Nisin产生菌的筛选及鉴定
Nisin的生产_提纯和检测
Nisin的生产、提纯和检测李增利(江苏科技大学生化部,镇江212004)摘要:Nisin是一种由乳酸乳球菌产生的羊毛硫氨酸类细菌素,在许多国家被许可作为生物防腐剂。
Nisin 的产量受许多因素的制约,如产生菌性能、培养基组成(碳源、氮源、磷源和阳离子)、发酵条件(pH、温度、搅拌、通风)、发酵类型(分批发酵、连续发酵、自由细胞、固定化细胞)等;大规模回收和纯化Nisin主要采用一些基于吸附-解析或者相分配原理的方法;最常用的定量检测Nisin的方法主要有生物分析法和免疫检测法,采用各种特定nisin抗体的免疫检测方法具有迅速、灵敏、准确等特性并能实现Nisin的在线检测。
关键词:乳酸乳球菌,Nisin,发酵生产,提纯,检测,免疫分析Production,Purification and Quantification of NisinLi Z engli(Dept.of Biochemical Engineering,Jiangsu University of Science and T echnology,Zhenjiang Jiangsu212004)Abstract:Nisin,a lantibiotic-type bacteriocin produced by various strains of Lactococcus lactis ctis,is licensed for use as a food biopreservative in many countries.The m ore recent developments in the production,purification and determination of nisin were reviewed.Nisin production was affected by numerous factors,including the producing strain,com position of the fermentation medium(carbohydrate,nitrogen and phosphorus s ources,cations),fermentative conditions(pH,tem perature,ag2 itation and aeration)and fermentation types(batch and continuous culture using free cell or imm obilized cell).Several integrat2 ed processes based on ads orption/des orption or on phase partitioning have been built for recovery and purification of nisin.The m ost comm on methods of nisin detection and quantification are Bioassay,such as agar diffusion ing immunological tech2 niques many immunoassay using the specific anti-nisin antibodies were developed and used for rapid and sensitive detecting and quantifying of nisin,and suitability for distinguishing active from inactive forms,and for the on-line m onitoring of nisin.K ey w ords:Lactococcus lactis ctis,Nisin,Fermentative production,Purification,Quantification,Immunoassay 随着“天然化”食品的发展,天然食品防腐剂倍受青睐。
乳酸链球菌素的研究进展
Ｎｏ．１．２００６乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）是世界上公认安全的防腐剂，是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。
乳酸链球菌素本身具有许多优良性质：首先，容易被人体消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶所降解，不会在体内蓄积而引起不良反应，并且对食品的色、香、味等无不良影响［１－２］。
使用它还可以降低杀菌温度，减少热处理时间，因此能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状，同时还可节省能耗。
Ｎｉｓｉｎ本身具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏，Ｎｉｓｉｎ作为一种理想的天然防腐剂获得越来越广泛的应用。
１乳酸链球菌素的研究现状１．１乳酸链球菌素的分子结构乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）的分子式为Ｃ１４３Ｈ２２８Ｎ４２Ｏ３７Ｓ７，含有３４个氨基酸残基，分子量为３５１０Ｄａ。
Ｎｉｓｉｎ在天然状态下主要有两种形式，分别为ＮｉｓｉｎＡ和ＮｉｓｉｎＺ［３］，它们之间的差别在于氨基酸顺序中第２７位氨基酸不同，在ＮｉｓｉｎＡ中是组氨酸，在ＮｉｓｉｎＺ中是天冬氨酸，在其基因结构上的第１４８位脱氧核苷酸不同是造成差别的根本原因。
一般而言，在同样浓度下，ＮｉｓｉｎＺ的溶解度和抑菌能力比ＮｉｓｉｎＡ要强。
１．２乳酸链球菌素的性质１．２．１物理和化学性质Ｎｉｓｉｎ的溶解性、稳定性都与溶液的ｐＨ值密切相关。
Ｎｉｓｉｎ的溶解度随ｐＨ值的下降而提高，ｐＨ值２．５时溶解度为１２％，ｐＨ值为５．０时下降到４％，在中性及碱性条件下几乎不溶解［４］。
实验结果表明，Ｎｉｓｉｎ在酸性条件下极为稳定，ｐＨ２．０条件下可耐受高温处理（１２１℃，１５ｍｉｎ），而无活力损失，而在中性或碱性条件下即发生失活。
１．２．２生物学特性当α－胰蛋白酶、胰酶制剂和枯草杆菌肽作用Ｎｉｓｉｎ后，会使其失去活性，但羧肽酶Ａ、羧肽酶Ｅ、肠肽酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶对Ｎｉｓｉｎ无作用。
Ｈｕｒｓｔ报道，Ｎｉｓｉｎ对α－凝乳蛋白酶、胰酶、李红，赵春燕＊（沈阳农业大学，沈阳１１０１６１）摘要：乳酸链球菌素是某些乳链球菌产生的一种多肽物质，是一种高效、无毒副作用的天然生物防腐剂。
Nisin的发酵生产条件和纯化研究
Nisin的发酵生产条件和纯化研究作者：葛亚中… 文章来源：China Food Additiv 点击数：617 更新时间：2007-12-3 21:37:27 Nisin,又称为乳酸链球菌素,乳酸链球菌肽或尼可素,是由某些乳酸菌(Lacrococcus lactis)在代谢过程中合成的小分子肽,其成熟分子仅含有34个氨基酸残基;在天然状态下,Nisin主要有两种形式,分别为NisinA和NisinZ,它们之间的差别仅在于氨基酸序列中第27位的氨基酸不同,在NisinA中是组氨酸,在NisinZ中是天冬氨酸。
NisinA的结构如图1所示:Nisin可以抑制食品中革兰氏阳性菌的生长,如微球菌、分枝杆菌、棒杆菌、葡萄球菌和乳酸菌等,对于梭状芽孢杆菌也有很好的抑制作用,能有效阻止孢子的萌发和毒素的生成。
Nisin对革兰氏阴性菌基本无影响,但通过和某些络合剂(如ED-TA或柠檬酸)等协同作用抑制之。
因此,Nisin可显著的延长食品的保存时间或缩短杀菌所需的时间,在乳制品、肉制品、罐装食品及植物蛋白食品等的保藏与防腐方面都有很好的作用。
对Nisin毒理和生物学的研究表明,使用Nisin的安全性较高。
它的半致死剂量(LD50)约为7g/kg,与普通食盐相近。
1969年FAO/WHO 批准Nisin为食品添加剂,到目前为止,已有50多个国家和地区批准使用,这也是现阶段唯一被许可用于防腐剂的细菌素(bacteriocin)。
1953年,Nisin开始工业化生产,当时最大的生产者是英国的Aplin&Barrett公司,其产品Nisaplin 的效价为1×106IU/g(1IU相当于0. 025μg纯Nisin)。
丹麦Chr Hansen公司生产的Nisin制品-Chrisin,效价为0.9×106IU/g。
一、Nisin的发酵生产Nisin的生产是和生长密切相关,它通常发生在整个生长阶段。
从牛奶中分离纯化高产nisin的菌株,并进行菌种的初步鉴定
项目编号：“研究创新实验”项目申请书项目名称从牛奶中分离纯化高产nisin的菌株，并进行菌种的初步鉴定项目负责人年级、专业联系电话电子邮件指导教师（姓名及职称）填表日期 2011 年 12 月 15 日国家级生物实验教学示范中心制表填表说明1、《研究创新实验项目申请书》要按顺序逐项填写。
填写内容要实事求是，讲究诚信，不能有雷同；表达要明确、严谨。
空缺项要填“无”。
2、格式要求：（1）一律用A4纸打印，于左侧装订成册。
（2）字体：中文用宋体，英文和数字用Times New Roman字体，行距为1.5倍行距。
（2）一级标题：标题编排应采用“（一）、（二）、（三）”等依次分级编号，左起缩进2字符，宋体加黑，字号为小四号。
（3）二级标题：标题编排应采用“1、2、3、”等依次分级编号，左起缩进2字符，宋体加黑，字号为五号。
（4）内容：字号为五号，每段第一行左起缩进2字符。
3、申请参加“研究创新实验”项目团队人数为2-3人（1人为项目负责人，参与合作研究者1-2人）。
并在诚信承诺书上签名。
4、申请参加“研究创新实验”项目的个人或团队必须聘请教师作为项目指导教师，并请指导教师在申请书和诚信承诺书上签名。
5、八、九项不填。
6、“项目编号”由实验中心填写。
7、“研究创新实验诚信承诺书”单独一页。
研究创新实验诚信承诺书实验项目：从牛奶中分离纯化高产nisin的菌株，并进行菌种的初步鉴定开放实验室学生在遵守“学生实验守则”、“学生实验习惯评定方法”、“实验室开放管理规定”等各项规章制度的同时，并严格遵守以下各项规定：1、能够在指导教师的指导下自主完成文献查阅与整理、方案设计、实验实施、数据处理和论文撰写等工作。
2、开放实验室学生必须填写“实验室开放记录簿”，进实验室须穿实验服。
3、在开放实验室实验所使用的材料、试剂、玻璃仪器和仪器设备不准带出（搬出）该实验室。
试剂使用后须放回原处，玻璃仪器使用后须刷洗干净并放回原处。
乳酸链球菌素的研究进展
乳酸链球菌素的研究进展摘要：本文介绍了乳酸链球菌素（Nisin）的分子结构、性质、抗菌机理和生产的研究进展；综述了乳酸链球菌素在食品工业中的应用现状，并对其应用前景进行展望，以期为乳酸链球菌素的进一步研究提供参考.关键词：乳酸链球菌素，抗菌机理，食品工业，应用Abstract：Nisin is an antibacterial multipeptide produced by certain strain of Lactococcus lactis．It is a high efficiency and nopoisonous effect natural biopreservative．This paper comprehensive described research exploitation and progress about produce and applies of nisin．Key words：nisin；preservative；research and progress乳酸链球菌素(Nisin)是世界上公认安全的防腐剂，是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。
乳酸链球菌素本身具有许多优良性质：首先，容易被人体消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶所降解，不会在体内蓄积而引起不良反应，并且对食品的色、香、味等无不良影响。
使用它还可以降低杀菌温度，减少热处理时间，因此能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状，同时还可节省能耗。
Nisin本身具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏，Nisin 作为一种理想的天然防腐剂获得越来越广泛的应用1、乳酸链球菌素的研究现状1．1乳酸链球菌素的分子结构Nisin）亦称乳酸链球菌肽或音译为尼辛，是目前最常用的生物防腐剂，它是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成。
分子式为C143H228N42037S7，分子量为3510。
Nisin的生产、提纯和检测
Nisin的生产、提纯和检测生产、提纯和检测Nisin是一个复杂的过程，要确保其高纯度和质量。
以下是Nisin的生产、提纯和检测的一般步骤。
生产Nisin的过程通常涉及到以下几个关键步骤：1. 培养Lactococcus lactis菌株：Nisin是由Lactococcus lactis菌株产生的。
首先，培养菌株需要提供合适的培养基和环境条件，以支持细菌的生长和产生Nisin。
2. 收集细菌发酵液：当细菌培养达到一定密度时，培养液中的细菌会开始产生Nisin。
细菌发酵液通常由菌体和培养基组成。
3. 分离细菌发酵液中的Nisin：将细菌发酵液通过离心等方法进行分离，以获得含有Nisin的上清液。
上清液中的其他细胞碎片和杂质也需要清除。
4. 浓缩和提纯Nisin：通常使用溶剂提取和分离技术，如萃取、硅胶柱层析和沉淀等方法，以获得高纯度的Nisin。
5. 干燥和粉末化Nisin：将提纯的Nisin溶液经过浓缩和干燥处理，以得到纯净的粉末状Nisin产品。
Nisin的质量控制是确保其安全性和有效性的重要环节。
以下是常用的Nisin质量检测方法：1. 高效液相色谱法（HPLC）：通过HPLC检测可以确定Nisin的含量和纯度，以及是否含有其他杂质。
HPLC是一种高效、精准、敏感的分析方法。
2. 质谱法（mass spectrometry）：质谱法可以确定Nisin的分子结构和分子量，以及检测其含量和纯度。
质谱法还可以用于分析Nisin的降解产物和代谢产物。
3. 生物活性测定：通过对Nisin溶液的抑菌能力进行测定，可以评估其生物活性和抗菌效果。
常用的方法包括抑菌圈直径测定和最小抑菌浓度（MIC）测定。
4. 融点测定：融点测定可以用于鉴定Nisin的物理性质和纯度，同时也可以检测其热稳定性。
通过上述生产、提纯和检测步骤，可以获得高质量的Nisin产品，以满足食品工业和医药领域对抗菌剂的需求。
制定严格的质量控制标准和流程，可以确保Nisin的质量和安全性，以保障其应用效果。
产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌的等离子体诱变选育
产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌的等离子体诱变选育作者：张拴力扈士海王素欣张桂彦崔云赵地顺来源：《河北科技大学学报》2015年第06期摘要：采用产乳酸链球菌素（Nisin）的乳酸乳球菌为出发菌株，在含有高浓度Nisin的固体平板上，筛选出了耐受10 000 IU/mL Nisin的乳酸乳球菌菌株，其发酵单位达到1 680IU/mL。
以此菌株为起始菌株进行常压、室温等离子体诱变，利用24方孔深孔板快速筛选高产Nisin的突变株。
结果表明，在诱变菌株的存活率为3%的条件下获得的突变株的正突变率达到27.3%。
通过摇瓶发酵进一步考察初步筛选的正突变株的Nisin发酵水平，发现有一个突变株发酵Nisin的活性达到6 120 IU/mL。
关键词：应用微生物学；乳酸链球菌素；乳酸乳球菌；常压室温等离子体；诱变；存活率中图分类号：Q815 文献标志码：AAbstract：With Nisin-producing Lactococcus lactis as the starting strain， the strain with tolerance to 10 000 IU/mL Nisin is selected on high-concentration Nisin medium. The Nisin titer of the strain is up to 1 680 IU/mL. As the starting strain， the strain is further treated by atmospheric and room temperature plasmas（ARTP） and mutant strain for high yield of Nisin is quickly selected with 24 well culture plate. At a survival rate of 3%， the positive mutation rate of the Lactococcus lactis is 273% compared with the starting strain. The results of shake flask culture further confirmed that one positive mutant strains could produce 6 120 IU/mL Nisin.Keywords：applied microbiology； Nisin； Lactococcus lactis； atmospheric and room temperature plasma （ARTP）； mutant； survival rate乳酸链球菌素（Nisin）是唯一得到国家食品药品监督管理总局批准的可商业化生产的细菌素。
Nisin的生产、提纯和检测
随着/ 天然化0食品的发展 , 天然食品防腐剂倍 受青睐。Nisin 是由乳酸乳球菌乳酸亚种 ( Lactococ cus lactis subsp. lactis) 菌株 产生 的一 种肽 类细菌 素[ 1] , 属于 Lantibiotics 类 , 首次发现 于 1928 年, 是 唯一被 FDA 确认为 GRAS 的细菌素产品。Nisin 与 敏感菌细胞膜膜脂相互作用, 通过结合、 插入、 孔道 形成等多步过程形成孔道复合物
5中国食品添加剂6
China Food Addit ives
2004 No1 4
Nisin 的生产、 提纯和检测
李增利
( 江苏科技大学 生化部 , 镇江 212004)
摘 要 : Nisin 是一种 由乳酸乳球菌产生的 羊毛硫 氨酸类细 菌素 , 在许 多国家被 许可作 为生物 防腐 剂。Nisin 的产量受许多因素的制约 , 如产生菌性能、 培养基组成 ( 碳 源、 氮源、 磷源和阳离子 ) 、 发酵条件 ( pH 、 温度、 搅 拌、 通 风) 、 发酵类型 ( 分批发酵、 连续发酵、 自由细胞、 固定化细胞 ) 等 ; 大规模 回收和纯化 Nisin 主要采用一些基于吸附 - 解析或者相 分配原理的方法 ; 最常用的 定量检测 Nisin 的方 法主要 有生物 分析法和 免疫检 测法 , 采用 各种特 定 nisin 抗体的免疫检测方法具有迅速、 灵敏、 准确等特性并能实现 Nisin 的在线检测。 关键词 : 乳酸乳球菌 , Nisin, 发 酵生产 , 提纯 , 检测 , 免疫分析
Production, Purification and Quantification of Nisin
Li Zengli ( Dept . of Biochemical Engineering, Jiangsu University of Science and T echnology, Zhenjiang Jiangsu 212004)
乳酸链球菌素的研究现状
乳酸链球菌素的研究现状乳酸链球菌素的生产及研究现状吴江乳酸链球菌素(Nisin) 是从乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽抗菌素类物质,是一种世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。
1944 年Mattick 和Hirsch 发现血清学N 群中的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质,命名为N-inhibitory Substance 即N 群抑菌物质,简称为Nisin。
1953 年由英国的阿普林和巴雷特公司首次以商品的形式出售了这种新的防腐剂———乳酸链球菌素。
1969 年,FAO/ WHO 食品添加剂联合专家委员会批准Nisin作为一种生物型防腐剂应用于食品工业。
1988 年美国食品和药物管理局(FDA) 也正式批准将Nisin应用于食品中。
我国在GB2760 —86 中批准Nisin可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品、肉制品中。
迄今为止,Nisin 已在全世界约60 多个国家和地区被用作防腐剂。
1.乳酸链球菌素的生产1.1 菌种的筛选和改良乳酸链球菌广泛存在于天然牛奶及乳酪和酸奶中, 从牛奶场取生牛奶样品, 加以稀释, 然后在含有检测菌及吐温20 为扩散剂的固体检测培养基表面进行涂布, 在30 ℃培养24h 后, 测量抑菌圈直径, 挑取抑菌圈直径与菌落直径比较大的菌株再进行平板划线分离, 选取单个菌落接至试管斜面保存, 然后, 逐一测定菌株的Nisin 效价。
这样便筛选出产Nisin 的乳酸链球菌菌株。
若想获取高产菌株, 可对原始菌株再进行诱变处理。
1.2 培养基和培养条件不同的乳酸链球菌株,其Nisin 的效价也有显著的变化,所适应的发酵条件也各有所不同,国内外这方面的研究较多,综合来看,在C 源上,最适合的主要为蔗糖和可溶性淀粉,其添加量随菌株的不同也各有所不同。
最适N 源,主要为酵母膏,添加量1 %左右,另外酵母膏及吐温80对细胞的生长及Nisin 的产生均有利。
最适P 源普遍认为KH2PO4最合适,添加量一般≤5 % ,使用KH2PO4主要有两方面优点:即可创造良好的pH环境;可提高Nisin 的产生。
nisin
取牛奶样品
含检测菌和吐温20 的固体检测基
30 ℃,24h
平板划线分离 选取单个 菌落
挑取菌株
测抑菌圈直径
接至试管斜面
保存
逐一测定菌株的效价，筛选出产 nisin的乳酸链球菌菌株
Nisin发酵生产过程
发酵过程
连续发酵
连续发酵可以维持菌体的高生长率,因此细菌素产率在连续发 酵中应该有改善。和分批发酵比较起来,连续发酵可使Nisin效 价增加,Nisin生产能力增强
谢谢
请大家批评指正~
Nisin表达基因
Nisin基因表达过程
Nisin表达基因
Nisin基因表达过程
nisB
编码
NisB脱水酶
脱氢丙氨酸Dha β-甲基脱氢丙氨酸Dhb
色氨酸 苏氨酸
nisC
编码
NisC环化酶
ALA-S-ALA羊毛硫氨酸 ABU-S-ALA β-甲基羊毛硫氨酸
Dha+半胱氨酸
Dhb+半胱氨酸
Nisin表达基因
5.0～5.5或6.5左右
温度
pH
Nisin分离手段
常规手段
NaCl饱和的乳酸链 球菌发酵液
正丙醇提取2次
丙酮沉淀
乳酸菌肽粗制品
溶于 0.05mol/LHAcNaAc(pH3.6)的缓 冲液中
用缓冲液透析24h
喷雾干燥，研细
离心后 柱层析
制成成品
Nisin分离手段
其他分离手段 泡沫分离：通入到乳酸链球菌素发酵液中时一部分二氧化碳能够溶于水能够产生 一系列的临时盐，在某种意义上也能使蛋白分子更容易从发酵液中分离，并丐分 离后不会有大量的盐残留，也不影响后期产品进一步分离。
小结
乳酸链球菌素(Nisin)的特性及应用
1Nisin的概述乳酸链球菌素——Nisin从1980年起被FDA允许用作食品添加剂[1]。
Nisin最早发现于1928年[2]，1947年被命名为Nisin[3]，第一次商业化应用是在1957年，由Aplin&Barrett出品，其产品被命名为Nisaplin。
目前，已经有超过60个国家和地区批准Nisin作为一种纯天然食品防腐剂和保鲜剂使用，被广泛用于乳制品、肉制品、罐装食品、酒精饮料、酱菜和巧克力中。
Nisin在1971年由Gross和Morrell确定为含有34个氨基酸的小分子肽，存在翻译后修饰，一般带有一个羊毛硫氨基酸，四个β-甲基羊毛硫氨基酸和一些不常见的氨基酸残基如脱氢丙氨酸和脱氢酪氨酸。
Nisin通常带有硫醚键形成的分子内环，这种环状结构，是其破坏细胞膜完整性的一个重要的性质，这种环状结构维持了肽的刚性，并保护它不受蛋白酶和热降解的影响[4-5]。
Nisin对部分革兰氏阳性菌如单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和藤黄微球菌(Micrococcus luteus)等具有较强的抑制作用，其本身是一种无臭无色无味的低毒物质[6-9]。
一般认为Nisin对芽孢的杀灭作用大于对营养型微生物的杀灭作用，这是由于它具有抑菌作用而非杀菌作用[10]。
Nisin有多种不同的类型，A、Z、F、Q和U型等，Nisin Z和A的区别在于第27位的氨基酸由组氨酸变为天冬酰胺（His27Asn），Nisin P由Streptococcus suis和Streptococcus gallolyticus subsp.pasteurianus产生[11-12]。
乳酸链球菌素（Nisin）的特性及应用■李仲玄程强姚蒙蒙胡聪买尔哈巴·艾合买提王晓冰张日俊斯大勇*（中国农业大学饲料生物技术实验室动物营养学国家重点实验室，北京100193)摘要：乳酸链球菌素（Nisin）是食品药品监督管理局(FDA)允许用作食品添加剂的天然肽类细菌素，其在畜牧和医学中同样具有巨大的应用前景，但Nisin在应用中仍存在较多问题，例如它的降解、与食品成分的相互作用均会限制它的使用，文章简要讨论Nisin在应用中存在的问题以及新进展和新前景。
乳酸链球菌素的研究进展
乳酸链球菌素的研究进展作者：赵娜来源：《吉林农业》2011年第12期【摘要】乳酸链球菌素是一种由乳链球菌产生的细菌素，作为一种天然生物防腐剂，由于高效性和无毒性使其广泛应用于食品及医药工业中。
本文从其分子结构、抑菌机制、分离提纯方法、应用等方面加以阐述，并对其发展前景进行了介绍。
【关键词】乳酸链球菌素研究进展乳酸链球菌素（Nisin）又称乳酸链菌肽或尼生素，是某些乳酸链球菌菌株代谢产生的一种小分子抗菌肽，它对许多包括金黄色葡萄球菌、溶血球菌、肉毒梭菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、李斯特菌在内的多种革兰氏阳性食物腐败菌和病原菌都有强烈的抑杀作用。
目前，我国食品添加剂标准化委员会批准使用的微生物防腐剂只有Nisin和纳他霉素。
1990年，我国将其列为国标GB2760-86品种，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品生产中。
Nisin对热稳定，使用后在消化道内很快被蛋白水解酶消化成氨基酸，不会产生抗性和过敏反应，其作为一种理想的天然防腐剂已获得越来越广泛的应用。
1.Nisin的分子结构乳酸链球菌素的分子式为C143H288N42O37S7，含有34个氨基酸残基，相对分子量为3510道尔顿，前体分子含有57个氨基酸残基，其中23个残基位于引导区，34个位于结构区。
其活性分子常以二聚体和四聚体的形式出现，相对分子量为7000道尔顿和14000道尔顿。
Nisin的结构中含有5个硫醚键形成的分子内环，其中一个是Ala-S-Ala，称为羊毛硫氨酸（Lan），其他4个是Abu-S-Ala，称为甲基羊毛硫氨酸（Melan）。
在第5位和第33位残基各有一个脱氢丙氨酸（Dha），第2位残基有一个分甲基脱氢丙氨酸（Dhb）。
天然Nisin主要有NisinA和NisinZ形式存在。
NisinA和Z差别在于氨基酸顺序中的第27位氨基酸不同，在NisinA中是组氨酸，NisinZ中是天冬氨酸。
Buchman等人克隆和测定了NisinA结构基因DNA 序列以后，发现成熟分子中的脱氢丙氨酸、β-甲基脱氢丙氨酸、羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸等稀有氨基酸是经翻译后修饰产生的。
乳酸链球菌素_Nisin_抑菌作用及其抑菌机理的研究
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｎｉｓｉｎ
．．
ＬＵ Ｓｈｕｘｉａ＊， ＢＡＩ Ｚｅｐｕ， ＤＡＩ Ｙｉ， ＦＥＮＧ Ｊｉａｎｇｂｏ， ＨＵＡＮＧ Ｙｉ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１６１， Ｃｈｉｎａ）
细菌素（Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ）是细菌通过核糖体合成机制产 生并分泌到环境中的一类具有抑（杀）菌活性的代谢产物， 通常是低分子量的多肽或者蛋白类物质［１］。
乳酸链球菌素（Ｎｉｓｉｎ）是一种由乳酸乳球菌乳酸亚种 （Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｌａｃｔｉｓ）合成的细菌素，是一种安 全的生物防腐剂［２］，已被应用于食品酿造行业。乳酸乳球 菌乳酸亚种 Ｔ０６２５ 菌株系新鲜大白菜叶片上筛选得到， 具有 Ｎｉｓｉｎ 高产特性。
近年来，国内外对乳酸链球菌素进行了广泛研究，但 其抑菌机理尚未完全清楚［３］。本试验对乳酸链球菌素的抑 菌性能进行了研究，并通过指示菌培养液蛋白含量测定、 电导率测定、透射电镜观察、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳及图谱分析 等方法较系统地研究了 Ｎｉｓｉｎ 抑菌过程和抑菌机理，确定 了乳酸链球菌素的作用位点，为乳酸链球菌素的进一步研 究和应用提供了参考依据。 １ 材料与方法 １．１ 试验材料 １．１．１ 菌种
按 １．２．４ 操作，加入提取物后测定 ０ｈ、３ｈ 和 ９ｈ 时培养 液的电导率值，同时设正常培养 ０ｈ、３ｈ 和 ９ｈ 时金黄色葡 萄球菌培养液的电导率值为对照。 １．２．７ 乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌培养液蛋白含量的
影响
Nisin抗性嗜热链球菌的筛选
１ ．１ 生产性能鉴定采用的感官评定方法 选择５ ．５ ５． 名有
食 品 品尝经 验 的人 ，组 成 品尝 小组 ， 分别 从乳 清析 出 、 口感和凝块硬度等方面进行评定，每一项的总分 为 ｌ ， ０分
将各 项 的评分 加和后 平均 ，在 １ ～８之 间为 “ ” ０ 好 ，在
７～５之 间 为 “ 以接 受 ” 可 ，４～０为 “ 可接 受 ” 不 。 １ ．２ 遗传 性状稳定性实验采用 的感官评定方法 选 ．５ ５．
Ｉｏａｉｎｏ ｓ －ｅ ｉｔｎ Ｓ ｒｐｔｃ ｃ ｕ ｈ ｒ ｐ ｉ ｓ ｌｔ ｏ ｆ Ｎｉｉ ｒ ｓｓ ｔ ｔｅ ｏ ｏ ｃ ｓｔｅ ｍｏ ｈ ｌ ｎ ａ ｓ ｕ
ＪＡ Ｏ ｈ — ａ Ｉ Ｓ ｉｙ ｏ， ＺＨＡＮ Ｇ ａ — ｉ Ｌ ｎ ｗｅ
（ ｆ ｇ ｆ ｏ ｄＳ ｉ ｃ， ｒ ｅｓＡｇｉｕｔｒｌ ｉｅｓｙ Ｈａｂｎ Ｃｏ ｅｅｏ ｏ ｃｅ ｅＮｏｔ ａｔ ｒｃｌ ａＵｎｖｒｉ ， ｒｉ ｌ Ｆ ｎ ｈ ｕ ｔ
的乳 中 ｎｓｎ活性 降低 ８ ％。添 加乳化剂 可 以改善这 种 ｉｉ ８ 情 况 。另外 ，脱脂 乳 中干 物质 达 ｌ ％ ，ｎｓｎ的分散 也 ０ ｉｉ 将 受 到 影 响 ，而 在 乳 清培 养 基 由于 干 物 质含 量 低 ，其
影 响也 降低 。 ２ ｎｓｎ抗性嗜热链球 菌的驯化 ． ２ ｉ ｉ ｎｓ ｉｉ ｎ抗性 菌株在 国外 已有研究 。Ｖ ｒ ｅ ｌ２ ｅｈ ｖ ｔ］ 究 ｌ等研 了 ｎｓｎ的抗性 的单核增生性 李斯特菌 Ｓ ｏｔＡ，其抗 性 ｉｉ ｃｔ
采 用 乳 清 培 养 基 进 行 计 数 ， 其 具 体 方 法 参 见
Ｉ ：１ ８ ＤＦ１ ７ ９ ３标准 【。 １ ９ 】
等人…】 报道脂肪 是影响 ｎ ｓ ｉｉ 用效果 的一个重 要因素 ， ｎ作 １ ．３ ５ 粘度测 定 ５ １ ｍ１ ｎｓｎ加入到脱脂乳 中，其 活性降低 ３ ％，脂 ０ 『 的 ｉ ｉ ３ 肪含量 １２ ％，其活性 降低 ５ ％，而脂肪 含量达 ｌ ．％ ．９ ０ ２９ 采用 ＮＤＪ７ ． ９型粘 度计进 行测定 。 １． ＿４ 酸度（ Ｔ ５ 。） 用 ０１ Ｎａ Ｈ标准溶液滴定，按食品分析手册操作【】 ． Ｎ ￣ ） ｌ ｏ 。 １： ．５ 感 官评价 ５
乳链球菌素最小抑菌浓度(MIC)测定及理化性质分析
乳链球菌素最小抑菌浓度（MIC）测定及理化性质分析吴雅萍1，江晓佟1，张帅2，余奇飞1，陈健凯1，陈新华3，*（1.漳州职业技术学院食品工程学院，漳州 363000；2. 福建省农业科学院亚热带农业研究所，漳州 363005；3.福建农林大学，福州 350007）摘要：金黄色葡萄球菌是一种常见的食品致病菌，能引起严重的感染。
乳链球菌素（nisin）是世界卫生组织公认的天然食品防腐剂。
采用二倍梯度稀释法探究nisin对金黄葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC），通过琼脂平板扩散法分析nisin的理化性质。
结果表明，nisin对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2.34μg/mL。
理化性质分析发现，nisin在pH为2～6状态下，抑菌效果好，在pH7～11抑菌活性逐渐减弱。
Nisin在100℃以下热处理，活性保持良好，120℃处理仍有部分活性，说明其耐热稳定性好。
胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K处理nisin，抑菌活性均有一定的削弱，其中蛋白酶K削弱最为明显。
Triton-100、Tween20表面活性剂对nisin抑菌活性有细微的协同作用，但SDS可明显抑制其抑菌活性。
关键词：乳链球菌素；金黄色葡萄球菌；最小抑菌浓度（MIC）；理化性质中图分类号：TS202.3/TS207.4 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2020）05-0119-05doi：10.19804/j.issn1006-2513.2020.05.021Nisin minimum inhibitory concentration （MIC） determination andits physicochemical propertyWU Ya-ping1，JIANG Xiao-tong1，ZHANG Shuai2，YU Qi-fei1，CHEN Jian-kai1，CHEN Xin-hua3，*（1. Institute of Food Engineering ，Zhangzhou V ocational and Technical College，Zhangzhou 363000；2. Institute of Subtropical Agriculture，Fujian Academy of Agriculture Sciences，Zhangzhou 363005；3. Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350007）Abstract：Staphylococcus aureus is a common food pathogen which can cause serious infections to human. Nisin was recognized by the World Health Organization as a natural food preservative. The study was to investigate the minimum inhibitory concentration （MIC） of Nisin against S.aureus by double gradient dilution method，as well as its physicochemical properties by agar plate diffusion method. The results showed that the minimum inhibitory concentration （MIC） was 2.34 μg/mL. Nisin had a good antimicrobial activity at the condition of pH 2 to 6，but gradually weakened at pH 7 to 11. The antimicrobial activity was stable below 100 ℃，but still had partially activity above 120 ℃，which indicating its good heat-resistant property. After treated with trypsin，papain and protease K，收稿日期：2020-01-21基金项目：福建省教育厅项目（JAT191402）。
耐硒微生物的筛选与鉴定
学号：K071041404湖北民族学院科技学院本科毕业论文题目: 一株耐硒微生物的筛选与鉴定姓名：黄益班级：K071041404专业：生物工程指导教师：唐巧玉中国·恩施二零一四年五月Stu.ID:K071041404BACHELOR'S THESIS OF HUBEI UNIVERSITY FOR NATIONALITIESScreening and identification of selenium-resistantstrain of microorganismsProfessional: Biological EngineeringName：Huang YiAcademic Advisor：Tang QiaoyuEnshi · ChinaMay , 2014学术声明1、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。
2、本论文中除引文外，所有试验、数据和有关材料均是真实的。
3、本论文中除注明作者和来源的引文外，不包含其他人、其他机构已经发表或撰写过的研究成果。
4、其他同志对本研究所做的贡献已在论文中做了声明并表示了谢意。
5、本声明的法律后果由本人承担。
作者签名：年月日导师审核声明本人郑重声明：该生所呈交的学位论文，是在本人的指导下独立进行研究工作所取得的成果。
其中文字、图、表及其它相关内容均经本人审核，同意作为该生的学位论文提交。
导师签名：年月日一株耐硒微生物的筛选与鉴定黄益（湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施，445000）摘要:本文以恩施富硒土壤中的微生物为研究对象。
使用无菌磷酸盐缓冲液悬浮后再进行其他处理结合平板划线涂布培养分离出耐硒菌株23个。
用硒浓度作为变量，利用控制变量法筛选出最耐硒菌株，进行革兰氏染色观察其颜色作初步鉴定，并对其进行生理生化鉴定，初步确定菌种类型。
通过上述初步鉴定实验得到的结论，参照《伯杰细菌鉴定手册》初步判断得到的最耐硒菌种为土壤杆菌属。
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菌株 编号 KY01 KY02 KY03 KY04 KY05 KY06 KY07
第 48 卷第 7 期 20第09 7年期7 月
湖北农业科学 Hubei Agricultural Sciences
Vol． 48 No.7 Jul．，2009
Nisin 产生菌的筛选及鉴定
彭其安，王布匀，蒋 磊，程 勋 （武汉科技学院环境与城建学院， 武汉 430073）
摘要：从新鲜牛奶样品中用 M17G 筛选培养基定向筛选出 20 株目的菌株。 应用琼脂扩散法，以黄色微球
（责任编辑 郑 威）
效价 IU·mL-1
791 826 776 693 548
2．3 菌种鉴定结果 2．3．1 KY08 菌株的细菌学鉴定 在 M17G 培养基 上活化 1 d 后 KY08 长出的菌落 准0．8～1．2 mm，乳白 色，圆形，隆起，较光滑，湿润，边缘整齐；在显微镜 下观察（图 2），细胞卵球型 ，直 径 为 0．7～1．5 μm，沿 链长轴方向生长，每条链上有 2～20 个细胞，接触酶
表 2 复筛菌株效价
菌株 编号 KY06-1 KY06-2 KY06-3 KY06-4 KY06-5
效价 IU·mL-1
825 790 763 712 654
菌株 编号 KY08-1 KY08-2 KY08-3 KY08-4 KY08-5
效价 IU·mL-1
842 822 814 803 786
菌株 编号 KY15-1 KY15-2 KY15-3 KY15-4 KY15-5
图 1 初筛菌落
表 1 初筛菌株发酵产物效价
效价 IU·mL-1
663 371 283 453 772 802 786
菌株 编号 KY08 KY09 KY10 KY11 KY12 KY13 KY14
效价 IU·mL-1
822 552 677 791 298 566 414
菌株 编号 KY15 KY16 KY17 KY18 KY19 KY20
1 材料与方法
1．1 材料 1）分离样品的来源。 未消毒鲜牛奶，采自徐州
市上坝村奶牛养殖基地。 2） 菌 种 。 黄 色 微 球 菌 （Micrococcus flavus）
NCBI8166，本实验室保藏。 3）主要培养基 。 ［2－3］ 乳酸乳球菌试管斜面、平板
分 离 、 液 体 种 子 及 增 殖 培 养 基 均 选 用 M17G 培 养
收 稿 日 期 ：2009－02－26 作 者 简 介 ：彭 其 安 （1981－ ）， 男 ，湖 北 潜 江 人 ，助 教 ，硕 士 ，（ 电 话 ）13297976765 （电 子 信 箱 ）pqa2002＿＠163．com 。
1620
湖 北 农 业 科学
2009 年
2 结果与分析
2．1 初筛结果 经过初筛， 从新鲜牛奶样品中共筛选出 20 株
Abstract： More than 20 strains were screened by fresh milk samples on M17G culture medium． The antimicrobial activities of their fermentation products were tested by the agar-diffusion method， using Micrococcus flavus NCBI8166 as an indicating strain． One stable and high－yield strain was obtained and named as KY08． Its production was up to 813 IU·mL－1． According to the results of automated microbiological analysis instrument－Vitek－32 and Berges Bacteriology （the eighth edition）， KY08 was tentatively identified as a subspecies of Streptococcus lactis． Key words： Nisin－producing strain； screening； identification
菌 （Micrococcus flavus）NCBI8166 为 指 示 菌 对 其 发 酵 产 物 进 行 效 价 测 定 ，经 反 复 筛 选 ，获 得 1 株 稳 定 的
高产菌株 KY08，产 Nisin 效 价 为 813IU·mL－1。 用 细 菌 鉴 定 系 统 Vitek－32 进 行 生 化 特 征 鉴 定 ，并 参 照 了
《伯杰氏细菌学鉴定手册》（第八版），将 KY08 菌株初步鉴定为乳酸链球菌种的一个亚种。
关键词：Nisin 产生菌；筛选；鉴定
中 图 分 类 号 ：Q93－331
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114 （2009 ）07－1619-02
Screening and Identification of Nisin－producing Strain
乳 酸 链 球 菌 素 （Nisin）是 某 些 乳 酸 链 球 菌 产 生 的具有 34 个氨基酸残基的多肽类物质［1］。 对引起食 品腐败的大多数革兰氏阳性菌有很好的抑制作用， 属于高效、无毒副作用的天然生物防腐剂。 本文根 据 Nisin 产生菌中 Nisin 编码 基 因 和 蔗 糖 发 酵 基 因 紧密连锁的原理，在添加 Nisin、蔗糖及溴甲酚紫的 M17G 选择培养基上，从新鲜牛奶样品中快速、准确 地筛选出目的菌株，并进行了复筛、稳定性考察和 生理生化特征鉴定。
参考文献： ［1］ REUNANEN J， SARIS P E J． Bioassay for nisin sausage： A
shelf study of nisin in cooked sausage ［J］． Meat Science， 2004，66（4）：515－518． ［2］ DODD H M，HAO Z． Improved medium for Lactic streptococci and their bacteriophages ［J］． App1 Environ Microbiol，1992，8 （11）：3683－3693． ［3］ 尤 新 ． 功 能 性 发 酵 制 品 ［M］． 北 京 ： 中 国 轻 工 业 出 版 社 ， 2000．314－331． ［4］ 布 坎 南 R E，吉 本 斯 N E．伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册 ［M］．第 八 版．中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 ，译．北 京 ：科 学 出 版 社 ，1984．677－701．
PENG Qi－an，WANG Bu－yun，JIANG Lei，CHENG Xun （School of Environment ＆ Urban Construction， Wuhan University of Science and Engineering，Wuhan 430073， China）
结果 + + + + + +
特征反应 SAL （ 水 杨 素 ） TRE （ 海 藻 糖 ） PUL （ 支 链 淀 粉 ） MLZ （松 三 糖 ） XYL （ 木 糖 ） OPT （ 奥 普 托 琴 ） 10B （10％胆 汁 ） ARG（ 精 氨 酸 ） NOV（ 新 生 霉 素 ） MAN（ 甘 露 醇 ） SOR （ 山 梨 醇 ） ARA （ 阿 拉 伯 糖 ）
URE （ 尿 素 ） DEX （ 葡 萄 糖 ） RAF （ 棉 子 糖 ）
SUC（ 蔗 糖 ） PYR （ 丙 酮 酸 ） MEL （ 蜜 二 糖 ）
RIB （ 核 糖 ） BAC （ 杆 菌 肽） TZR （ 红 四 氮 唑 ）
LAC （ 乳 糖 ）
INU（ 菊 糖 ） CEL （ 纤 维 二 糖 ） CAT（氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 ）
注 ：“+”为 阳 性 反 应 ；“－”为 阴 性 反 应 。
3 小结
结果 + + + + + -
本实验室筛选出的菌株 KY08 细胞直径比相关 资料记载值 0．5～1．0 μm 稍大，可利用蛋白胨 、葡 萄 糖、蔗糖、乳糖、纤维二糖、奥普托琴、七叶灵。 不利 用棉子糖、菊糖、山梨醇，在含 6％的 NaCl 或 40％胆 汁培养基中不生长，不能水解精氨酸，能产 Nisin。与 文 献 ［4］ 中 乳 酸 链 球 菌 及 其 亚 种 的 形 态 特 征 和 生 化 特性描述一致，初步鉴定该菌为乳酸链球菌亚种。
效价 IU·mL-1
812 740 690 386 758 505
2．2 复筛及稳定性考察结果 将复筛到的 KY06、KY08、KY15 菌株分别转 接
至第五代，分别命名为 KY06－1～KY06－5，KY08－1～ KY08－5，KY15－1～KY15－5， 摇瓶发酵后测定效价， 考察其稳定性，结果见表 2。 通过分析比较，KY08 菌 株的效价最高且相对稳定，平均效价为 813 IU·mL－1。
图 2 细菌显微照相（640×）
试验呈阴性，革兰氏染色阳性，无芽孢，不运动。 2．3．2 菌 种 生 化 鉴 定 使 用 微 生 物 鉴 定 系 统 Vitek－32 的革兰氏阳性菌鉴定卡（GPI）对 KY08 进 行鉴定，鉴定结果如表 3。
表 3 Vitek-32 GPI 鉴定卡鉴定结果