浅谈乙肝病毒检测PPT课件

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PCR分四个阶段
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如何定量？
Ct值的概念
Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开 始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循 环次数。
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定量原理
确定初始模板的浓度
初始 DNA量越多, 荧光 达到某一值（域值）时 所需要的循环数越少
Log浓度与循环数呈线 性关系，根据样品扩增 达到域值的循环数就可 计算出样品中所含的模 板量
数量 2
250ul/管
1
250ul/管
1
250ul/管
1
250ul/管
1
250ul/管
1
250ul/管
1
250ul/管
1
100ul/管
1
1人一份/管 20
主要成分 DNA提取液 HBV阴性血清 灭活HBV阳性血清 灭活HBV阳性血清 灭活HBV阳性血清 灭活HBV阳性血清 灭活HBV阳性血清 灭活HBV阳性血清 内标质粒及稳定剂 引 物 、 探 针 、 taq酶 等
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HBV抗原抗体系统检测临床意义
HBs 抗- HBe 抗- 抗-HBc Ag HBs Ag HBe
Ig Ig MG
+
-
-
- --
临床意义 感染或无症状携带者
+
-
+
- + - 急性或慢性乙型肝炎（传染性强）
（大三阳）
+
-
-
+ -+
急性肝炎趋向恢复 （小三阳）
-
+
-
+ -+
既往感染恢复期
-
+
-
+ --
3 所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循
无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内
操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集
中放置高压灭菌后方可处置。
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一、乙肝病毒e抗原检测
1.检测原理
在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（ HbeAb）， 配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体 （ HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂， 采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原 （ HbeAg）
乙肝病毒检测
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病毒鉴定方法
一、分离培养方法 二、快速诊断方法
1、光学显微镜检查
病毒包涵体及某些大病毒颗粒的检查
2、电子显微镜的检查
电镜直接检查 免疫电镜检查
3、血清学检查 4、病毒基因组检查
核酸杂交和聚合酶链反应
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乙肝病毒检测
一、乙肝五项（两对半） 二、乙肝病毒核酸定量检测
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2.PCR试剂准备
直接使用HBV-PCR反应管
3. 加样
HBV-PCR反应管分别加入将待测样本、阳性定量参考品、阴性
质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品上清20 μL。盖紧
管盖，8000rpm离心数秒后扩增
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4.PCR扩增 对各标本进行标记 反应条件： 93℃ 2分钟 93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环 93℃ 30秒→45℃ 60秒→30个循环 FAM通道检测HBV核酸，VIC通道检测内标
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4.结果判定
1 如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或 Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期， 则为阴性或小于检测灵敏度
2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30 按以下方法判断：
C<100,HBV DNA浓度<100 IU/ml 100≤C ≤ 5.0E+008 ,HBV DNA浓度=C IU/ml C>5.0E+008 ,HBV DNA浓度>5.0X108 IU/ml 如需精确 定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后
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荧光化学 TaqMan
SYBR Green 1
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TaqMan
源自文库
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SYBR Green I 工作原理
。 SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位
SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光
TAGCCGTAGCATTA
G C
G C
A T
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3、实验步骤
1.DNA提取
将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质
控品、 HBV临界质控品进行同步处理。
1.1 取200 μL样品，加入450 μL DNA提取液I和4 μL内标溶液，
用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，100℃处理10分
钟
1.2 12000rpm离心5分钟，备用
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2.所用试剂
组成成分
规格
组成成分
规格
1.HbeAg微孔板
（包被鼠抗Hbe单克隆抗体
96TX块
7.底物B （过氧化氢）
7mlX1支
（ HbeAb））
既往感染恢复期
-
-
-
- -+
既往感染
-
+
-
- --
既往感染或接种疫苗
-
-
-
- --
未感染，无免疫力
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二、乙肝病毒核酸定量检测
1.检测原理
利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为 靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA 进行快速定量检测。
荧光探针TaqMan 探针实时荧光 PCR 技术。在 PCR 反应过程中，同时利用 Taq 酶的 5’→3’聚合酶活 性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan 探针降解，荧光 报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射， FAM 荧 光检测乙型肝炎病毒JOE/RED610 nm 波长通道检测 内参。
强阳性质控品
临界阳性质控品
质控品及阳性定量参考品 HBV定量参考品（2.0X106IU/ml） HBV定量参考品（2.0X105IU/ml）
HBV定量参考品（2.0X104IU/ml）
HBV定量参考品（2.0X103IU/ml）
PCR检测试剂
HBV-内标溶液 HBV-PCR反应管
规格 4.5ml/瓶
T A
GCGCA T
GT
C
AG
CA
C
变性: 无荧光信号
A CGACT A G G A T G GT A C A G T C G TG T GCTGA T C C T A C C A T GT C A G CA C
未结合SYBR Green 1 dye
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2.所用试剂
核酸提取试剂
组分名称 DNA提取液I 阴性质控品
再检测，则样品HBV DNA浓度=（CX稀释倍数） IU/ml
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5.注意事项
1 每次实验需检测阴性质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品，满足要求方可进行判定（阳性质控 品Ct<30，阴性质控品无明显对数期或Ct值等于30 VIC检测通道扩增曲线有明显对数期） 2 本试剂盒的最低检出浓度为30IU/ml，最低定量浓 度为100IU/ml