1-细胞生物学实验技术

印莉萍, 祁小廷主编.《细胞分子生物学技术教 程》. 科学出版社. 2001年出版.
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第一章
显微镜技术

普通显微镜的构造及使用方法
相差显微镜的构造及使用方法
荧光显微镜的构造及使用方法 激光扫描共聚焦显微镜的构造 及使用方法

透射电子显微镜与超薄切片技
术

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立的像。
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B’’
15 A’’
二、仪器构造
• 机械部分 镜座

• 镜柱 • 镜臂
照明部分
镜筒 • 光学部分
• 物镜转换器 • 镜台 • 调节器
粗准焦螺旋
细准焦螺旋
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机械部分
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• 反光镜
• 聚光器 • 光圈
照明部分
• 目镜
光学部分
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• 物镜
三、实验用品
（1）材料：体外培养细胞； （2）设备：相差显微镜。
四、实验操作
1、倒置相差显微镜的使用方法： (1)打开开关，将标本置于载物台上； (2)转动环状光阑转盘，使普通光阑进入光路，并将光圈开到
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表1-1 不同倍数物镜的比较
镜头 低倍镜 高倍镜 油镜 放大倍数 10× 40× 100× 镜身 短 较长 长 数值孔径 0.3 0.5 1.3 工作距离/mm 7 0.5 0.2
不同放大倍数物镜 的工作距离
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三、实验用品
（1）材料：
•
“a”字片、
•
• • •
红绿羊毛交叉片
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第一节 普通显微镜Leabharlann Baidu的构造及使用方法
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一、原理与应用
显微镜的主要部分是物镜和目镜，
F2
为两组焦距较短的凸透镜。
物镜的焦距（F1）短，目镜的焦距（F2） 略长。物体AB位于物镜的2倍焦距和1倍焦距 之间，所以在物镜的像方形成一个倒立的放大 的实像A’B’；A’B’位于目镜的1倍焦距以内， 经目镜放大为虚像A’’B’’，A’’B’’位于人眼的明 视距离内。A’’B’’的视角比眼睛直接看AB时视 角大得多，所以用显微镜可以看清微小的东西， 但人眼通过目镜所看到的是被放大了2次的倒 A B F1 B’ A’
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二、仪器构造
1
在普通显微镜上增加下列四种附
件就成为相差显微镜：


环状光阑
2
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相差物镜
3 4


绿色滤光片
合轴调整望远镜
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相差显微镜光路图示 1-目镜；2-物镜；3-标本片 4-聚光器；5-相板；6-环状光阑
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• 环状光阑
环状光阑位于光源与聚光器之间，是环状孔形成的光阑，它们的直 径和孔宽与不同物镜相匹配。大小不同的环状光阑成一转盘。更换放大 率不同的物镜时，要同时更换相应的环状光阑。其作用是使照明光线从 环状的透明区进入聚光镜，再斜射到标本上。
4、更换标本片时，使镜台与镜头远离，方可取下标本片； 5、观察部位要对准通光孔中央，不能放反； 6、转换物镜时应转动转换器，勿手持物镜移动； 7、用完后使镜头离开通光孔，下降载物台，竖立反光镜，下降聚光器，
关闭光圈，玻片移动器回位，放回镜柜内；
8、保持清洁，勿口吹、手抹或用布擦光学和照明部分。
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功能及生命活动。
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细胞生物学发展简史：

三个层次：
分子水平
超微水平 显微水平
脱氧核苷酸结构模型
骨骼肌超微结构 洋葱表皮细胞显微结构
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四个阶段：
第一阶段
从16世纪后期到19世纪30年代，是细胞发现和细胞知识的积累阶段。
通过对大量动植物的观察，人们逐渐意识到不同的生物都是由形形色色
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（1）目镜

通常备有2~3个，上面刻有5×、10×或15×符号 ，表示放大倍数，一般用10×目镜。
（2）物镜

一般有3~4个，上面标有放大倍数和数值孔径（镜 口率），如10/0.25、40/0.65和100/1.3；镜筒长度 和所要求的盖玻片厚度，如160（mm）/0.17（ mm）。
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• 相差物镜(镜头上标有PC或PH字样)
物镜的后焦平面上装有相板，相板上和环状光阑相对应的环状部分 大多数涂有吸收膜和推迟相位膜，其他部分完全透明。从标本上射过来 的光线，绕射光部分穿过透明区；直射光则穿过相板的环状部分，一般 所用的相板推迟相位1/4波长，吸收80%的直射光，使直射光和绕射光的 强度接近，明暗反差增大。由于透明标本内部构造的折射率不同，产生 绕射光的相位有不同程度的推迟，绕射光和直射光的干涉作用将相位差 变成振幅差。
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前
细胞生物学

言
英文名称：cell biology 定义：从细胞整体、显微、亚显微 和分子等各级水平上研究细胞结构、
功能及生命活动规律的学科。

发展：细胞生物学由Cytology发展而来，它是关于细胞结 构与功能(特别是染色体)的研究。现代细胞生物学从显微 水平，超微水平和分子水平等不同层次研究细胞的结构、
激光扫描共聚焦显微镜
显微镜：
• 可对观察样品进行断层扫描和成像； • 可无损伤地观察和分析细胞三维空间结构； • 可进行活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记 和离子荧光标记的观察。
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电子
用高速电子束代替光束，放大倍数达80
• 把经加速和聚集的电子束投射到非常 万倍，分辨率最小极限达0.1~0.2nm。
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第三阶段 从20世纪30年代到70年代，电子显微镜技术出现后，把细胞学带入
了第三大发展时期，这短短40年间不仅发现了细胞的各类超微结构，而
且也认识了细胞膜、线粒体、叶绿体等不同结构的功能，使细胞学发展 为细胞生物学。De Robertis等人1924年出版的《普通细胞学》 （General Cytology）在1965年第四版的时候定名为《细胞生物学》 （Cell Biology），这是最早的细胞生物学教材之一。
细胞凋亡示意图
细胞分化示意图
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细胞生物学学科的发展，
正是基于新的研究技术方 法的建立。技术方法与科 研思路是学科发展的双翼， 二者缺一不可。
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《细胞生物学实验技术》学习内容


显微镜技术
细胞结构与成分的显示技术 细胞周期分析 细胞成分的分离与分析 细胞工程基础技术 细胞凋亡的测定 染色体技术
线粒体超微结构
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线粒体结构示意图
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第四阶段
从20世纪70年代基因重组技术的出现到当前，细胞生物学与分子生 物学的结合愈来愈紧密，研究细胞的分子结构及其在生命活动中的作用 成为主要任务，基因调控、信号转导、肿瘤生物学、细胞分化和凋亡是 当代的研究热点。
细胞信号转导途径
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人血涂片 双层油镜瓶 擦镜纸
（2）设备：普通光学显微镜
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四、实验操作
1、低倍镜子的使用方法：
•
取镜和放置
•
• •
对光
放置标本片 调节焦距
看不到物象的可能原因： • 物镜未对正通光孔，对正后再观察；
• 标本未放到视野内，移动标本至通 光孔中央； • 调节器转动太快，超过焦点，应重 新调焦； • 视野内光线太强，不易观察到未染 色的标本片，将光线调暗再观察。
细胞生理生化研究
细胞培养和分析 细胞膜技术


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分子细胞生物学技术
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《细胞生物学实验技术》参考书目

章静波, 黄东阳, 方瑾主编.《细胞生物学实验技 术》. 化学工业出版社. 2006年出版.

李芬主编.《细胞生物学实验技术》. 科学出版社.
2007年出版.

透射电子显微镜
显微镜：
薄的样品上，电子与样品中的原子碰 撞而改变方向，形成明暗不同的影像。 • 对样品密度、厚度有要求，需要 50~100nm超薄切片。
扫描电子显微镜 • 用聚焦电子束在样品表面逐点扫描成 像，可研究物质微观结构（纳米级）。 放大倍数可达10~1000000倍，常用于 获取细胞或组织表面的立体成像。
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• 绿色滤光片
在环状光阑下面置绿色滤光片于光路中，它可吸收红色和蓝色光，
使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得 良好的效果。一般选用中心波长546nm的绿色滤光镜，滤光镜插入后对比 度就提高。
• 合轴调整望远镜
为使环状光阑的中心与物镜的光轴完全在一直线上，必须拔出目镜， 装上特别的低倍望远镜，使相板的暗环与环状光阑的明环重合对齐，才 能发挥相差显微镜的效能。 倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒， 物镜安装在载物台的下方，光源及聚光器安装在载物台的上方。倒置相 差显微镜用于观察培养瓶或培养板中的活细胞的细微结构，由于工作距 离的限制，最大放大率为60×，一般研究用倒置相差显微镜配置有4×、 10×、20×及40×相差物镜。 。 2013-11-21 29
六、实验结果及分析
1、低倍镜观察“a”字片呈倒立的物像，且玻片的移动方向与视野内物像移动的 方向相反。 2、高倍镜观察红绿羊毛交叉片，先在低倍镜下找到羊毛，并将红绿羊毛的交叉 点移到视野的中心，然后换高倍镜观察。转动细调节器下降镜台时红色羊毛清 晰，表明红色羊毛位于交叉点上方；上升镜台时，绿色羊毛清晰，表明绿色羊 毛在交叉点的下方。 3、低倍镜、高倍镜、油镜观察人血细胞涂片时，观察范围依次变小，放大倍数、 分辨率依次提高。血细胞包括红细胞、白细胞和血小板。其中白细胞主要包括 淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。红细胞为双凹扁盘状,无细胞核，橘红色。白细 胞形态不一，细胞核紫色；其中淋巴细胞细胞核大而圆，周围边缘为浅蓝色细
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2、高倍镜的使用方法：
•
•
选好目标
转换高倍物镜
•
调节焦距
3、油镜的使用方法：
• • •
选好目标 转换油镜 调节光亮
• •
调焦 擦净油镜头和标本片
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五、注意事项
1、轻拿轻放，一手握镜臂一手托镜座； 2、显微镜放稳，镜筒倾斜角度不超过45°；
3、升镜台、降镜筒、转换物镜时，切勿边操作边观察；
扫描电子显微镜与样品制备
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显微镜分类：普通光学显微镜
光学
• 分辨率达微米，用于观察组织的显微结构及细 胞形态、数量、生长状态等。 相差显微镜 极限为0.2μm。 • 用于观察活细胞的细微结构。 荧光显微镜
可把物体放大1500倍，分辨的最小
显微镜：
电子
• 对能发射荧光的物质进行定性和定量分析。
胞质；单核细胞，核为马蹄形或肾形，细胞质比例较大浅蓝色；粒细胞核成为
叶状，细胞质中具有大小不等的颗粒。血小板为紫红小片状，常多个聚在一起。
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第二节 相差显微镜 的构造及使用方法
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一、原理与应用
光波有振幅(亮度)、波长(颜色)及相位(指在某一时间上光的波动所能达到
的细胞构成的。
Robert Hooke （1636～1702）， 1665年，他在《显 微图谱》中第一次 使用“细胞”一词。
Hooke使用的显微镜
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Hooke观察到的软木结构
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第二阶段 从19世纪30年代到20世纪初期，细胞学说形成后，开始了在显微水 平研究细胞的结构与功能。形态学、胚胎学和染色体知识的积累，使人 们认识了细胞在生命活动中的重要作用。 • 1893年Hertwig的专著《细胞与组织》（Die Zelle und die Gewebe） 出版，标志着细胞学的诞生。 • 1896年哥伦比亚大学Wilson编著的《细胞发育与遗传》（The Cell in Development and Heredity）、1920年墨尔本大学Agar编著的《细胞 学》（Cytology ）都是这一领域最早的教科书。
的位置的不同。光波通过物体时波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到， 这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。
活细胞和未经染色的生物标本，波长和振幅并不发生变化，因细胞各部分
细微结构的折射率和厚度略有不同，光线透过标本后发生折射，偏离了原来的 光路，光波的相位发生变化(相应发生的差异即相差)，而这种微小的变化，人 眼无法鉴别，故在普通显微镜下难以观察到。 相差显微镜就是将经过透明物体的直射光延迟或提前1/4波长，并和绕射光 产生干涉，相位差变为振幅差。如果产生的干涉为相长干涉，则振幅的同相量 相加而变大，即可看到较亮的部分；如果产生的干涉为相消干涉，则振幅异相 量相消而变小，这部分就变得较暗。变相位差为振幅差的结果，使原来透明的 物体表现出明显的明暗差异，对比度增加，可清晰观察活细胞的细微结构。