噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用

噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用

1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1]。1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3]。这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响。传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。根据所需要的药物特性,选用适当的方法构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步优化设计,最终确定候选的药物结构。近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法[4],即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具有较高特异性和亲和力的理想目的肽。通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受体及其他化合物等新型药物或先导化合物。这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,将药物开发带入了一个崭新的时代。1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。在多数情况下,几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部残基肽段间的相互作用来实现的。1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与λ噬菌体和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。1985年,Smith描述了外源肽段在丝状噬菌体fd表面的展示结果。1988年,他们建立了新的表达载体——可选择抗体的丝状噬菌体fd载体,能将外源短肽表达并伸展到噬菌体表面,用亲和筛选可选到表达特异肽的噬菌体,通过测定噬菌体序列,就可以知道所表达肽段的氨基酸序列。这为噬菌体展示肽库的建立提供了技术保障。2噬菌体展示系统的类别噬菌体展示系统因载体和宿主细胞不同分别有:丝状噬菌体展示系统(包括p 、p 和噬菌体粒展示系统)、λ噬菌体展示系统及T4噬菌体展示系统。2.1丝状噬菌体展示系统:丝状噬菌体展示系统是外源基因与g3p或g8p基因融合,并将它以外壳蛋白表面多肽的形式展示出来。它是最早被用来展示外源肽或蛋白质的系统,也是目前应用最广、发展最完善的噬菌体展示系统。丝状噬菌体是单链DNA病毒,其通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞,然后将病毒DNA注入细菌的胞质,利用细菌胞质内的酶转变成复制的双链DNA,并通过滚动复制产生子一代DNA分子。噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体DNA的结构和复制特点,把丝状噬菌体M13或fd 作为良好的基因工程的载体。因它的DNA复制与装配不受DNA分子的限制,因此可以将外源DNA插入到其一些非必须区,仅导致噬菌体颗粒的加长,而不影响其感染宿主及装配,这样即可得到一些插入外源DNA的基因重组体。噬菌体还可把插入的DNA片段以融合蛋白的形式表达在衣壳蛋白上。2.2λ噬菌体展示系统:是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白PV或λ噬菌体头部组装的必需蛋白——D蛋白融合而被展示。2.3T4噬菌体展示系统:T4噬菌体展示系统是将外源肽和蛋白质与T4噬菌体的小衣壳蛋白SOC的C端融合而被展示,也有将外源蛋白与T4噬菌体的次要纤维蛋白(Fibritin)的C末端融合而被展示。由于T4噬菌体是在寄主细胞内组装而不必通过分泌途径,因此它可展示的肽/蛋白质范围较广,尤其适合于展示那些不能被E.coli分泌的复杂蛋白质[6]。3噬菌体展示肽库的筛选方法3.1生物淘金法:是目前常用的、最早由Smith等设计的一种筛选方法。将靶分子包被在固相介质上,加入噬菌体肽库与之吸附,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收等亲和性的噬菌体,经过几轮“淘选”,可富集到特异性的噬菌体多肽。用于噬菌体肽库筛选的目标蛋白可以直

接吸附于酶标板,也可固定在生物小磁珠上,或者把经生物素化靶分子固定在包被链霉亲和素的ELISA小孔或生物磁珠上(利用链霉亲和素与生物素的高亲和力)。而对于无法提纯或靶分子(如抗原)性质不确定的情况,如癌细胞的表面受体,需建立相应的筛选系统如双层膜筛选系统:第一种膜为亲水性膜,第二种膜为疏水性膜,膜表面包被目标蛋白,细胞先在第一种膜上培养,然后移至第二层膜,分泌的可溶性蛋白可透过第一层膜,与第二层膜上的目标蛋白结合,再用已知配体筛选。3.2选择感染性噬菌体(SIP):用特定的多肽或蛋白替代P 蛋白使噬菌体丧失感染能力,再通过这些多肽或蛋白与其配基的结合恢复感染能力。此方法将蛋白质配基间的相互作用与噬菌体的感染扩增直接联系[6],能使特异性筛选和噬菌体扩增同时进行。筛选蛋白或配基无需表达和纯化,只需DNA存在,少量的功能产物表达即可筛选,但缺点是筛选效率受到SIP文库的有效库容的限制。3.3延迟感染性筛选:由Benhar于2000年建立[7]。利用细菌表面展示系统中细菌外膜蛋白A(Lpp-Ompa)的多用性特点,将目标蛋白的编码序列融合到杂交的外膜蛋白A来展示[8]。当噬菌体被捕获或淘洗后,细菌被转入37℃培养,噬菌体因F纤毛得到表达而重新具有感染能力,成为被选克隆。此法筛选的进程与常规先选择再感染的过程相反,即被选择的细菌才可被捕获的噬菌体感染,所以又称“反向筛选”。其优点是:筛选所需目标蛋白的浓度很低,比常规方法低103,适合于大文库中有效筛选稀有克隆。4噬菌体肽库的构建和多肽的进化由于电转化效率的限制,在随机氨基酸数目大于7时,构建的文库很难容纳所有可能的多肽。因此,从噬菌体展示文库中筛选到的随机多肽还需要进一步的改造,以提高其结合力或专一性。这一步可以通过以下方法实现:(1)定点突变:Sharon等采用体外定点突变的方法对低亲和力抗体Vh中的一些氨基酸逐个突变,发现三个不同位置的三种氨基酸具有较高亲和力,将这三种氨基酸组合在一起,结果使抗体亲和力提高了200倍。(2)在致突变株进行体内突变:大肠杆菌MutD5株DNA聚合酶全酶中ε亚基基因MutD一旦发生突变,就丧失了校正功能,在复制时体内基因突变率明显增加。该菌株的Lac 基因易发生单个突变,其自然突变率比野生型株高100倍。该株的高突变率可用于抗体V区的基因突变,以改善噬菌体的亲和力。Low等采用此方法进行噬菌体抗体的亲和力成熟[9]。(3)错误倾向的PCR:Winter等利用错倾PCR方法引入突变使亲和力提高。在抗体库中还可以采用以下方法:(1)CDR的突变(walkingmutagenesis):随机合成的CDR区作为引物,通过PCR,特定位点上可发生变化,从而可建立次级突变库。(2)链更替(chainshuffling):将得到的低亲和力噬菌体肽或抗体的一条链(如轻链)与另一条链(如重链)的全部组合得到次级库,选择亲和力改善的克隆,再次重链固定,与轻链全部组合建库,筛选高亲和力的克隆。目前可供筛选的噬菌体肽库以线性肽库为主,构象具可变性,在一定程度上,虽可以增加筛选到与特定靶分子特异性结合的配体的可能性,但同时也因结合时的损失较大,难以筛选到高亲和力的结合配体。针对这一现象,目前采取的策略有:(1)通过对展示肽库的限制来获得高亲和力的克隆,如:将线性肽两端引入半胱氨酸形成环肽,将肽链折叠时取向固定。(2)预先设计分子构架,构建构象性肽库。这是一种基于骨架蛋白基础上的噬菌体肽库技术。以结构稳定的小分子α-螺旋和β-片层构成的分子支架为基础,改造分子表面连接α-螺旋和β-片层的转角、环形区或一些无规则的肽段。改造的方法可以是其中某些肽段随机化,也可以将其它蛋白和多肽中的活性有关序列插入其间[10]。目前最常见的是以天然抗体为结构骨架建立的噬菌体抗体库,主要是β-片层结构。抗体分子经长期进化所产生的基因结构重排,可使抗体库获得的多样性达107以上,也可以通过人工设计改造建立人工抗体库。5噬菌体展示技术的应用噬菌体展示肽库技术作为研究生物分子间相互作用快捷而有效的工具,广泛适用于抗原抗体系统、细胞因子与受体的作用及酶学等领域,筛选的靶物质包括抗体、酶、受体及其他功能蛋白,或者细胞、血清乃至整个动物。5.1以单克隆抗体模拟抗原表位:以纯化的单抗为靶分子筛选抗原模拟表位是噬菌体展示技术应用最广泛的方面。目前,利用肽库已成功地筛选多种病毒的抗原表位,如HCV核心抗原表位[11]、HIVgp120蛋白的表位[12]。用抗单纯疱疹病毒型(HSV-1)的mAb筛选12