Nisin产生菌的筛选及鉴定

PENG Qi－an，WANG Bu－yun，JIANG Lei，CHENG Xun （School of Environment ＆ Urban Construction， Wuhan University of Science and Engineering，Wuhan 430073， China）
结果 + + + + + +
特征反应 SAL （ 水 杨 素 ） TRE （ 海 藻 糖 ） PUL （ 支 链 淀 粉 ） MLZ （松 三 糖 ） XYL （ 木 糖 ） OPT （ 奥 普 托 琴 ） 10B （10％胆 汁 ） ARG（ 精 氨 酸 ） NOV（ 新 生 霉 素 ） MAN（ 甘 露 醇 ） SOR （ 山 梨 醇 ） ARA （ 阿 拉 伯 糖 ）
《伯杰氏细菌学鉴定手册》（第八版），将 KY08 菌株初步鉴定为乳酸链球菌种的一个亚种。
关键词：Nisin 产生菌；筛选；鉴定
中 图 分 类 Baidu Nhomakorabea ：Q93－331
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114 （2009 ）07－1619-02
Screening and Identification of Nisin－producing Strain
菌 （Micrococcus flavus）NCBI8166 为 指 示 菌 对 其 发 酵 产 物 进 行 效 价 测 定 ，经 反 复 筛 选 ，获 得 1 株 稳 定 的
高产菌株 KY08，产 Nisin 效 价 为 813IU·mL－1。 用 细 菌 鉴 定 系 统 Vitek－32 进 行 生 化 特 征 鉴 定 ，并 参 照 了
图 2 细菌显微照相（640×）
试验呈阴性，革兰氏染色阳性，无芽孢，不运动。 2．3．2 菌 种 生 化 鉴 定 使 用 微 生 物 鉴 定 系 统 Vitek－32 的革兰氏阳性菌鉴定卡（GPI）对 KY08 进 行鉴定，鉴定结果如表 3。
表 3 Vitek-32 GPI 鉴定卡鉴定结果
特征反应 PB（蛋 白 胨 基 质 ） HCS （ 半 纤 维 素 酶 ） 40B （40％胆 汁 ）
基； 筛选培养基，M17G 培养基添加 0．004％溴甲酚 紫 和 50IU·mL－1 的 Nisin；发 酵 培 养 基 ，采 用 CM 培 养基；效价测定培养基，采用 SI 培养基。
4）主要试剂及仪器。 Nisin 标准品，浙江银象生 物工程有限公司；Vitek－32 细菌鉴定系统， 法国生 物梅里埃公司。 1．2 方法 1．2．1 Nisin 产生菌的筛选 将新鲜牛奶样品接种 于含 50IU·mL－1 Nisin 的 M17G 液体增殖培养基中， 稀释涂布于选择培养基上 30℃恒 温 培 养 24～48 h； 对培养后能使周围紫色培养基变黄的单菌落编号 保藏。 将初筛菌接入发酵培养基中，摇瓶发酵测定 其效价。 并将复筛菌转接，摇瓶发酵，对产 Nisin 效 价较高、稳定的菌株进行鉴定。 1．2．2 菌 种 鉴 定 将 目 的 菌 株 平 皿 划 线 活 化 12 h 后，观察单菌落形态，镜检后进行接触酶试验和革 兰氏染色。 挑取单菌落用 Vitek－32 鉴定系统进行生 化鉴定。 参照文献［4］的参数进行分析。
1 材料与方法
1．1 材料 1）分离样品的来源。 未消毒鲜牛奶，采自徐州
市上坝村奶牛养殖基地。 2） 菌 种 。 黄 色 微 球 菌 （Micrococcus flavus）
NCBI8166，本实验室保藏。 3）主要培养基 。 ［2－3］ 乳酸乳球菌试管斜面、平板
分 离 、 液 体 种 子 及 增 殖 培 养 基 均 选 用 M17G 培 养
图 1 初筛菌落
表 1 初筛菌株发酵产物效价
效价 IU·mL-1
663 371 283 453 772 802 786
菌株 编号 KY08 KY09 KY10 KY11 KY12 KY13 KY14
效价 IU·mL-1
822 552 677 791 298 566 414
菌株 编号 KY15 KY16 KY17 KY18 KY19 KY20
Abstract： More than 20 strains were screened by fresh milk samples on M17G culture medium． The antimicrobial activities of their fermentation products were tested by the agar-diffusion method， using Micrococcus flavus NCBI8166 as an indicating strain． One stable and high－yield strain was obtained and named as KY08． Its production was up to 813 IU·mL－1． According to the results of automated microbiological analysis instrument－Vitek－32 and Berges Bacteriology （the eighth edition）， KY08 was tentatively identified as a subspecies of Streptococcus lactis． Key words： Nisin－producing strain； screening； identification
URE （ 尿 素 ） DEX （ 葡 萄 糖 ） RAF （ 棉 子 糖 ）
SUC（ 蔗 糖 ） PYR （ 丙 酮 酸 ） MEL （ 蜜 二 糖 ）
RIB （ 核 糖 ） BAC （ 杆 菌 肽 ） 6NC（6％氯 化 钠 ） ESC （ 七 叶 灵 ） TZR （ 红 四 氮 唑 ）
LAC （ 乳 糖 ）
效价 IU·mL-1
812 740 690 386 758 505
2．2 复筛及稳定性考察结果 将复筛到的 KY06、KY08、KY15 菌株分别转 接
至第五代，分别命名为 KY06－1～KY06－5，KY08－1～ KY08－5，KY15－1～KY15－5， 摇瓶发酵后测定效价， 考察其稳定性，结果见表 2。 通过分析比较，KY08 菌 株的效价最高且相对稳定，平均效价为 813 IU·mL－1。
（责任编辑 郑 威）
效价 IU·mL-1
791 826 776 693 548
2．3 菌种鉴定结果 2．3．1 KY08 菌株的细菌学鉴定 在 M17G 培养基 上活化 1 d 后 KY08 长出的菌落 准0．8～1．2 mm，乳白 色，圆形，隆起，较光滑，湿润，边缘整齐；在显微镜 下观察（图 2），细胞卵球型 ，直 径 为 0．7～1．5 μm，沿 链长轴方向生长，每条链上有 2～20 个细胞，接触酶
参考文献： ［1］ REUNANEN J， SARIS P E J． Bioassay for nisin sausage： A
shelf study of nisin in cooked sausage ［J］． Meat Science， 2004，66（4）：515－518． ［2］ DODD H M，HAO Z． Improved medium for Lactic streptococci and their bacteriophages ［J］． App1 Environ Microbiol，1992，8 （11）：3683－3693． ［3］ 尤 新 ． 功 能 性 发 酵 制 品 ［M］． 北 京 ： 中 国 轻 工 业 出 版 社 ， 2000．314－331． ［4］ 布 坎 南 R E，吉 本 斯 N E．伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册 ［M］．第 八 版．中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 ，译．北 京 ：科 学 出 版 社 ，1984．677－701．
菌株，即能在筛选培养基上生长，颜色由紫色变黄 色的菌落（其余为杂菌，图 1）。对其进行命名 KY01～ KY20， 初筛后摇瓶发酵效价见表 1。 由表 1 可知， KY06、KY08、KY15 效价较高， 均超过 800IU·mL－1， 为 3 株乳酸链球素高产菌。
菌株 编号 KY01 KY02 KY03 KY04 KY05 KY06 KY07
收 稿 日 期 ：2009－02－26 作 者 简 介 ：彭 其 安 （1981－ ）， 男 ，湖 北 潜 江 人 ，助 教 ，硕 士 ，（ 电 话 ）13297976765 （电 子 信 箱 ）pqa2002＿＠163．com 。
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湖 北 农 业 科学
2009 年
2 结果与分析
2．1 初筛结果 经过初筛， 从新鲜牛奶样品中共筛选出 20 株
INU（ 菊 糖 ） CEL （ 纤 维 二 糖 ） CAT（氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 ）
注 ：“+”为 阳 性 反 应 ；“－”为 阴 性 反 应 。
3 小结
结果 + + + + + -
本实验室筛选出的菌株 KY08 细胞直径比相关 资料记载值 0．5～1．0 μm 稍大，可利用蛋白胨 、葡 萄 糖、蔗糖、乳糖、纤维二糖、奥普托琴、七叶灵。 不利 用棉子糖、菊糖、山梨醇，在含 6％的 NaCl 或 40％胆 汁培养基中不生长，不能水解精氨酸，能产 Nisin。与 文 献 ［4］ 中 乳 酸 链 球 菌 及 其 亚 种 的 形 态 特 征 和 生 化 特性描述一致，初步鉴定该菌为乳酸链球菌亚种。
第 48 卷第 7 期 20第09 7年期7 月
湖北农业科学 Hubei Agricultural Sciences
Vol． 48 No.7 Jul．，2009
Nisin 产生菌的筛选及鉴定
彭其安，王布匀，蒋 磊，程 勋 （武汉科技学院环境与城建学院， 武汉 430073）
摘要：从新鲜牛奶样品中用 M17G 筛选培养基定向筛选出 20 株目的菌株。 应用琼脂扩散法，以黄色微球
表 2 复筛菌株效价
菌株 编号 KY06-1 KY06-2 KY06-3 KY06-4 KY06-5
效价 IU·mL-1
825 790 763 712 654
菌株 编号 KY08-1 KY08-2 KY08-3 KY08-4 KY08-5
效价 IU·mL-1
842 822 814 803 786
菌株 编号 KY15-1 KY15-2 KY15-3 KY15-4 KY15-5
乳 酸 链 球 菌 素 （Nisin）是 某 些 乳 酸 链 球 菌 产 生 的具有 34 个氨基酸残基的多肽类物质［1］。 对引起食 品腐败的大多数革兰氏阳性菌有很好的抑制作用， 属于高效、无毒副作用的天然生物防腐剂。 本文根 据 Nisin 产生菌中 Nisin 编码 基 因 和 蔗 糖 发 酵 基 因 紧密连锁的原理，在添加 Nisin、蔗糖及溴甲酚紫的 M17G 选择培养基上，从新鲜牛奶样品中快速、准确 地筛选出目的菌株，并进行了复筛、稳定性考察和 生理生化特征鉴定。