细胞培养中支原体污染
支原体污染及其检测
支原体污染及其检测支原体污染在细胞培养中最为常见，培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞蔓延和传扬，据报道目前约有11％的二倍体细胞和传代细胞存在支原体污染；支原体污染的另一重要来源是培养液中加入了被支原体污染的血清。
支原体是一种介于细菌和病毒之间的能自立生活的微生物，它无细胞壁，形态呈多形性。
最小的支原体直径约200nm，可通过滤菌器。
支原体污染后培养基普通不发生混浊，细胞形态无显然变幻，但事实上细胞已受到各方面的潜在影响，如影响DNA合成，代谢减慢，生长被抑制等。
这种污染造成的危害较大，但支原体污染不易被发觉，因此对支原体的污染必需引起足够的重视，应严加防范。
支原体污染常用的检查办法如下。
1．形态学检查常用相差显微镜检测取洁净载玻片，滴加少许待检的细胞悬液，压上盖片，用相差显微镜油镜观看。
如有支原体污染，镜下可见暗色极小颗粒，类似布朗运动，可位于细胞表面或细胞之间。
要注重支原体与细胞破裂后溢出的内容物如线粒体等相区分。
电镜检测：用普通染色办法难以确定时，可用电镜检查。
详见电子显微镜技术一节。
2．支原体染色镜检支原体经低张处理后用地衣红染色观看，本法简便易行，不仅适用于检测支原体，亦可用于检查真菌和细菌。
【材料】 (1)待检疑有支原体污染的培养物； (2）检测用试剂：低张处理液（0.45%），Carnoy固定液（配方：60ml纯加30ml和10m1）,2％的地衣红染液（配方：2g地衣红，60ml加蒸馏水至100m1 )。
【办法】 (1)取材：吸取待检培养液1 ml, 500～800r/min，离心5分钟后去上清液，余留0.2m1备用。
(2）低张处理：用新奇配制的0.45％溶液0.2m1，加入上述待检标本中，静止低张处理10分钟，然后离心去上清液，留取沉淀物0. 2m1，涂片2～3张，晾干。
(3）固定：用新配制的Carnoy液固定2次，共10分钟。
(4）染色：将晾干的涂片用2％的地衣红染5分钟。
细胞培养中支原体污染
细胞培养中的支原体污染的预防及处理Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。
支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。
自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。
与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。
支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。
一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。
国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（idlawii），为牛源性。
国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。
对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。
对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。
支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。
支原体清除实验
支原体清除实验支原体污染是细胞培养过程中的常见现象。
细胞被支原体污染之后，在显微镜下无法直接观察到，生长状态可能发生或不发生改变，因此一般不易被察觉。
但是支原体会改变细胞的很多生长参数，因而极易对后续实验造成影响，所以对支原体污染的检测和清除非常重要。
以下为一次支原体检测和清除的实例。
材料：细胞系：SH-SY5Y支原体PCR检测试剂盒：Myco-P-20 (上海炎熙生物 )支原体清除剂：Myco-E-1 (上海炎熙生物 )方法与结果：1，将已检测出有支原体污染的SH-SY5Y细胞以正常传代密度铺到6孔板中，一个孔加清除剂，作为测试孔，另一孔不加清除剂，作为阴性对照孔。
两孔之间间隔一个孔，以免互相污染。
2，在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养，并使细胞在培养过程中一直处于清除剂的作用下。
在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。
每份上清与细胞已共培养48小时，除第9天的上清只共培养了24小时。
3，将这些培养上清在16000g离心5分钟，小心去除离心上清，将沉淀用无菌PBS洗三次，每次以16000g离心5分钟。
最后获得的沉淀用100微升纯水重悬，在100℃水浴中孵育5分钟，然后用于PCR反应。
4，按照支原体检测试剂盒Myco-P-20的说明书进行PCR检测操作，结果如下：4.1，与对照样品共同反应，用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。
在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带（约440bp），在第8、9、11天的样品中，已看不到支原体阳性条带。
4.2，不加对照样品，检测样品单独反应，用这种方式可以提高测试灵敏度。
可见在第8天和第9天的样品中，支原体阳性条带仍然出现，但是弱于第4天的样品。
在第11天的样品中，有明显的200bp以下的非特异的条带，且亮度高于阳性条带，所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物，样品中已没有支原体DNA。
注释：由于PCR是一种非常灵敏的检测方法，所以很容易出现假阳性条带。
细胞支原体污染怎么办？该怎么处理？
甲：细胞里突然出现小黑点，问君能有几多愁?乙：珍贵的细胞萎靡不振，扔了重买?相顾无言，惟有泪千行。
丙：细胞转染效率极低，实验结果遥遥无期，我的课题前功尽弃!但见泪恨湿，不知心恨谁!细胞培养中，最怕的就是生物污染，支原体污染就是其中的一种。
支原体这种微小的微生物，是细胞培养中令人头疼的大问题。
支原体结构也比较简单，多数呈球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。
支原体污染可能来自培养基、血清或实验操作者，会影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。
支原体感染不易察觉，因此对培养细胞定期进行支原体检测就非常重要。
污染实验室培养细胞的支原体主要有八种，但还没有哪种检测方法能够单枪匹马把这八种支原体都检测出来。
支原体非常顽强，通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。
例如青霉素主要作用于细菌细胞壁，但支原体没有细胞壁因此就不受影响。
无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体感染的最佳方式，另外及时找出受到支原体感染的培养物也很重要，这样才能在感染扩散前快速采取有效措施。
支原体污染在细胞培养中实际上是比较常见的，可达30%甚至更高。
支原体污染时细胞表现为长得不好，也不死亡，同时，培养基又是清亮的，时间长达一周也没有什么变化，这时基本上可以判断出是支原体污染了。
定期检测支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。
一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。
将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。
预防支原体污染的建议：细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染;严格实验操作;细胞培养基和器材要保证无菌;在细胞培养基中加入适量的抗生素。
支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理抗血清处理抗生素加抗血清和补体联合处理支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等完全不敏感;对多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺药物普遍耐药。
细胞培养中支原体污染
细胞培养中的支原体污染的预防及处理Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。
支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。
自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。
与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。
支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。
一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。
国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（idlawii），为牛源性。
国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。
对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。
对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。
支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。
细胞培养中常见的污染及处理@麦粒
常见细胞污染及其处理方法麦~粒（2012级生物化学与分子生物学专业）摘要：细胞培养是生命科学实验及生物医药产业化中的一项关键技术，细胞污染问题一直是细胞培养中的大敌。
本文综述了细胞培养中污染的类型、处理方法和预防措施等，以期为实验室细胞培养中遇到的细胞污染的解决提供参考。
关键词：细胞培养，细胞污染，支原体污染细胞培养技术是现代生命科学研究中不可缺少的一项基本实验技术，同时也是细胞工程中的核心技术之一。
细胞培养的质量好坏直接关系到实验结果的可靠性与否以及产品质量的合格与否。
在细胞培养中，最基本的原则就是无菌操作，污染是细胞培养最致命的大敌，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
特别是对于一些珍贵的细胞株，一旦污染对实验可能就是毁灭性的。
1 污染的类型细胞污染的类型可分为物理、化学、生物三类。
其中化学、生物因素最为常见，物理因素最易被忽视。
1.1物理污染物理性污染通过影响细胞培养体系中的组分，从而影响了细胞的代谢。
最为常见的是温度和辐射（紫外线照射）。
过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱中取出的培养液直接加至37℃培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响某些实验现象的观察。
在生物安全柜紫外灭菌时，应当遮蔽对紫外线敏感的试剂，同时普通操作中也要注意对见光易分解的物质进行避光处理。
对于需要使用同位素标记的某些实验，应当注意细胞、试剂周围不能放同位素。
除此之外，有时操作过程中偶尔有异物落入，极易造成污染。
一些小的颗粒状异物作为是微生物污染的载体进入培养液中造成细胞污染。
另外，实验过程中酒精棉球的棉絮、移液器枪头上的某些塑料碎屑等都有可能增加染菌的概率。
1.2化学污染细胞培养中的化学污染大多是由于实验准备或实验过程中造作不当造成的。
在实验准备阶段，细胞培养室中的器皿应做到专用，避免与常用器皿混用。
此外，细胞用器皿洗刷过程中要注意洗刷彻底，不可有洗涤剂等残留。
高压灭菌时应灭菌彻底，并在灭菌后的生物安全柜中打开使用。
细胞培养中的支原体污染
生物特性：
无细胞壁，形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形，其直径仅有 0.13～0.18μm，是目前发现的最小细胞，并且变形能力大，故能通过滤菌 器。 革兰氏染色不易着色或呈阴性。 胞膜中含有胆固醇或其他甾醇，这种特性使支原体膜更具柔顺性，对于物 理因素，如压力、渗透压、脱水的抵抗力很大。 多数支原体适合在偏碱性条件下生存（pH值7.6~8.0），对酸耐受性差。
原体是没有作用的。
支原体污染应对策略
新一代支原体抗生素M-Plasmocin 其含有两种杀菌成分,一种成分通过干扰核糖体的翻译功能而使蛋白合 成受阻。另一种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA的复制。 可以强效对抗支原体及相关的无胞前对抗支原体最理想的 方法。
支原体污染来源
工作环境的污染
操作者本身的污染（包括操作者操作不当以及某些支原 体在人体是正常菌群） 实验器材的污染 培养基等试剂的污染
被污染细胞造成的交叉污染
制备细胞的原始组织或器官的污染
支原体污染的类型
口腔支原体(M.orale) 精氨酸支原体(M.arginini) 猪鼻支原体(M. hyorhinis) 发酵支原体(M.fermentans)
梨支原体(M. pirum)
莱氏无胆甾原体(idlawi）
支原体污染有时易被忽视！
1.培养液可不发生混浊
2.细胞病理变化轻微或不显著
3.细微变化也可由于传代，换液而缓解。 4.个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从 培养器皿脱落
但支原体污染对细胞的影响却是极大的！！！
1、影响细胞的生长状态及形态 支原体可使培液中支持细胞生长的营养物质含量减少，造成细胞生长缓慢甚至 停止；另外还会导致细胞微管解聚，引起细胞一系列病变，表现为细胞收缩、 贴壁细胞脱落、裂解等。
细胞支原体污染的图片、危害、表现和怎么办
细胞支原体污染的图片、危害、表现和怎么办（2016年10月16日）一、细胞支原体污染的图片我们首先来认识一下，细胞支原体污染与非污染的图片有什么区别。
如上图所示，左侧为未经支原体清除试剂处理的人Hela细胞,经DAPI染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被染成蓝色，这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA，说明细胞支原体污染非常严重。
而右侧为经过本公司的支原体清除试剂2处理7天的Hela细胞，经DAPI 染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质没有任何絮状核酸物质被染成蓝色，说明支原体已经被清除。
（版权声明：上图来自上海易色医疗科技有限公司网站。
）二、细胞支原体污染的危害和表现细胞支原体污染的危害（1）培养的细胞被支原体污染后，几乎可以改变细胞的所有功能，其可以导致细胞染色体的异常和损伤，改变细胞的代谢、生长、形状、附着，影响病毒的扩增能力和产量等等。
例如，Miller CJ等人通过Microarray的研究表明：支原体污染严重改变被污染细胞的基因表达谱 [1, 2]，支原体污染后与无污染的同一细胞系相比，表达差异达2倍以上的基因就有200多个！！！（详细数据请见参考文献1）。
Edward Burnett 和 Liz Penn认为：被支原体污染的细胞系已经不是原来的细胞系，而是另外一个细胞系了 [3]！此外，严重的支原体污染将彻底摧毁一株细胞系。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
总之，在细胞系上进行生物医学方面的科学研究，如果不能保证所用的细胞系无支原体污染（Mycoplasma-free），则所得出的结论是极端不可靠甚至是完全错误的！可以想象：全球范围内，每年因支原体污染导致白白浪费的科研经费的数量是多么的巨大，有人估计至少高达数十亿美金！细胞支原体污染的危害（2）1. 细胞生物学：支原体污染将直接导致最常用的MTT细胞毒性实验结果的严重错误！●结果：由于支原体对MTT的额外还原作用，对阿霉素（Doxorubicin, 一种抗肿瘤药物）的抗性，支原体污染和非污染的细胞二者相差15倍！（Due to an additional reduction of tetrazolium by mycoplasmas, contaminated cells appeared up to 15 fold resistant to doxorubicin.）●参考文献：Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assayresults due to mycoplasma contamination of cell cultures. Anticancer Res. 1999 Mar-Apr; 19(2A):1245-8.2. 免疫学：支原体污染本身将可以直接诱导树突状细胞的成熟！这对于目前国内外普遍开展的人体免疫细胞的肿瘤治疗将是灾难性的。
一种快速判定细胞培养中支原体污染的方法——瓜氨酸测定法
．
技 术 方 法
一
种快速判定细胞培养 中支原体污染 的方法——瓜氨酸测定法
梁少东 ， 黄小 乐 ， 媛 ， 琴 ， 严 杨 肖成祖
广 州 铭 康 生物 工 程 有 限公 司 ， 东 广 州 ５ ０ ３ 广 １７ ０ 【 要 ］ 目 的 ： 发 一 种 简便 、 摘 开 快速 、 及 时发 现 细 胞 培 养 中支 原体 污 染 的方 法 。 法 ： Ｈ Ｌ 能 方 用 Ｐ Ｃ检 测 细 胞培 养 中瓜 氨 酸 是 否 存 在 及 其量 的大 小 。 结 果 ： 当细 胞 培 养 被 支 原 体 污 染 时 ， 养 基 中精 氨酸 量 明 显下 降 ， 培 同时 有瓜 氨酸 出现 ； 当支 原体 被 消 除 后 ， 氨 酸 即消 失 。 论 ： 细胞 培 养 中瓜 氨 酸 的 出现 与支 原 体 污 染 的关 系是 特 异 的 ， Ｈ Ｌ 在 ２ ｈ内 即可 检 出， 明该 方 瓜 结 在 用 ＰＣ 表 法可 靠 、 便 、 简 快速 ， 可作 为细 胞 培 养 过 程 中支原 体 污 染 的 常规 监测 手 段 。 【 键 词 ］ 细胞 培 养 ； 原 体 污 染 ； 氨 酸 ； 氨 酸 脱 亚 氨 酶 ； 效 液相 色谱 关 支 瓜 精 高
ｗａ ａ ａ ｒ ｇ ｌ ｒ ｉ ｓ ｃｉ ｎ ｆ ｒ ｍｙ ｐｌｓ ｏ ａ ｉａ ｉｎ． ｙ ｓ ｅ ｕ ａ ｎ ｐｅ ｔｏ ｏ ｃｏ ａ ｍａ ｃ ｎｔｍ ｎ ｔｏ
［ ｙｗｏｄ ］ ｃｌ ｃｌ ｒ； ｙｏ ｌ ｍ ｏ ｔ ｎｔ ｎ ｃ ｒｌｎ ；ａ ｉ ｎｄｉ ｉａｅ Ｈ Ｌ Ｋｅ ｒ ｓ ｅ ｕｔ ｅ ｍ ｃｐａ ａｃｎａ ａｉ ； ｉｕｌ ｅ ｒ ｎ ｅｅｍ ｎｓ； Ｐ Ｃ ｌ ｕ ｓ ｍｉ ｏ ｔ ｉ ｇｉ
８２ ９
细胞培养中支原体污染的检测
细胞培养中支原体污染的检测细胞培养中最令人头疼的问题之一是微生物的污染，而支原体的污染更给人一种看不见摸不着的感觉。
长期以来，这个问题一直令细胞培养工作者困惑。
在人们日常生活的工作环境中，支原体可以说无处不在，它可以通过人的毛发、口腔、穿着的衣服、动物的皮毛以及日常的细胞培养的操作环境造成对细胞污染。
国内外研究表明造成细胞培养污染的支原体主要为以下四种支原体，即口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体和莱氏无胆甾原体。
但能够造成细胞污染的支原体种类还很多，有些细胞甚至同时感染两种以上的支原体。
由于支原体体积很小，直径约在0.2—2.0um之间，通常可以通过过滤膜而直接造成培养基或血清的污染。
另外，被支原体污染的细胞培养基液体往往并不浑浊，细胞受损程度并不明显，形态很少改变，这样就更增加了人们对其的防范难度。
从形态结构上，支原体形态多变，它多吸附在细胞表面或散于细胞与细胞之间。
从其理化或生物学特性上讲，所有支原体代谢均需胆固醇，部分需要精氨酸和葡萄糖。
支原体的生存要求要比细菌高，同时，除需基本营养物质外，还需10—20%血清条件，最适pH值在7.8—8.0之间，多数支原体呈兼性厌氧，其繁殖方式主要是二分裂繁殖，分裂和其DNA复制不同步，可形成多核长丝体。
由于支原体是一类缺乏细胞壁的微生物，因此它对作用于细胞壁类的抗生素（如青霉素G）不敏感。
支原体对热的抵抗力和细菌相似，而对环境渗透压的变化比较敏感。
支原体对细胞的影响，可以从两方面考虑。
一方面是对细胞的直接影响，细胞被支原体污染后，增殖缓慢，部分细胞变圆，从瓶壁上脱落，部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际上潜伏着多方面的危险。
另一方面，支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞DNA、RNA的合成，降低细胞的抵抗力。
因此，支原体污染对细胞的影响是非常广泛和深远的。
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍
细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍（2016年10月16日）哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。
支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。
从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：一、培养法●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。
●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。
这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。
而猪鼻支原体约占所有细胞支原体污染的20-50%。
●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中收录的培养法支原体检测方法进行操作。
二、荧光染色法●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色，如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。
●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。
●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。
细说细胞培养中的的支原体污染以及生长曲线测定
细说细胞培养中的的支原体污染以及生长曲线测定-麒盟生物1、问：测定细胞生长曲线的意义是什么？答：细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。
因为细胞太小，无法测单个细胞的生长状态，所以测细胞群体的生长曲线。
2、问：如何选择细胞接种数？答：可根据细胞传代培养过程中接种数及细胞生长周期进行计算，细胞接种数因细胞的不同而不同。
3、细胞计数时为什么要用台盼蓝染色？答：加入台盼蓝后，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。
4、细胞生长曲线测定时为什么要做重复孔？答：测定细胞生长曲线细胞计数时选择 3 个复孔，每孔分别计三次，取其平均值，目的是减小操作误差。
5、细胞生长曲线测定周期是几天? 答：一般是一个星期。
6、为什么绘制的细胞生长曲线没有达到平台期？答：可能有以下原因：一是细胞接种密度过低；二是细胞培养时间过短；三是细胞生长状态不好，使其不能正常增殖。
更多专业知识，登陆麒盟生物网站查询。
7、为什么细胞计数第一天，细胞数没有增加反而减少?答：一般细胞传代后，会有一个生长缓慢的潜伏期，细胞不增殖，而细胞会有正常的死亡，故细胞数不增加反而减少。
8、细胞生长曲线还有其他方法绘制吗？答：当然有。
我们提到最多的是直接计数的方法，除此以外还有相对计数的方法，该类方法首先要绘制标准曲线，标定细胞数和某个变量的函数关系，然后我们只需要测定每天这个变量的值便可以计算出细胞数。
常用的是MTT、CCK8等比色的方法。
细胞培养中的的支原体污染支原体是一种大小仅为0.2~0.3卩m，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22~0.45 卩m）的原核生物。
支原体是让每个细胞培养者崩溃的家伙。
因为它极小，可以很轻松的通过滤膜，混入培养系统中，而且没有细胞壁，可以轻而易举的躲过抗生素，就这样悄无声息的杀死细胞，与细菌和真菌相比，支原体造成的污染不论在检测、预防还是去除上都更为困难。
常用的细胞培养方法、污染及污染处理
常用的细胞培养方法、污染及污染处理一、本文概述细胞培养是生物学和医学领域中一种重要的实验技术，广泛应用于基础研究和实际应用。
通过模拟细胞在体内生长的环境，细胞在体外得以繁殖、分化并维持其特定功能。
本文旨在概述常用的细胞培养方法，包括培养基的选择、细胞传代、细胞冻存与复苏等，同时探讨细胞培养过程中可能出现的污染问题，包括细菌、真菌和支原体等微生物污染，以及污染的检测和处理方法。
通过本文的阐述，读者可以对细胞培养的基本流程和污染防控有更为全面的了解，为实验操作提供指导和参考。
二、常用的细胞培养方法细胞培养是生物学和医学研究中的核心技术，用于模拟体内环境，研究细胞生长、分化和功能。
以下是几种常用的细胞培养方法：贴壁培养法：这是最常见的细胞培养方法。
细胞在培养瓶或培养板的表面上贴壁生长，形成单层细胞。
这种方法适用于大多数哺乳动物细胞系。
悬浮培养法：某些细胞，如血液细胞、肿瘤细胞和某些干细胞，可以在液体培养基中悬浮生长。
这种方法不需要细胞贴壁，可以方便地扩大细胞数量。
微载体培养法：微载体是一种微小的、可以悬浮在培养基中的颗粒，通常用于大规模细胞培养。
细胞可以在微载体的表面上贴壁生长，从而增加细胞与培养基的接触面积，提高细胞生长效率。
三维培养法：这种方法模拟体内组织的三维结构，使用支架或凝胶等基质支持细胞生长。
它有助于研究细胞间的相互作用和组织的形成。
共培养法：将不同类型的细胞放在同一个培养环境中进行培养，以模拟体内细胞间的相互作用。
例如，将内皮细胞和肿瘤细胞共培养，可以研究肿瘤血管生成的过程。
在进行细胞培养时，需要选择适合细胞类型和实验目的的培养方法，同时严格控制培养条件，包括温度、湿度、pH值、营养成分等，以确保细胞的正常生长和繁殖。
三、细胞培养污染及其影响在细胞培养过程中，污染是一个常见且严重的问题，可能对细胞生长、实验结果和细胞治疗产生负面影响。
污染主要来源于微生物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。
支原体污染后的处理方法
组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。
当细胞被支原体污染后若由于材料的特殊性必须保留可以采用一定的抗生素进行处理，对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等。
目前，市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。
另外，配合支原体检测试剂盒可以帮助尽快发现支原体的污染。
去医院买一瓶静脉滴注用的”环丙沙星注射液“，国产的很便宜，在超净台内打开，可直接往培养瓶里加，混匀，终浓度为10ug/ml，细胞连续用药两周，即OK。
也可试20，10，5，高中低三个浓度，慎重些。
本实验室多人试过，效果很好，且一瓶静脉滴注用的”环丙沙星注射液“，稀释量很大，能用于大量大量的细胞，经济实惠，最穷的人也用的起。
《细胞培养的微生物污染排除》一、抗生素除菌法：用BM－1（截耳素衍生物）和BM－2（四环素衍生物）抑制支原体1．抗生素制备：均可用PBS配成250×浓缩液－20℃备用，使用浓度参考《组织培养和分子细胞学技术》117页表6－2。
2．处理：取受支原体污染的细胞，吸除培养液，加入含BM-1的1640培养液培养3天后，吸除培养液，再加入含BM-2的1640培养液培养4天，如此连续三个轮回。
3．检测：用33258荧光染色镜检（每个轮回末应检测一次）。
4．培养：清除支原体后的细胞，在不加上述抗生素的培养液中，再传代培养3～4次。
5．镜检：如清除不彻底可再进行处理至纯净为止（一般3个轮回即能被完全消除）。
BM-1和BM-2与CIP（4-氟，2-羟基喹啉）联合应用亦可，即先用含BIP培养液培养12天后，再按上述方法处理。
二、加温除菌法：把受污染的细胞置41℃中作用5～10小时。
三、动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。
细胞传代培养中支原体污染的来源及预防
般 预 防 可 从 以下 几 方 面 着 手 ：
① 添加抗 生素 。
② 从物 品 、用 品消毒 灭菌着 手 ：细胞培 养所用 物 品清
洗、 消毒要 彻 底 ， 种溶 液灭 菌 除菌 要仔 细 ， 在无 菌试 验 各 并 呈 阴性后才 能使用 。 操作 室及剩余 的无菌 器材要定期 清洁 、
研 究结 果造成严 重影 响 。为 了保证 细胞体 系免受 污染 的影
响 。 可能减 少污染 的发生 及危 害产生 的关键 是加 强预防 。 尽
一
不 易看 清 内部 结 构 ，电 镜 下 观 察 支 原体 膜 为 ３层 结 构 。 支 原体 多 吸 附或 散 在 于细 胞 表 面和 细 胞 之间 。横 断 面 与
台使用过 久 ， 滤板未 定期 更换或 长 久不更换 ， 气受 尘埃堵 滤
塞 ， 丁作 时 不 带 口罩 或 外 界 气 流 过 强 。污 染 空 气 进 入 操 作 区 ， 会 导 致 污 染 。 夏 季 南 方 地 区 多 雨 ， 气 湿 度 大 ， 菌 也 春 空 含 量 多 ， 作 不 注 意 也 易造 成 污 染 。 丁 ２２ 清 洗 消 毒 ．
是 加强预 防措施 。
关键 词 ： 胞培 养 ； 细 支原 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ； 染 ； 污 预防
中 图分 类号 ： ３５ Ｑ ５ Ｒ ７ ； ２
文 献标 识 码 ： Ｂ
原体 。
文 章顺 序 编 号 ：６２ ５ ９ （０ ９ ０ － ０９ ０ １７ － ｔ０ ２ ０ ）１０ ４ — １
污 染 是 细 胞 培 养 技 术 中 面 临 的 主 要 问 题 ， 特 别 是 传 代 细 胞 被 支 原 体 污 染 是 个 世 界 性 难 题 。 在 细 胞 培 养 中支原体感 染发生率 达到 ６ ３％ ， 原 体 感 染 发 生 后 能 支 改 变 细 胞 的 Ｄ Ａ、 Ｎ 及 蛋 白 表 达 ， 培 养 液 不 发 生 混 Ｎ Ｒ Ａ 但 浊 ． 胞 一 般 也 无 明 显 变 化 。笔 者 通 过 支 原 体 的 来 源 、 细
细胞支原体污染
细胞支原体污染较长一段时间，一直觉得细胞培养有点问题，无缘无故的出现细胞代谢异常现象，培养基内小渣渣变多，看不到细菌污染，看不到培养基浑浊，但可以感觉到细胞状态不行，即使是单层没有复层时也一样，当时考虑支原体污染，查了一些有关支原体污染的内容，由于细胞状态可以在换新鲜培养基的时候转变过来，而自己的实验也是需要在换培养基后进行，故而疏忽了可恶的支原体污染，今天决定解决这个问题。
先查了一下资料：细胞支原体污染的一般情况及预防措施细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。
而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。
但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。
各国细胞库支原体污染的统计表，如下：国家受支原体污染(%) 报告年度USA－FDA 15 1993(past 30 years)USA－ATCC 15-20 1992Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987-19931998Germany－DSM 36 1990-1994Argentina 65 1987Israel 32 1986-1993China 95 1990造成支原体高污染率的原因：1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染5、研究或操作人员忽略污染问题支原体污染的来源：1、已受污染的细胞2、操作人员的疏失3、已受污染的培养基、血清4、操作环境不良、实验器具不洁等由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。
而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。
细胞污染
细胞污染细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染。
他们在细胞培养中污染的特点如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
2、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
3、黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。
常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。
对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。
4、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。
真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
5、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。
他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。
这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞占优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。
6. 病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。
目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。
尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。
细胞培养时遇到支原体污染怎么办
细胞培养时遇到支原体污染怎么办前言：细胞培养物被支原体污染是极普遍的问题，面对支原体污染给细胞培养带来的巨大难题，世界各国开始重视，并相继建立了细胞库，对细胞质量进展控制，效果显著，支原体污染的问题得以限制。
目前已知能污染细胞的支原体有20多种以上，其中95％以上的支原体污染是口腔支原体。
目前已知的主要污染源是动物血清、胰酶和已污染培养物的气溶胶，例如，猪鼻支原体通过胰酶，在消化细胞时进入细胞培养物，并造成污染。
在原代细胞与传代细胞的检测中，原代细胞与传代细胞分离出支原体的频率是有明显差异的，传代次数越多的细胞，污染支原体的可能性就越大，这也是多次与动物血清、胰酶和已污染培养物的气溶胶接触后造成的，在原代细胞中，污染率低于4%，而传代细胞的污染率则高达57%~92%。
支原体的介绍支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞微生物，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。
革兰染色为阴性，但不易着色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。
支原体在自然界分布广泛，无细胞壁，直径为0.1-0.3μm，且形态易变，极易通过除菌过滤器。
大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，适合于偏碱条件下生存（pH7.6—8.0），对酸耐受性差，对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。
对热比较敏感在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。
细胞培养过程中遇到的支原体95%都来自于以下四种支原体：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体，其中莱氏无胆甾支原体为牛源性。
细胞受支原体污染严重（1）据统计世界范围内大约有15%-35%的细胞培养物遭受了支原体污染。
（2）从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
（3）欧洲药典规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。
细胞培养过程中支原体污染的检测及预防
细胞培养过程中支原体污染的检测及预防桂馨;钱洁;许洁;邢丽波【摘要】目的对细胞培养过程中的支原体污染进行检测并探讨相应的预防措施.方法通过DNA荧光染色和聚合酶链反应(PCR)来检测细胞培养过程中的支原体污染,分别对有支原体污染细胞、未污染细胞、小牛血清及培养基进行了实验研究.结果支原体污染细胞能被Hoechst 33342染色且PCR产物在280 bp处有特异性阳性条带.结论通过两种实验方法联合检测为判断细胞是否为支原体污染提供准确依据,并能对支原体污染做出相应预防措施.%Objective To investigate the methods for detection of mycoplasma contamination in cell culture.Methods Mycoplasma contamination was detected by DNA fluorescence staining and polymerase chain reaction (PCR) on mycoplasma contamination cells,uncontaminated cells,calf serum and culture media.Results Mycoplasma contamination cells can be stained by Hoechst 33342 and PCR assay showed specific positive bands at 280 bp.Conclusion Combination DNA fluorescence staining with PCR can effectively detect mycoplasma contamination in cell culture.【期刊名称】《同济大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(034)003【总页数】4页(P24-27)【关键词】细胞培养;支原体;检测;预防【作者】桂馨;钱洁;许洁;邢丽波【作者单位】同济大学医学与生命科学实验教学中心,上海200092;同济大学医学与生命科学实验教学中心,上海200092;同济大学医学与生命科学实验教学中心,上海200092;同济大学医学与生命科学实验教学中心,上海200092【正文语种】中文【中图分类】R184细胞培养技术是一种体外增殖细胞的常规实验技术，目前被广泛用于教学、科研和临床实验。
支原体污染细胞是什么意思
支原体污染细胞是什么意思支原体污染细胞指的是在细菌培养的过程当中，发生支原体感染污染的情况，这在培养细菌的过程当中是一个世界性的难题，常常会影响检查的结果。
支原体是最小的一种病原体，它属于原核生物，在进行细菌培养的时候，不注意就可能会被支原体出现感染细胞的情况。
所以在这方面一定要有所注意。
★污染介绍支原体是一种大小仅为0.2~0.3 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）的原核生物，在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。
当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。
★检测方法一般根据支原体种类不同，采取不同的方法进行检测。
目前常用的检测方法有：1. 试剂盒检测法：目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检测。
2. 观察细胞的形态和生长特征：支原体污染比较严重时可出现生长减慢，有的培养基pH明显变酸，并出现细胞病变，以此可依次对支原体污染进行检测，但有些情况下支原体污染引起的病变特征与病毒感染相似，因此不能准确诊断。
3. 分离培养法：大多数支原体可出现特有的典型菌落。
因而可依次尽心检测，该方法准确、可靠，但时间长，敏感性不够高。
4. DNA结合荧光素染色法：利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst 33258）侦测支原体污染。
荧光染料会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。
被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。
5. 电子显微镜和免疫电子显微镜法：电子显微镜或者免疫电镜下对样本进行观察，此法较准确，但受条件限制，时间长，敏感性不高。
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细胞培养中的支原体污染的预防及处理Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。
支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。
自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。
与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。
支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。
一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。
国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（idlawii），为牛源性。
国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。
对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。
对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。
由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。
支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。
组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基冲加入适量的抗生素。
抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。
不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。
在细胞培养过程中如果发现破碎的细胞甚多，培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应该怀疑支原体污染。
支原体污染难以观察特殊的外观变化，培养液也不浑浊。
支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。
要注意的是：支原体没有细胞壁，故作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等是不敏感的；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐火药。
对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等，氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小的抑制作用。
必要时更换所有培养用物。
通常，滤过除菌的方法对支原体是没有作用的。
由于一些微生物，如支原体，病毒等能通过滤膜，所以过滤药品仍潜在被外源微生物污染的危险，近年来，60Co辐射灭菌技术在医药、食品等领域广泛应用，由于辐射灭菌能够彻底杀灭所有微生物。
有试验证实以2Mrad辐射处理的各培养基样品达到了无菌要求，经多批培养试验，辐射灭菌安全可靠；辐射灭菌的培养基营养性能不低于过滤组，证明辐射灭菌对培养基性能无不良影响；对血清的辐射灭菌试验效果也表明60COγ射线不影响培养效果。
把干粉培养基经无菌操做定量分装于灭菌容器内，辐射后以干粉原型贮藏，不但培养基的纯净性得到保障，而且营养性能较过滤后以水溶液形式保存更稳定，对谷氨酰胺等这类水溶液不稳定者特别合适。
目前，有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片检测。
市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plas mocin（InvivoGen公司），能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。
另外，配合支原体检测试剂盒（市场上有售，如美国ICN公司的产品），可以帮助尽快发现支原体的污染。
细胞培养中支原体污染的特点及检验 2005-6-3 19:47:34 来源：生命经纬支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0．2um)并独立生活的微生物．约有1%可通过滤菌器。
支原体无细胞壁形态呈高度多形性．可为圆形、丝状或梨形。
支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。
电镜下观察支原体膜为三层结构．其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。
支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。
横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。
支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。
多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7．6—8．0)，对酸耐受性差。
对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。
支原体污染细胞后．培养液可不发生混浊．多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解．因此易被忽视。
但个别严重者，可致细胞增殖缓慢．甚至从培养器皿脱落。
为确定有无支原体污染可做如下检酗：①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察．支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。
②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。
具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗．置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。
染色后用蒸溜水洗1—2min．向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。
镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。
③电镜检查；用扫描电镜方法简便快速．也可以利用透射电镜。
④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高．但方法较为复杂支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。
它不同于细胞，也不同于病毒。
支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。
支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。
在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。
国内外研究表明，95％以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（idlawii），为牛源性。
以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。
组织细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。
支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。
支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。
对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。
InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin 能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。
对于支原体污染的细胞，可以采取补救措施：1 抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24-48小时，再换入常规培养液，有时可能有效。
推荐用量：庆大霉素 200ug/ml ,四环素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。
对于支原体污染抗生素应用，预防性应用比污染后使用好。
2 加温除菌：根据支原体耐热性能差的特点。
将受支原体污染的细胞置于41度中作用5-10小时可以杀灭支原体。
但由于41度对培养细胞本身也有较大的影响，故处理前，应先进行预试验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。
细胞支原体污染一般情况及预防措施信息来源：本站原创更新时间：2004-10-19 2:28:00细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。
而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。
但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。
各国细胞库支原体污染的统计表，如下：国家受支原体污染(%) 报告年度USA－FDA 15 1993(past 30 years)USA－ATCC 15-20 1992Japan－(IFO，RIKEN，JCR) 80~30~22 1981 1987-19931998Germany－DSM 36 1990-1994Argentina 65 1987Israel 32 1986-1993China 95 1990造成支原体高污染率的原因为：1.支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式4.细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染5.研究或操作人员忽略污染问题而支原体污染了来源:1. 已受污染的细胞2. 操作人员的疏失3. 已受污染的培养基、血清4. 操作环境不良、实验器具不洁等由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。