实验二蛋白质的两性反应与等电点测定演示文稿
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。
由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
实验二蛋白质的等电点测定和沉淀反应(精)
现象
解释
5．乙醇引起的变性与沉淀
管号 1 2
3
操作 振荡混匀 加数滴盐酸 振荡混匀 醋酸中和 加数滴盐酸 振荡混匀 碳酸钠中和 加数滴盐酸
现象
解释
思考题
1.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 2.氯化汞为何能做为杀菌剂？ 3.什么是蛋白质的等电点？ 4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生
沉淀 ？
• 本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测 定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸 钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值 的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的 等电点。
• 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成 水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体 颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白 质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变， 蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂 中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白 质与重金属离子或某些有机酸的反应都属 于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液 稳定的条件仍然存在（如电荷），并不 析出。因此变性蛋白质并不一定都表现 为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变 性。
蛋白质的沉淀反应可分为 两类。
可逆的沉淀反应
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变 化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉 淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天 然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析 作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间 作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此 类反应。
不可逆沉淀反应
实验二、蛋白质 等电点测定及沉淀反应
一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
蛋白质的两性反应和等电点测定
蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。
二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。
水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。
因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。
蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。
盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。
但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。
若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。
这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。
蛋白质的等电点测定 ppt课件
（2 ）观察其混浊度。静置 15 分钟后，再观察其混
浊度。结果可用“+、++、+++”表示浑浊度，最混
浊的一管pH即接近酪蛋白的等电点。
ppt课件
9
五、实验结果与分析
实验结果：
Ø 按照实验报告要求计算实验结果。
分析： 通过操作本次实验，探讨影响本实验结果的主要影响因 素。 分析实验成功或失败的主要原因。
ppt课件 5
试剂使用规则
使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原
瓶。
取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干净烧杯中，再用干净吸管吸取标 准液，以免污染瓶中的标准液体。
使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。
2
3
观察溶液颜色和 结合思考 1 ， 沉淀 解释
结合思考 2 ， 解释
4 5
滴加 0.1mol/L 氢氧化钠溶液进行 观察溶液颜色和 中和，直至沉淀出现 沉淀 继续滴加0.1mol/L氢氧化钠溶液 ppt课件
观察溶液颜色和 结合思考 1 ， 沉淀 解释 18
2、测定酪蛋白等电点
（1）取5支试管，按书中表格分别加入各试剂，混匀。
01moll醋酸溶液22试剂?17?ppt课件四实验步骤与结果11观察蛋白质的两性反应步骤操作现象解释结论11取试管11加20滴05酪蛋白溶液和5577滴001溴甲酚绿指示剂混匀观察溶液颜色和沉淀结合思考11解释22缓慢滴加01moll盐酸溶液随滴随摇直至大量沉淀发生观察溶液颜色和沉淀结合思考22解释33继续滴加01moll盐酸溶液观察溶液颜色和沉淀结合思考11解释44滴加01moll氢氧化钠溶液进行中和直至沉淀出现观察溶液颜色和沉淀结合思考22解释55继续滴加01moll氢氧化钠溶液观察溶液颜色和沉淀结合思考11解释?18?ppt课件22观察其混浊度
蛋白质的性质实验(二)——蛋白质的等电点测定和沉淀反应
六、实验思考
何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实用意义？ 详细记录各实验的结果和现象，并解释这些现象。
（2）不可逆的沉淀反应：蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质 常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝 固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应 注意：蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电 荷），并不析出，因此变性的蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀 的蛋白质也未必都已变性 沉淀蛋白质的方法 盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（如硫酸铵，硫酸钠或氯 化钠），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐的浓度不同，析出的蛋 白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在 饱和硫酸铵溶液中析出。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性，当除去盐 后，即可溶解 重金属盐沉淀法：当溶液pH大于蛋白质等电点时，蛋白质颗粒带负电 荷，容易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+或Ag+）结合成不溶性盐而 沉淀。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救 就是因为它能和重金属离子形成不溶性盐，然后再用催吐剂排出体外
某些有机酸沉淀法：某些有机酸指的是三氯乙酸、磺基水杨酸和硝酸 等。当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与酸类的酸 根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀 有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、 乙醇或丙酮），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数，致使蛋 白质颗粒容易凝集而沉淀。此法如果控制在低温下操作并且缩短处理 时间，则可使变性速度减慢 加热变性沉淀法：几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类 促进蛋白质加热凝固，当蛋白质处于等电点时，加热变性凝固最完全 和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性使 蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋 白质处于等电点，也破坏了带电状态。古代人将大豆蛋白质的浓溶液 加热并点入大量盐卤（含MgCl2）制豆腐，便是此方法的成功应用
蛋白质两性性质及等电点的测定
蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。
蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。
蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。
本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。
一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。
这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。
1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。
因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。
2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。
因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。
3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。
此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。
由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。
二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。
测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。
常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。
在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。
可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。
2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。
3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。
蛋白质两性性质及等电点的测定
注意事项
在测定等电点的实验中，要求各种试剂的浓
度和加入量相当准确。
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阳离子两性离子阴离子
pH<pIpH=pIpHpI 电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液 的 pH 使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等， 即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质 溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同 pH 的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情
实验二蛋白质两性反应变性盐析与等电点测定
实验原理
蛋白质的变性：
在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，称为蛋白质的变性。
热变性：由于加热而导致的蛋白质变性。
蛋白质在50℃～60℃以上的溶液中，由于热的作用，多肽链的运动加强，导致次级键的破坏，蛋白质由紧密有序的构象，变成松散无规律的构象。
此时蛋白分子中某些疏水基团外露，失去原有的亲水性，成为溶解度很低的变性蛋白。
凝固：若在等电点情况下加热（或加乙醇），则蛋白质可凝固而沉淀析出；若将蛋白质加热（或加乙醇）后将溶液的pH值调到等电点，变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物析出，称为结絮。
结絮的蛋白质再加热则可凝固。
盐析：溶液的蛋白质胶体分子在高浓度中性盐作用下，蛋白质脱去水化膜并中和所带的电荷，使蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。
特点：沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质性质，若降低盐的浓度蛋白质仍可溶解。
实验步骤
蛋白质变性
取一支干净的试管，加0.5%酪蛋白液10滴，再滴加1滴15%三氯醋酸，混匀，观察结果解释其现象。
取一支干净的试管，加0.5%酪蛋白液10滴，再滴加0.01%溴甲酚绿指示剂3滴，混匀。
再逐滴加入0.02M HCl溶液，边滴加边混匀，至有明显大量的沉淀发生时放入沸水中加热2~3min，继续滴加0.02M HCl溶液，观察实验结果，并解释现象。
盐析
1.另取两支干净的试管，0.5%酪蛋白液各10滴，再滴加饱和硫酸铵溶液各20滴，静置3min，观察结果。
然后向其中的一支试管中滴加蒸馏水边滴加边混匀，滴加20滴，观察现象。
两支试管进行对照，解释其现象。
实验二蛋白质等电点及含量测定
n 牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7-4.8。本实验采用蛋白质 在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大 时的pH值即为该种蛋白质的等电点值。
实验二蛋白质等电点及含量测定
【实验目的】
学习蛋白质的两性解离性质，掌握pH值法测定蛋 白质等电点的一般原理和操作方法。
学习和掌握双缩脲法测定蛋白质浓等电点的测定
【实验原理】——pH值沉淀法测定蛋白质等电点
n 蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡：
4
【实验原理】——pH值沉淀法测定蛋白质等电点
下各管吸光度。 Ø 以每管蛋白质含量为横坐标，对应吸光度为纵坐标，
作吸光度-蛋白质含量标准曲线。（见电脑桌面Excel 表格“标准曲线绘制”）
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【操作步骤】——双缩脲法测定蛋白质含量
n 2.蛋白质样品测定 （每小组做1份）
1.另取2支试管，分别加1 mL未知浓度的酪蛋白蛋白质样 品液（注意样品浓度不要超过10 mg/mL），加1 mL蒸 馏水，加4 mL双缩脲试剂，混匀，室温放置30 min。
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【仪器试剂耗材】——双缩脲法测定蛋白质含量
实验仪器 ➢ 6支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪 （200uL）、枪头（200uL）、可见光分光光度计等。 （绘制标准曲线） ➢ 2支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪 （200uL）、枪头（200uL）、可见光分光光度计等。 （样品测定）
n 测定样品管吸光度时，其吸光值应界于标准曲线范围 内，如超出，应适当稀释样品后再测。
蛋白质的性质实验(2)
蛋白质的性质实验（ 蛋白质的性质实验（2） —蛋白质等电点的测定和沉淀反应 蛋白质等电点的测定和沉淀反应
一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质。 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
蛋白质的变性
变性蛋白质通常都是固体状态物质， 变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水 和其它溶剂， 和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有 的性质。所以， 的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不 可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、 可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、 激烈的搅拌以及强酸和强碱等。 激烈的搅拌以及强酸和强碱等。
二、 实验原理
蛋白质的两性解离性质 蛋白质等电点的概念 测蛋白质溶解度最低时的溶液pH值为其 等电点 稳定蛋白质亲水胶体颗粒的因素 蛋白质沉淀反应的类型
蛋白质的两性电离性质
蛋白质是由AA组成的高分子化合物，具有许 AA 多游离的氨基、羧基、咪唑基、胍基、巯基、 酚基等，因此与AA一样，能象酸一样解离， 也能象碱一样解离，也是两性电解质。
三、实验操作
具体参见实验指导书
蛋白质的盐析 重金属离子沉淀蛋白质 某些有机酸沉淀蛋白质 有机溶剂沉淀蛋白质 乙醇引起的变性与沉淀
四、 结果处理
用－、+、++、+++等符号表示各管的 混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。 最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。五、 Nhomakorabea注意事项
缓冲液的pH值必须准确。
蛋白质的两性解离性质
蛋白质的等电点
当溶液在某一 pH 值时，蛋白质所带正、负电荷相 等，即总净电荷为零，此时溶液的 pH 称该蛋白质 的等电点(isoelectric point)。
蛋白质等电点的测定ppt课件
实验器材与试剂：
器材： • 水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容
量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵 试剂： (1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00摩尔／升醋酸溶液 (3)0.10摩尔／升醋酸溶液 同样规格的试营4支，按下表颠序分别精 确地加入各试剂，然后混匀。
4
最常用的方法是：
①测其溶解度最低时的溶液pH值。 ②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH ③浊度、分光光度法 ④基于蛋白质与离子交换的作用
5
一、测定溶解度最低时的溶液PH
实验原理： 借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定
酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠 混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值 的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白 的等电点。
15
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端 的距离。
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二、等电聚焦电泳
原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而 又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连 续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能 造成介质pH由酸到碱逐步变化。
10
2)各种蛋白质pI不同
3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI 形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH 梯度
58-实验二蛋白质的两性反应和等电点测定
实验二 蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的（1）了解蛋白质的两性解离性质。
（2）学习测定蛋白质等电点的一种方滕。
二、实验原理蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在电离平衡。
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗纒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有其特异的等电点。
在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易溉淀析出。
可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方滕是测其溶解度最低时的pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲液中加入酪蛋白后，溉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
三、实验材料、器材与试剂1、材料酪蛋白。
2、器材（1）渴浴锅；（2）温度计；（3）200mL锥形瓶；（4）100ｍＬ容量瓶；（５）吸管；（６）试管及试管架；（7）乳钵；（8）记号笔。
3、试剂（1）0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200mL取0.4g酪蛋白，加入帑量渴在乳钵中仔细研磨，帆所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用帑量40～50℃的温渴洗涤乳钵，帆洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10mL1mol/L醋酸钠溶液。
把锥形瓶内的溶液全部移至100mL容量瓶内，加渴至刻度，塞紧玻璃塞，混匀。
（2）1.00mol/L醋酸溶液；（3）0.10mol/L醋酸溶液；（4）0.01mol/L醋酸溶液；（5）0.5%酪蛋白溶液（以0.01mol/L NaOH作溶剂）；（6）0.01%溴甲酚绿指示剂；（7）0.02mol/L渢渧化钠溶液；（8）0.02mol/L盐酸溶液。
四、操作方滕1、蛋白质的两性反应（1）取一支试管，加入0. 5%酪蛋白溶液20滴和0. 01%溴甲酚绿指示剂5~7滴，混匀。
试验二蛋白质的两性性质及等电点的测定
实验二蛋白质的两性性质及等电点的测定一、实验目的（1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。
（2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
二、实验原理蛋白质是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除N端α-氨基与C端α-羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如Glu、Asp的羧基、Lys 的ε-氨基，Arg的胍基，Tyr、Thr、Ser的羟基，Cys的巯基，His的咪唑基，Asn、Gln的酰胺基等，它们都能解离为带电基团。
因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：H2N-P-COO-=H3+N-P-COO-= H3+N-P-COOH阴离子两性离子阳离子pH>pI pH=pI pH<pI电场中移向阳极不移动移向阴极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离和碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点（pI）。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的浑浊度最大。
配置不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可大致确定蛋白质的等电点。
在pH梯度电泳中，蛋白质泳动到其相应的等电点时则停止泳动，据此可分离等电点不同的蛋白质。
三、仪器、试剂和材料1、仪器（1）试管架，试管：15ml 8支；（2）移液管：1ml 4支，2ml 4支，10ml 2支；（3）胶头滴管2支。
2、试剂（1）1 mol/L 乙酸：吸取99.5%乙酸(相对密度1.05)2.875 ml，加水至 50 mL；（2）0.1 mol/L乙酸：吸取1 mol/L乙酸 5ml，加水至50mL；（3）0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5mol,加水至50mL；（4）0.2mol/L N a OH：称取N a OH 2.000g，加水至50mL，配成 1mol/L N a OH，然后量取1 mol/L N a OH 10 mL，加水至50 mL，配成0.2mol/L N a OH；（5）0.2mol/L盐酸：吸取37.2%（相对密度1.19）盐酸4.17mL；加水至50mL ，配成1mol/L盐酸，然后吸取 1mol/L 盐酸10 mL，加水至50mL，配成0.2 mol/L盐酸；（6）0.01%溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g，加0.29mL 1mol/L N a OH,然后加水至50mL；（7）0.4%酪蛋白乙酸钠溶液：称取0.4g酪蛋白，加少量水在研钵中仔细地研磨，将所得的胶悬液移入200mL的锥形瓶内，用少量40-50℃的温水洗涤研钵，将洗涤液也移入锥形瓶中内。
蛋白质的两性电离及等电点测定实验
蛋白质的两性电离及等电点测定实验
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【教学目标】
➢ 1、独立操作，一丝不苟地作试验。 ➢ 2、仔细观察不一样阶段试剂颜色改变及沉淀出现
和消失，经过现象观察能分析蛋白质两性电离性 质，正确填写试验汇报。 ➢ 3、经过往五支不一样pH值溶液试管内加入酪蛋 白，观察沉淀出现情况，确定其等电点。 ➢ 4、共同讨论测定等电点原理。
蛋白质的两性电离及等电点测定实验
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蛋白质的两性电离及等电点测定实验
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一、蛋白质两性电离 多肽链中氨基酸残基中有可解离基团，
如：末端-COO-、-NH3+，酸性氨基酸侧 链- COO- ，Lysε-NH3+，Arg胍基，His 咪唑基。
*蛋白质等电点(pI) 当蛋白质溶液处于兼性离子，净电荷为 零，此时溶液pH称为蛋白质等电点。
滴入NaOH溶液
继续滴入NaOH溶液 至沉淀溶解
试验结果
蛋白质的两性电离及等电点测定实验
简明分析
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2、酪蛋白等电点测定
（1）取5支试管，编号后按下表次序准确地加入各 种试剂，．然后混合均匀(每管加入酪蛋白醋酸钠 溶液后，须马上摇匀该管)。
蛋白质的两性电离及等电点测定实验
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试剂(ml)及管号
（1）取一支试管，加入0.5％酪蛋白醋酸钠溶液20滴和 0.01％溴甲酚绿指示剂2滴，摇匀。观察溶液颜色，统计， 并分析原因。
（2）用细滴管迟缓加入0.02mol/L盐酸溶液，、边滴边摇， 直至有显著大量沉淀发生，此时溶液pH值靠近酪蛋白等 电点。观察溶液颜色改变，统计，分析原因。
（3）继续滴入0.02mol／L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色 改变，统计，分析原因。
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结论 2：
4号试管沉淀量最多
说明4号管溶液的pH值为酪蛋
白的等电点，即pI=4.7
思考题
什么是蛋白质的等电点？
在等电点时，蛋白质溶液为什 么容易发生沉淀？
➢ 溶液由黄色变成浅绿色 （3.8﹤pH﹤5.4）
➢ 继续加碱，[OH-]继续 增大，pH﹥pI。酪蛋白 所带负电荷不断增加，同 电相斥，沉淀溶解
➢ 沉淀完全溶解时，溶 液显蓝色(pH﹥5.4)
结论 1：
蛋白质是两性电解质 pH= pI时，蛋白质溶解度最小 酪蛋白的等电点在pH3.8-5.4之间
酪蛋白等电点的测定
➢ 取7支同样规格的干燥试管，精确加入各试剂
试管号码 1 2 3 4 5 6 7
蒸馏水 2.4 3.2 — 3.0 1.5 2.7 3.3 58
1.00M醋 1.6 0.8 — — — — — 酸
0.1M醋酸 — — 4.0 1.0 — — —
0.01M醋 — — — — 2.5 1.2 0.6
➢ 出现最大量沉淀时,说 明到达了酪蛋白的等电点
➢ 溶液由蓝色变成浅绿色 （3.8﹤pH﹤5.4）
➢ 继续加酸，[H+]继续增 大，pH＜pI。酪蛋白所 带正电荷不断增加，同电 相斥，沉淀溶解
➢ 沉淀完全溶解时，溶 液显黄色(pH﹤3.8)
蛋白质的两性反应(3)
➢ [OH-] ，沉淀
➢ 出现最大量沉淀时,说 明到达了酪蛋白的等电点
注酸：单位均为mL
52
➢ 向每个试管中各加0.5%酪蛋白溶液20滴， 加一管，立即混匀一管
➢ 静置30分钟后，以0、+、++、+++、 ++++表示各管的混浊度，并指出哪一种 pH是酪蛋白的等电点
实验结果
酪蛋白等电点的测定
1 2345
67
1
2
3
4
567
沉淀量 0 + +++ ++++ ++ 0 0
1.00M醋酸溶液
实验步骤
蛋白质的两性反应（1）
取一干净试管
酪蛋白液10滴
观察溶液颜色 并解释现象
溴甲酚绿指示剂3滴
蛋白质的两性反应（2）
滴加0.02M HCL溶液
边滴加边混匀
有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化
继续滴加0.02M HCL溶液
边滴加边混匀
至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象
蛋白质的两性反应（3）
实验二蛋白质的两性反应与等电点测定演示文稿
实验目的
了解蛋白质的两性解离性质 掌握测定蛋白质等电点的方法
实验原理
COOH P NH2
COOH +OH-
COO-
P NH3+ +H+ P NH3+
+OH-
P
+H+
COONH2
pH<pI
阳离子
pH=pI
兼性离子
pH>pI
阴离子
维持蛋白质胶体稳定的因素： 表面电荷、水化膜
在等电点时蛋白质颗粒上的净电
荷为零，缺乏同电相斥的因素，蛋 白质溶解度最小，最容易析出沉淀
本实验配制了各种不同pH值的
缓冲液，沉淀出现最多的缓冲液 pH值即为酪蛋白的等电点
实验器材与试剂
➢ 大试管、滴管、刻度吸量管 ➢ 0.5％酪蛋白醋酸钠溶液 ➢ 0.01％溴甲酚绿指示剂(指示范围: pH3.8-5.4) ➢ 0.02M HCL溶液、 0.02M NaOH溶液 ➢ 0.01M醋酸溶液、0.10M醋酸溶液、
继续滴加0.02M NaOH溶液
边滴加边混匀
有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化
继续滴加0.02M NaOH溶液
边滴加边混匀
至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象
实验结果
蛋白质的两性反应(1)
➢ 溶液呈蓝色
➢ 酪蛋白质的两性反应(2)
➢ [H+] ，沉淀