western blotting(蛋白免疫印迹)
蛋白质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）
蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。
它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或⽣物组织样品进⾏着⾊。
通过分析着⾊的位置和着⾊深度获得特定蛋⽩质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋⽩免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋⽩质从凝胶转移到固相⽀持物NC膜或PVDF膜上，然后⽤特异性抗体检测某特定抗原的⼀种蛋⽩质检测技术，现已⼴泛应⽤于基因在蛋⽩⽔平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个⽅⾯。
⼀提起Western blot，⼤家会不禁联想到Southern blot和Northern blot。
其实它们的名字也是个有趣的故事。
1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。
之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授⼜发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。
George Stark这位⽜⼈教授在两年后⼜开发出类似的蛋⽩质检测⽅法。
1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。
为什么当时没叫Eastern blot呢？这⽆从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。
30年来， Western blot技术已成为蛋⽩质研究中最常⽤的⼯具。
它的标准流程如下：蛋⽩质⾸先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相⽀持物上，固相⽀持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。
⾸先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的⾮特异性吸附，这样固定的蛋⽩质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作⽤。
最后通过放射、⽣⾊或化学发光的⽅法进⾏定位。
Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。
蛋白免疫印迹法
蛋白免疫印迹法
蛋白免疫印迹（Western Blotting）是一项强大的技术，可让您方便地检测蛋白，估算表达量和分子量。
样品起始于细胞或组织中提取的蛋白混合物。
完整的蛋白免疫印迹实验流程包括数个单独的步骤，每个步骤对于最终数据质量都至关重要。
本学习中心为您提供从样品制备到最终印迹分析过程中的每个实验步骤理论及相关深入信息。
•含有目标蛋白的细胞必须完全裂解，确保充分的的蛋
白释放，同时去除非蛋白成分。
良好的样品制备确保目
标蛋白完好的进行下游分析。
•电泳分离样品中的蛋白质，并可用于估算蛋白的分子
量。
•电泳分离后的蛋白从凝胶转移到印迹膜上并固定化。
有效的蛋白质转移可提升实验灵敏度。
•漂亮干净的印迹结果高度依赖于抗体的特异性和灵敏
度。
除了检测目标蛋白，还可以使用总蛋白染色剂进行
总蛋白内参归一化，Stain-Free 免染方法无需染色和脱色。
•印迹膜的准确成像对于获取条带亮度并用于下游分析
至关重要。
了解成像基本概念，如灵敏度、分辨率和背
景噪音，可以帮助您最大程度地提高图像数据质量。
•印迹膜图像含有丰富信息。
某些实验仅需定性，确认蛋白是否表达；而有些实验则需要定量，经过适当设计获得样品间蛋白表达的相对变化。
蛋白免疫印迹的原理
蛋白免疫印迹的原理
蛋白免疫印迹（western blotting）是一种常用的生物化学实验
技术，用于检测和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达水平和特异性。
其原理基于蛋白质的电泳分离、膜转移和特异性抗体结合。
首先，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将待测蛋白样
品按照分子量大小进行分离。
然后，将分离出的蛋白质在电泳胶上通过膜转移（blotting）的方式转移到固相材料（通常是
聚乙烯二醇涂层的聚丙烯酰胺膜或硝酸纤维素膜）上。
转移完成后，膜上的蛋白质被非特异性蛋白质结合，为了防止进一步非特异性结合，可以使用一种无效蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或非脂母细胞肿瘤中抗原（NFSA）来封闭非特
异结合位点。
紧接着，膜上的蛋白质与针对特定蛋白的抗体发生特异性结合。
这些抗体可以是直接标记的（如荧光染料或酶联物质），或者是需要进一步与辅助抗体结合才能被检测到。
特异性抗体与膜上蛋白质结合后，通过洗涤步骤去除非特异性抗体。
最后，通过添加染色剂（如酶底物）或者使用荧光扫描仪，可以可视化结合在膜上的抗体。
蛋白免疫印迹的结果可以用于定量分析蛋白质的表达水平、鉴定特定蛋白的存在以及研究蛋白质的功能和相互作用。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
蛋白质印迹(Western blotting)
蛋白质印迹(Western blotting)一、实验目的：免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面，学生掌握与免疫印迹相关的原理和方法，如电泳技术，转膜技术等。
二、实验原理：蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。
蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，强度比较差，需要从胶上转移到硝酸纤维素膜上。
2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。
3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。
4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。
5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。
三、试剂与器材：试剂:(1)人IgG免疫兔的抗血清；(2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG；(3)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2P04 O．24 g，Na2HP04·12H20 2.9 g，加蒸馏水至1000 ml，pH值为7.4；(4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.05 9／6 Tween-20；(5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)；(6)底物溶液：A液：溶解30 mg CN在5 ml甲醇中；B液：溶解10 mg DAB在5 ml甲醇中；C液：分别搅拌A液和B液10～15 rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50 ml，分成10 ml 一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；D液：取10 ml C液，运用时加10 ml 30％(体积分数)H202；(7)转移缓冲液：0.025 mol／L Tris，O．192 mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。
蛋白免疫印迹杂交(WesternBlot)技术手册
蛋白免疫印迹杂交〔Western Blot〕技术手册A蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting 的第一步，更是打算WB 成败的关键步骤，总体原则和留意事项：1：尽可能提取完全或降低样本简洁度只集中于提取目的蛋白〔通过承受不同提取方法或选择不同的试剂盒产品〕2：保持蛋白的处于溶解状态〔通过裂解液的PH 盐浓度外表活性剂、复原剂等的选择〕3：提取过程防止蛋白降解、聚拢、沉淀、修饰等，〔低温操作，参与适宜的蛋白酶和磷酸酶抑制剂〕4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子〔通过参与核酸酶或实行不同提取策略〕5：样品分装，长期于-80℃中保存，避开反复冻融。
A-1细胞或组织裂解A-1-1细胞裂解裂解液Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推举裂解液Lysis buffe 推举试剂盒全细胞NP-40 or RIPA〔附录1〕全蛋白抽提试剂盒细胞质〔可溶蛋白〕Tris-HCl〔附录1〕胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质〔细胞骨架等不溶蛋白〕Tris-Triton〔附录1〕蛋白分级抽提试剂盒细胞质〔磷酸化蛋白〕磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA〔附录1〕膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA〔附录1〕核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA〔附录1〕线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1培育的细胞经预冷的PBS 漂洗2 次，裂解液中参与蛋白酶和磷酸酶抑制剂〔种类与量见本节2〕2吸净PBS，参与预冷的裂解液，〔(1 ml per 107cells/100mm dish/150cm2flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2flask).3用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温存地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30 min54℃离心12,000 rpm，20 min〔根椐细胞种类不同调整离心力〕6轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2组织裂解1 用灭菌的预冷的工具分别目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，参与液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3每约5 mg 参与约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，〔最终的蛋白浓度至少到达0.1 mg/ml, 抱负的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).44℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂推举购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL。
蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )
蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB ）标签：western-blot免疫印迹 蛋白质蛋白质免疫印迹可应用于：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒裂解液 PBS SDS上样缓冲液 电泳缓冲液 转移缓冲液 丽春红染液 TBST TBS 洗脱抗体缓冲液 抗体仪器、耗材电泳仪移液器脱色摇床显影仪实验方法原理Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。
蛋白质印迹技术
蛋白质印迹技术蛋白质印迹（Western blotting）是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学办法，又称免疫印迹（immunoblotting )。
1979年，Towbin等将分析DNA的Southern blotting技术扩展到蛋白质的讨论领域，并且和特异、敏捷的免疫分析技术相结合，称之为“Western blotting"（蛋白质印迹）。
免疫印迹可分为两个步骤：将蛋白质由凝胶转移至固相基质上；特异性抗体检测。
试验原理蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分别为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白），将凝胶上的蛋白质以电转印的方式，转印至固相支持物（如硝酸纤维素膜，NC膜）上，再用特异抗体作为探针对靶蛋白举行检测的办法。
因为该办法结合了PAGE的高辨别率和固相免疫反应的高特异性等多种优点，可检测到低至1-5 ng的中等分子量大小的靶蛋白。
仪器和材料电转移装置（电源）；摇床；暗匣；转印夹；浅盘（30cm×15cm×3cm)；玻璃棒；杂交袋或杂交盒；胶片；保鲜膜；滤纸；0. 22μm孔径的硝酸纤维素膜。
试剂 (1) Running Buffer (Tris-甘氨酸电泳缓冲液，1×2500ml) ; 25 mmol/L Tris 7. 55g 250mmol/L甘氨酸 47. 0g 10%SDS 25m1 (2) Transfer Buffer ( Tris-甘氨酸电转膜缓冲液，1× 2500m1，pH＝8.3）：48 mmol/L Tris 14. 50g 39mmol/L 甘氨酸 7. 25g 10% SDS 9. 25ml 20％甲醇 500m1 (3) TTBS缓冲液（pH 7.5，2 ×2500ml)： 20 mmol/L Tris 12. l l g 0. 5 M NaCl 146. 1 g 0.05%Tween 20 2. 5 ml (4) Stripping Buffer（pH2. 0，1000m1)：甘氨酸 1. 8768 SDS 10. 0g (5) 10％牛奶封闭液：称取10. 0g脱脂奶粉，溶于80m1 TTBS（pH7.5 )中，搅拌彻低溶解，后加入TTBS定容至100m1，再加入10μl Thimerosal混匀。
蛋白质印迹法
蛋白质印迹法蛋白质印迹法（ProteinBlotting）是一种用于检测、调控和鉴定蛋白质水平的技术，通常也被称为蛋白质免疫印迹（Immunoblotting）、西方印迹（Western Blotting）或免疫印迹（Immunoblotting）。
它能够快速、准确、重复地测定一个新蛋白质或大量存在的蛋白质，令科学家们能够衡量蛋白质的含量以及细胞蛋白质的变化。
蛋白质印迹法包含用于分离和检测特定蛋白的一系列的步骤。
首先，蛋白质被用碱性和硫酸性溶剂分离出来，然后用紫外线伤害法进行转换，最后通过免疫印迹法测定所需的蛋白质的含量。
蛋白质印迹法的第一步是将细胞蛋白质提取出来，用特定溶剂获得有机液体，其中包含有蛋白质、糖、脂肪酸以及一些其它物质。
用碱性或硫酸性溶液将细胞蛋白质沉淀出来，然后用紫外线伤害法进行转换，将沉淀的蛋白质释放出来，使其可以测定。
接下来的步骤是用免疫印迹法测量特定蛋白质的含量。
这项技术使用对蛋白质特异性的特殊抗体，与待检测蛋白质发生作用，最后将抗体与特定蛋白质结合在一起，使得它们在一个总称为“印迹”的图像上形成可见的标记。
通过观察抗体把特定蛋白质印在“印迹”上时形成的标记，就可以测定检测蛋白质的含量。
蛋白质印迹法在研究蛋白质分子生物学、微生物学、免疫学等各个领域中都发挥着重要作用，在癌症检测中也发挥着重要作用。
通过蛋白质印迹法，研究人员可以快速、准确地测量和监测肿瘤相关的蛋白质，从而有助于癌症的早期发现，从而使得治疗更加有效。
另外，蛋白质印迹法还可以用于研究各种亚细胞定位的蛋白质，有助于科学家们更好地理解蛋白质的功能。
蛋白质印迹法在细胞生物学的研究中也有着重要的应用，它可以帮助科学家们快速、准确地测定细胞里某种蛋白质的含量，从而更好地理解细胞的结构和功能。
总的来说，蛋白质印迹法不仅是一种快速、准确的技术，而且是一种重要的技术，有助于科学家们更好地检测、调控以及鉴定蛋白质水平。
随着科学技术的发展，蛋白质印迹法在治疗和疾病诊断方面也会起到越来越重要的作用。
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。
2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。
其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。
4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。
这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。
5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。
此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。
westernblotting原理
westernblotting原理
Western blotting，又称蛋白质印迹或免疫印迹，是一种用于检测特定蛋白质在复杂样品中的存在和表达水平的分子生物学技术。
其基本原理可以分为以下几个步骤：
1. 蛋白质样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并将其稀释到适合的浓度。
2. 凝胶电泳分离：将提取的蛋白质样品加入凝胶（通常是聚丙烯酰胺凝胶）中，并通过电泳分离。
由于不同蛋白质的带电性质和分子质量不同，它们在凝胶中会分离出不同的条带。
3. 蛋白质转移：将凝胶中的蛋白质转移到一种名为硝酸纤维素（nitrocellulose）或聚偏氟乙烯（PVDF）的膜上。
这一步骤称为蛋白质转移或印迹。
蛋白质通过范德华力或电场力从凝胶转移到膜上，保证了其在膜上的空间位置与在凝胶中一致。
4. blocking：为了减少非特异性结合，需要在膜上加入一种阻断剂（如牛奶或BSA）来覆盖未被蛋白质占据的膜表面。
5. 抗原-抗体反应：将特异性抗体（通常为辣根过氧化物酶或酶联免
疫吸附测定中的酶标记抗体）与膜上的目标蛋白质结合。
这些抗体识别并与其特异性结合的目标蛋白质。
6. 检测和显色：使用一种带有酶的检测抗体（第二抗体）与第一抗体结合。
这种酶标记的第二抗体可以催化底物转化为可见的色产物。
通过化学反应，颜色的深浅与目标蛋白质在样品中的含量成正比。
7. 数据分析：最后，通过图像分析或光密度计来量化膜上的蛋白带，从而分析样品中特定蛋白质的表达水平。
总之，Western blotting是一种强大的技术，可以用于定性和定量分析样品中的特定蛋白质，是分子生物学和生物化学中不可或缺的工具。
western blotting原理及步骤
western blotting原理及步骤
Western blotting，也称为蛋白质印迹，是一种用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等的技术。
其原理基于抗原-抗体的特异性结合反应，通过将样品中的蛋白质进行电泳分离，然后转移到固相载体上，再与特异性抗体进行孵育，最后通过显色反应检测目标蛋白质的存在和位置。
Western blotting的步骤一般包括以下几步：
1. 样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，并进行浓度测定和保存。
2. 电泳分离：将样品中的蛋白质进行电泳分离，根据其分子量和电荷的不同，将蛋白质分开。
3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质转移到固相载体上，常用的载体有硝酸纤维素膜、PVDF膜等。
4. 封闭：用特定的封闭液将膜封闭，以减少非特异性结合。
5. 孵育：将特异性抗体与膜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
6. 洗膜：用洗涤液将未结合的抗体洗去，减少背景干扰。
7. 显色：加入显色液，使抗体-抗原结合部位显色，从而检测到目标蛋白质的存在和位置。
8. 数据分析：对显色结果进行定量和定性分析，以获得目标蛋白质的表达情况和相互作用信息。
Western blotting具有较高的灵敏度和特异性，可以检测低浓度的蛋白质，并且可以半定量分析蛋白质的表达水平。
同时，Western blotting也可以用于研究蛋白质分子的相互作用。
然而，由于其步骤繁琐且易受干扰，Western blotting 的操作需要严格的质量控制和技术培训。
1。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。
westernblotting法
westernblotting法Western blotting法，也被称为蛋白质免疫印迹法，是一种常用的分析蛋白质的实验方法。
它通过将样本中的蛋白质经过电泳分离、转移到膜上、与抗体结合并通过化学发光的方式来检测目标蛋白质的存在与表达水平。
本文将一步一步回答关于Western blotting法的主题。
第一步：制备样品和蛋白质电泳分离Western blotting法的第一步是制备样品和将样品中的蛋白质进行电泳分离。
首先，需要从感兴趣的细胞或组织中提取蛋白质。
常见的提取方法包括细胞裂解、超声破碎、冻融破碎等。
然后，将提取的蛋白质样品加入电泳缓冲液中，通过电荷差异使蛋白质在凝胶中进行分离。
一般常用的凝胶包括聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）和琼脂糖凝胶（Agarose gel）。
电泳的结果将会得到不同大小和电荷的蛋白质带。
第二步：蛋白质转印蛋白质电泳分离结束后，需要将分离出来的蛋白质转移到膜上。
常用的膜包括聚偏氟乙烯膜（Polyvinylidene difluoride membrane，PVDF）和硝酸纤维素膜（Nitrocellulose membrane，NC）。
这一步使用电泳盒装置将凝胶与膜的间隙设置好，然后将电流施加，使蛋白质从凝胶中转移到膜上。
通过此步骤，蛋白质在膜上形成与电泳凝胶相似的蛋白质“印迹”。
第三步：蛋白质与抗体结合转印到膜上的蛋白质需要与特异性的抗体结合，以便检测目标蛋白质的存在。
这一步通常被称为免疫染色。
首先，将膜上的非特异性结合位点阻塞，通常使用的是蛋白质溶液，如牛奶粉或鸡蛋清。
然后，将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合。
这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，由于抗体的特异性，只有特定的蛋白质才能与其结合。
第四步：蛋白质检测Western blotting法最后一步是检测蛋白质和目标蛋白质的表达水平。
这通常通过使用化学发光的方法来实现。
常见的检测方法包括辣根过氧化物酶检测和碱性磷酸酶检测等。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
Western blotting蛋白免疫印迹实验
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1.4 WB 的特点
WB 是在蛋白质电泳分离和抗原、抗体检测基础上
发展起来的检测蛋白质的技术
SDS-PAGE 凝胶电泳：高分辨率
抗原抗体反应：特异性
转膜：灵敏度
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1.2 蛋白免疫印迹的应用
检测样品中特异性蛋白质是否存在
例：李桂波.利用免疫印迹法钓取PC3M细胞中与人前列腺癌高转移 相关特异性短肽结合蛋白的研究[D].吉林:吉林大学,2007.
对特异性蛋白质进行半定量分析
例：
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一对一带教疫印迹的应用
基因在蛋白水平的表达研究
的免疫印迹分析[J].中国人兽共患病学报,2009,25(10):931-934.
例： 吴德平,王颖等.立氏立克次体蛋白抗原基因的表达和重组蛋白抗原
抗体活性检测
目 录
1.WB的概念
一 二 三 四
WB的基础 试剂与设备
2.WB的应用
3.WB的原理 4.WB的特点
实验步骤与结果分析 实验室常见问题解答
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1.1 蛋白免疫印迹的概念
是将电泳分离后的总蛋白质从凝胶转移到固相支持物 NC 膜或 PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的 一种蛋白质检测技术。
Western_blotting
3. 显色反应
ECL超敏发光液
辣根过氧化物酶在过氧化氢存在的条件下催化鲁米诺，生成一种不稳定的中间 产物，当其衰变时即可发光。
二抗结合漂洗后，加入ECL超敏发光液，避光发光3-5分钟。
曝光
发出的光可使标准X-光片感光，产生较易识别的图像。
发光3-5分钟后，将膜夹如透明薄膜中，置于曝光夹（感光屏）中 曝光3min左右，然后进行显影液显影，定影液定影（和洗照片是 一样的）
方法一: 直接法
优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的 非特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便
抗原抗体反应
方法二: 间接法
优点： 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高（多个二抗
结合位点） 3.多种标记的二抗可供选择
免疫印迹的基本步骤
➢ 蛋白质样品的制备 ➢ 蛋白质的SDS-PAGE电泳 ➢ 蛋白质的膜转移 ➢ 封闭与抗原抗体反应 ➢ 显色（显影）反应
实验流程
样品收集制备 SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白
剥胶并电转移
封闭
一抗4℃孵育过夜 第二天，二抗37℃孵育1小时，显影曝光
条带灰度分析定量
蛋白质样品的制备
1. 电转移相关问题： 滤纸、胶、膜之间的大小。 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成断路。 膜必须随时保持湿润（干膜法除外）。 系统降温
2. 抗体的性质 影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识 别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗 原结合。
常见问题及解决办法
3 .样品中待检测蛋白质的含量 采用目前的技术，浓度低至0.1ng的蛋白亦可被检出 4. 背景问题 非特异性条带的来源一般有两种：一种是由于制剂中存在的非特异 抗体产生的背景条带，另一种则是由于特异性抗体与含有与待测抗原 类似表位的多肽发生的交叉反应 ① 弥散性高背景：可能原因是二抗产生,解决办法:缩短二抗孵育时 间；用高浓度的蛋白质来吸附二抗（二抗内加3％BSA）；使用另外的 二抗；缩短一抗和二抗的孵育时间；延长每次清洗时间。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
大分子蛋白wb条件
大分子蛋白wb条件
Western blotting（蛋白免疫印迹）是一种常用的检测蛋白质表达的方法。
大分子蛋白的Western blotting条件一般与常规的蛋白质检测条件相似，但需要注意以下一些因素：
1. 蛋白质的迁移条件：由于大分子蛋白的尺寸较大，迁移速度较慢，通常需要较长的时间和较低的电压进行迁移，以保证蛋白质能够完全迁移到检测膜上。
电压一般为常规Western blotting条件的一半左右。
2. 蛋白质迁移膜的选择：大分子蛋白的迁移要使用更为适合的迁移膜，例如聚乙烯二次亚胺（PVDF）膜或聚酰胺凝胶膜（NC膜），以保证蛋白质不易失活或脱落。
3. 蛋白质转移缓冲液的配制：配制蛋白质转移缓冲液时需要根据蛋白质的特点进行调整，通常会增加SDS浓度，添加较高浓度的甘氨酸（glycine）和较低浓度的甲基醇（methanol）。
此外，有时还需添加一些蛋白质保护剂（如牛血清白蛋白）以防止蛋白质的失活。
4. 封闭缓冲液的选择：大分子蛋白的化学和物理性质不同于小分子蛋白，因此封闭缓冲液的选择也需要根据蛋白质特点进行调整，一般会增加蛋白质保护剂的浓度，以减少非特异性的结合。
这些条件只是一般性的参考，具体的实验条件还需根据不同的研究对象和实验要求进行优化和调整。
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7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开 二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解 聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结 合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量 ，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
12
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵 三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有 一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质， 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对 策
5. 抗体浓度过高
35
Thanks！
36
压太高。转膜过程注意降温
34
四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉 反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
1
主要内容
一、Western Blot 简介 二、Western Blot 一般流程
三、Western Blot
成像系统
四、Western Blot 常见问题分析
2
一、Western Blot 基本原理
3
一、Western Blot 优点
1. 高分辨率的电泳技术 2. 特异敏感的抗原-抗体反应
对 策
33
四、SDS-PAGE常见问题
• • • • 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？
可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲 液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄， “三明治”结构不紧凑导致。 确保膜和胶块之间没有气泡
对 策
缓冲液中离子浓度太低，电流或电
13
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD)
15
10
12-43
20-80
7.5
5.0
36-94
57-212
14
15
灌制分离胶
隔绝空气
d缩胶
插入梳子
17
上样
Staking gel
Separating gel
18
电泳
19
转膜
半干法
将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸之间， 电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中， 电转4h或过夜。
3. 1-5ng中等大小的靶蛋白
4
一、Western Blot 应用
1. 目的蛋白的表达特性分析 2. 目的蛋白与其它蛋白、RNA的互作
5
二、Western Blot一般流程
蛋白样品的制备 转膜（PVDF或NC膜） 洗涤
SDS-PAGE电泳 封闭 洗涤 一抗 显影
酶标二抗反应
6
蛋白样品的制备
LB： 62.5 mmol/L Tris-HCl （pH6.8 at 25℃）, 2%SDS ，10%Glycerol(甘 油) ，50 mmol/L DTT(二硫苏糖醇) ；溴酚蓝 在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准 确性！
20
膜的选择
1. PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印 迹法中常用的一种固相支持物。 2. PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔 径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的 蛋白选用0.2um的膜。 3. 预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团， 使其更容易与带负电的蛋白结合。
2.发光试剂；
3.反应的杂质;
27
洗脱抗体
一抗洗脱 二抗洗脱 一抗种属来源不同时，strip二抗即可
28
三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
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Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵 敏度的图像拍摄； 可设定连续采样的次数、 起始及终止曝光时间， 进行动态连续拍摄，拍
21
湿转系统
22
不同大小蛋白的转膜条件：
转膜
转膜条件
蛋白x(kDa)
转膜液 甘氨酸（0.2M），3.0gTris碱 （25mM），200ml甲醇（20%， pH8.5），用水定容至。 配方同上
x<20
250mA恒流转3 hrs
20<x<120
250mA恒流4 hrs
120<x<200
甘氨酸（0.2M），3.0gTris碱 250mA恒流转6 hrs （25mM），200ml甲醇（20%， pH8.5），0.05%SDS，用水定容至。
200<x
配方同上
23
500mA恒流转4 hrs
23
半干转移系统
24
封闭
为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异
性结合而使非特异性背景提高,需对膜上的潜在结合位点
进行封闭处理。
脱脂奶粉（5％）、BSA（1％）
25
一抗、二抗孵育
1. 加入一抗溶液与滤膜温育，37℃2小时或4 ℃ 过夜。 2. 回收一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次 5min。
胶不平？ 凝胶漏液？
对 策
加入试剂后摇匀，使其充分混合， 防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合 不均匀
两块玻璃板底部要对齐
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四、SDS-PAGE常见问题
凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混 合均匀，动作轻缓 • 条带比正常的窄？ • “微笑”或“倒微笑 ”条带？ 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心 ，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导 致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果， 应赶走气泡。同时注意电泳槽装置 是否合适
摄得高质量的图片；
30
Tanon 5200---软件特点
具有序列图像保存功能，无需单张图片分别存储；
具有分析软件，可进行泳道密度扫描、半定量计算， 分子量计算； 图像叠加分析功能：可对两个图像进行合并显示， 并进行分析；
31
四、SDS-PAGE常见问题
胶板洗刷干净
加入AP和TEMED的量要合适
8
蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）具有相同的形状，形 状像一个长椭圆棒; （2）平均1g蛋白质结合 1.4gSDS; （3）短轴对不同的蛋白质 亚基-SDS胶束基本上是相同 的;
（4）长轴的长度则与亚基分
子量的大小成正比;
9
蛋白样品的定量
Bradford 法：考马斯亮蓝 G-250 有红、蓝两种不同颜色的形 式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶 液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处 有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 双缩脲法：Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形 成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收 Lowly法：第一步就是双缩脲反应，即Cu2+与蛋白质在碱性 溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试 剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。 10
3. 加入用TBST配制的二抗，摇床上缓慢摇动，
室温孵育1-2小时。
4. 倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次
5min，最后一次用TBS。
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二抗与底物反应显色
化学发光显色法(HRP) ECL中的luminol被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被 发光增强剂加强 影响发光的因素主要有： 1.含HRP的抗体；
聚丙烯酰胺凝胶电泳
1. 不连续的电泳缓冲体系。 2. SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白 质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子 量的大小。
11
不连续电泳系统
作用
浓缩胶 分离胶
缓冲液PH
凝胶浓度
使蛋白样品浓缩 pH6.8Tris-Cl 低，2-5% 使蛋白样品分离 pH8.8Tris-Cl 高，根据蛋 白大小