同的人穿着不同颜色的衣服，一眼就能区分出来。
另外呢，二抗的浓度也不能随便定。
浓度太高的话，可能会有非特异性的结合增多，就像人太多挤在一起容易出乱子一样。
浓度太低呢，又可能检测不到信号，就像声音太小听不到一样。
所以要通过预实验来确定一个合适的二抗浓度，这就像是在试衣服，找到最合适的那件。
反正就是说，免疫荧光二抗的选择要综合考虑来源、特异性、标记物还有浓度这些因素，这样才能让我们的实验结果又准确又漂亮呢。
一抗的选择
免疫学实验是一大类生命科学的基础实验，大多数生命科学领域的科研工作者都离不开免疫学实验，上到临床检测中用到的许多分泌蛋白检测以及IHC组织形态观察，下至本科同学们的WB实验课，都属于免疫学实验。
那么，什么是免疫学实验呢？其实，利用抗体和抗原特异性结合的原理，进而设计的检测各种生物指标的实验，都属于免疫学实验的范畴。
决定免疫学成败的最关键因素就是抗体的特异性，正确的选择优质的抗体，可以说你的免疫学实验已经成功了一大半，接下来小编讲给大家分享一下如何选择实验中所需的一抗。
一抗，是直接识别特异性靶抗原的抗体，在免疫学实验中尤其重要，优质的一抗可以提高实验的灵敏度和特异性，防止出现假阳性和假阴性，影响科研判断。
相信大家在搜索一抗时，会发现检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，面对茫茫多的抗体，如何缩小抗体的选择范围并选中合适的抗体，您需要考虑如下因素：1.实验应用的类型首先，要明确您需要做的具体免疫学实验并和抗体支持的实验类型进行匹配，一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB /IHC /ICC /ELISA 分析等，如果抗体说明书没有说明提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证。
如果抗体不适用某些分析试验，会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。
2.样本蛋白的提取或处理某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体只识别天然折叠的蛋白。
如：当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则使用于无需抗原修复解交联步骤的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来。
IHC实验如何选择合适的一抗
IHC实验中如何选择合适的一抗免疫组化耗时长，步骤繁多，为了得到特异性染色，获得可靠结论，选择合适的一抗十分关键。
基本原则是选择在较高稀释度时染色较佳而背景较低、结果稳定、重复再现性良好的抗体。
目前市场上抗体种类繁多、品牌众多、技术参数不一，价格和质量也是相差甚大，如何选择购买合适的抗体，并准确的做出我们想要的实验结果，有以下诸多细节需要考虑。
一、特异性在IHC实验中，抗体的特异性选择需要考虑蛋白特异性和种属特异性。
1、蛋白特异性这里的蛋白是指研究者感兴趣的靶蛋白，首先要比较靶蛋白和抗体的免疫原。
比如抗体的免疫原是重组蛋白，如果不是全长表达，就需要注意其序列是否包含靶蛋白对应的序列；如果免疫原是多肽，也要注意选取的多肽序列或者位置是否在需要检测的组织内抗原有相关对应序列；对于内源性蛋白来说，要清楚其剪切和修饰的方式；磷酸化的蛋白需要确定具体的位点，不同位点磷酸化可能存在不同机制，结合的一抗会不同；家族成员众多的蛋白尤其需要查看交叉反应情况，根据自己的实验需求是选择通用型抗体还是特异型抗体。
2、种属特异性目前商品化的抗体大多采用人源蛋白序列进行重组蛋白表达或设计多肽抗原，在检测非人源组织时需要了解一抗的可反应种属信息，确认存在和其它种属的交叉反应。
有些稀有种属难以找到抗体，可通过蛋白的序列比对，尝试同源序列的一抗并在实验前进行预实验。
二、一抗种属来源的选择在IHC实验中，一抗的种属会影响二抗的选配，因此建议所用一抗和实验样品的种属亲缘性越远越好，不宜同源。
特别是在免疫荧光双标实验中，在在区别抗体与样本种属的基础上，还要注意两个指标的抗体种属来源，通常会选择不同种种属来源的抗体，如果为同种属，两次染色之间需要增加去除抗体的步骤以保证没有交叉。
三、应用的选择建议选择明确标注了适用于IHC检测的抗体，同时厂家提供了验证图片并能清晰显示准确的组织和细胞定位。
如果厂家无验证数据，但是有文献的确切验证，也可以进行尝试。
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• 4.一抗宿主物种的选择
• 一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗 宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可 能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本 内源性免疫球蛋白产生交叉反应，
• 例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一 抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子 （酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。
【Anti-IgG还是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】
在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞 等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择AntiIgG, F（ab’）2 fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部 分与IgG的非特异性结合。 常规的Anti-IgG （H+L）二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即 与IgG的Fc的F（ab’）2片段都能结合； 由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG （H+L） 与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment经过了IgG Fc 片段的吸附，因此只与IgG的F（ab’）2片段结合。
二抗的选择
• 1.一抗的种属来源 二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，
• 2.二抗的种属来源
一般来说，不同的种属来源与二抗的质量 没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来 源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的 差别。
在一些特殊的实验里，如双标实验里，如 果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小 鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和 抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择 山羊或者小鼠来源的。
• 如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化 外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗 体宿主物种的影响不大，如对不含IgG的细胞裂解物样本 的western blotting检测，尽管如此，含有血清的组织裂解 物和组织培养上清中含有免疫球蛋白，还原变性样本中含 IgG，在western blot检测中则结合出现IgG分子 50 and 25 kDa的重链和轻链条带。
用含此片段域 的免疫原制备 出的抗体。
用含该表面蛋 白的胞外域来 免疫制备的抗 体。
• 3.样本的物种
选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与
不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸 序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说 明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体 不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种 尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方 法来预测交叉反应，可应用 Expasy 和 NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同 源性比对。
样本蛋白的结构域 全长蛋白、蛋白片段、多肽、
细菌、细胞
蛋白片断或一种 特殊的同型物或 蛋白全长的某一 区域
用FACS流式检 测活细胞的表面 蛋白
样本的提取和处理过程 某些抗体要求样本经过某些特殊处理，
例如：许多抗体只识别还原和变性的、 表位已暴露不受二级四级结构阻碍的 蛋白样本， 某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。 当选择免疫组化的抗体时，应注意某 些抗体只识别未固定的冷冻的组织， 另一些抗体则适用于无需抗原修复解 交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，
• 3二抗的偶联标记
主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍 生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC、Rhodamine、 Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、 金颗粒。
选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。 对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗； 细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流
ห้องสมุดไป่ตู้ 5.二抗的类别亚型
IgM是体液免疫应答首先产生的Ig。
IgA是机体黏膜防御感染的重要因素。
IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗 体，它仅以单体形式存在。大多抗菌性、 抗毒性和抗病毒抗体属于IgG
IgE是同速发型过敏反应发生有关的Ig。
IgD以膜结合形式存在于B细胞，在B细胞分 化发育中起重调节有作用
一抗、二抗的选择
一抗的选择
• 1.分析实验应用类型 WB（Western Blot 免疫印迹 ） IHC （immunohistochemistry免疫组织化学） ELISA（enzyme-linked immunoadsordent
assay 酶联免疫吸附试验 ）
• 2.样本蛋白的结构性质
• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定 IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度 的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使 一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如 用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体， 必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理， 以除去IgG的干扰。
式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，
免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的 二抗。
如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用 Biotin/Avidin检测系统。
在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记； 金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。
• 4.是否经过血清吸附过的二抗
为减少二抗与样本的非特异性结合，可选择经过 血清吸附过的二抗
如检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克 隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果 对实验的特异性要求很高，选择经过人血清吸附 过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清 吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非 特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最 低。
• 针对某一种属的抗体可能会和其他一些种属有交叉 反应。牛血清白蛋白和奶粉可能含有与抗牛IgG、抗 山羊IgG、抗马IgG、抗绵羊IgG等抗体反应的IgG， 因此如果使用它们作为封闭液或抗体稀释液的成分， 会增加背景染色和降低抗体的效价。