酵母双杂交培养基
酵母双杂交试剂及培养基的配置
主要试剂及培养基的配置1、40％葡萄糖：121℃灭菌15min。
2、YPDA液体培养基(1L)：20g/L peptone10g/L yeast extract定容至935ml，PH调至5.8(调之前大约6.6左右)，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入50ml 40％葡萄糖及15ml Ade。
●YPDA固体培养基另加18g/L agar。
3、－Trp－Leu液体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.154g －Trp－Leu定容至95ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖。
●固体培养基另加入1.2-1.5% Agar，以下同上。
注：配缺陷型培养基时，加入缺陷型氨基酸具体的量还要参考药品商标的注明，不同厂家及批次的药品加入的量不同。
4、－Trp液体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.154g －Trp－Leu定容至93ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖及2ml 50×Leu。
5、－Trp－Leu－His固体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.062g －Trp－Leu－His1.2-1.5% Agar定容至95ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖。
6、－Trp－His固体培养基（100ml）：0.67g 基础培养物（w/o）0.062g －Trp－Leu－His1.2-1.5% Agar定容至93ml，PH调至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至55℃时，加入5ml 40％葡萄糖及2ml 50×Leu。
7、鲑鱼精DNA（ssDNA）：5mg/ml8、50％PEG：需滤灭。
9、1M LiAc：10、Z buffer：16.1g/L Na2HPO4.7H2O5.50g/L NaH2PO4.H2O0.75g/L KCl0.246g/L MgSO4.7H2OPH调至7.0，灭菌室温保存。
酵母双杂技术的原理和应用
酵母双杂技术的原理和应用一、酵母双杂技术的原理酵母双杂技术是一种重要的基因工程技术，其原理主要包括以下几个方面：1.酵母双杂技术的基本原理：酵母双杂技术基于酵母细胞中的两种杂交酵母菌株，一种包含目标酵母蛋白的报告基因，另一种包含潜在的酵母互补DNA库。
通过把这两个酵母菌株共同培养在含有特定酵母蛋白诱导剂的培养基中，使得目标酵母蛋白和潜在互补DNA库中的DNA相互作用，从而筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列。
2.双杂交酵母菌株的构建：首先需要构建含有目标酵母蛋白的报告基因表达酵母菌株，该菌株会在酵母细胞中表达目标蛋白。
同时，还需要构建潜在酵母互补DNA库，该库中含有大量酵母基因组DNA片段的克隆。
3.酵母菌株的培养和筛选：将目标蛋白报告基因酵母菌株和酵母互补DNA库菌株共同培养在含有诱导剂的培养基中，诱导目标蛋白和潜在互补DNA库中的DNA发生相互作用。
然后利用适当的筛选方法，如抗生素抗性筛选或含有荧光素底物的筛选，筛选出与目标蛋白相互作用的克隆。
二、酵母双杂技术的应用酵母双杂技术广泛应用于生物医药、生物学研究等领域，具有多个重要的应用方面：1.蛋白相互作用的研究：通过酵母双杂技术，可以快速筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列，从而深入研究蛋白相互作用的机制和功能。
这对于揭示生物体内复杂蛋白相互作用网络、研究疾病相关蛋白相互作用具有重要意义。
2.新药靶点的发现：通过酵母双杂技术，可以筛选出与药物分子相互作用的蛋白，从而为新药靶点的发现提供候选蛋白。
这对于药物研发和临床治疗具有重要意义。
3.基因功能研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与目标基因相互作用的蛋白，从而推断目标基因的功能。
这有助于揭示基因的调控机制和功能。
4.疾病相关基因的筛选：通过酵母双杂技术，可以筛选出与疾病相关的基因，从而对疾病的发生机制和治疗提供有价值的信息。
5.基因治疗的研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与治疗目标相关的蛋白或基因，从而为基因治疗的研究提供候选靶点或治疗策略。
酵母双杂方法(改)
培养基（1）细菌培养基LB培养基（1 L）：5 g酵母提取物，10 g氯化钠，10 g胰蛋白胨，pH 7.0；SOB培养基（1 L）：5 g酵母提取物，0.5 g氯化钠，20 g胰蛋白胨，2.5 mL 1 M氯化钾，pH 7.0，高压灭菌后在每100 mL的小份中加1 mL 1 M氯化镁。
（2）酵母生长培养基100 mL YPD培养基：1 g酵母提取物，2 g胰蛋白胨，0.02 mL 10 M NaOH，双蒸水95 mL，固体加2 g琼脂粉。
高压后加入5 mL 40%葡萄糖；100 mL YPDA培养基：基本配方同上。
高压后加入0.8 mL 100×Ade和5 mL 40%葡萄糖；100 mL SD/-Leu培养基：0.7 g无氨基酵母氮源，0.07 g四缺物, 0.02 mL 10 M NaOH，双蒸水95 mL，固体加2 g琼脂粉。
高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖，0.2 mL 500×Trp和0.2 mL 500×His。
100 mL SD/-Trp培养基：0.7 g无氨基酵母氮源，0.07 g四缺物, 0.02 mL 10 M NaOH，双蒸水95 mL，固体加2 g琼脂粉。
高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖，1 mL 100×Leu和0.2 mL 500×His；100 mL SD/-Trp/-Ade培养基：基本成分同上。
高压后加入5 mL 40%葡萄糖，1 mL 100×Leu和0.2 mL 500×His；100 mL SD/-Trp/-His培养基：基本成分同上。
高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖和1 mL 100×Leu；100 mL SD/-Trp/-Leu培养基：基本成分同上。
高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖和0.2 mL 500×His；100 mL SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基：基本成分同上。
酵母双杂交试验流程
酵母双杂交试验流程4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30°生长3天。
需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。
4月6号星期三（1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。
需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。
4月7号星期四（2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。
下午4点开始 8号 8点结束Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。
4月8号星期五（3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。
（4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。
（5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。
8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。
（6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。
（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。
（8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。
（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。
（10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。
酵母表达过程中用到的培养基
酵母表达过程中用到的培养基毕赤酵母表达的培养基配制［5］2.1 LB（Luria－Bertani）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl l％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存。
用于培养pPICZαA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl 0.5％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。
2.3 YPD （又称YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 μg/ml液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol （山梨醇）1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母双杂交实验
酵母双杂交实验酵母双杂交相关实验方法一、酵母总DNA提取方法（蜗牛酶法）1。
酵母质粒提取试剂bufferi0.9mol/lsorbitol0.1mol/ledtabufferii50mm/ltris20mm/ledtabufferiii10mm/l tris1mm/ledta2、操作步骤：（1）收集新鲜细菌，加入150μlbufferi、25μL蜗牛酶（30mg/ml）（2）37℃水浴1小时。
(3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μlbufferii。
(4)加入25μl10%sds，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。
(5)加入25μl5mol/l醋酸钾，冰浴60min。
(6)4℃12000rpm离心15min，取上清。
（7）向上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，充分混合，并在-20℃下静置1小时以上。
（8）取出，在4℃12000rpm下离心15分钟，丢弃上清液。
(9)加入150μlbufferiii溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。
(10)12000rpm离心15min。
（11）将上清液转移到新的离心管中，并添加6μl（10u/μl）核糖核酸酶，在37℃下放置30分钟。
（12）取上清液并添加等量的异丙醇。
（13）在4℃下静置10分钟超过1小时或过夜。
（14）在4℃下以10000 rpm离心5分钟。
(15)弃上清，并把沉淀溶于10μlbufferiii中。
二、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：除PEG过滤灭菌外，其他转化试剂需要在与普通培养基灭菌相同的条件下进行高温高压灭菌。
(1)m醋酸锂（lithiumacetate）（2）聚乙二醇（PEG）分子量3350，浓度50%（w/V）（3）PEG/liac溶液的制备（即用）800μl50%peg100μl10×te100μl10×liac1ml总体积（4）1.1×TE/liac溶液（用于使用和制备）11ml10×TE（5）11ml10×liac（6）78mlddh202。
细菌双杂交实验步骤
细菌双杂交实验步骤细菌双杂交实验是一种广泛应用于分析蛋白质相互作用的实验技术。
本实验旨在通过转化酵母菌，实现在蛋白层面上对目标蛋白的功能以及相互作用关系进行研究。
实验步骤：1. 预处理酵母菌：在含有1M sorbitol的磷酸盐缓冲液中将收获的酵母菌进行洗涤，去除培养基中的残留盐分。
之后将酵母菌放置在含有1M sorbitol的缓冲液中，30℃培养至OD600约0.8。
2. 质粒构建：将目标蛋白特异性DNA序列在质粒载体pBTM116中进行克隆，经过PCR 技术检验正常与否。
对于另一种质粒载体pTRG进行同样方式克隆另一种特异性DNA序列。
3. 转化酵母菌：在含有PEG/LiAc缓冲液的条件下将构建好的pBTM116和pTRG质粒转入酵母菌。
将转染过程的混合液置于30℃下孵育并进行热冷冲击处理。
4. 筛选阳性菌落：在缓冲盐丙氨酸担载基质体系内进行SD-GAL-HIS筛选，筛选过程中需控制pBTM116和pTRG构建物的基因簇数据库，以筛去阴性菌落。
5. 二连体验证：通过筛选得到的阳性菌落进行β-加酶和α-酶的检测，检测合成报告基因GAL1-ADE2和GAL1-HIS3是否被启动表达。
判断菌落是否发生了特异性蛋白的相互作用，形成了蛋白二连体。
6. 鉴定蛋白质相互作用：对于筛选得到的阳性菌落进行回溯筛选比对，鉴定哪些实验组应该被排除或者继续保留。
鉴定相互作用的方式可以通过质谱检测，或者利用重建蛋白ELISA技术进行。
7. 数据分析：将筛选过程中所得到的阳性菌落编号，从而得出蛋白质相互作用的列表。
针对每一对蛋白质进行表达定量，进而分析蛋白连接网络，了解蛋白质间相互作用的关系。
细菌双杂交实验是一种可行的分析蛋白质相互作用的技术手段，它为分析生物分子交互作用提供了一种新的途径。
通过细菌双杂交实验，科学家们能够对目标蛋白质的功能以及相互作用关系进行深入研究，有助于我们更好的理解生命科学中蛋白质的功能及其复杂的交互关系。
酵母双杂交操作步骤
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂杂交回复验证实验
酵母双杂杂交回复验证实验一、引言酵母双杂杂交回复验证实验是一项常用于研究酵母菌遗传性状的实验方法。
通过将两个不同株系的酵母菌互相杂交，观察其后代的表型，可以确定不同基因型对于特定性状的影响，以及基因之间的相互作用关系。
这项实验提供了一种有效的手段来研究酵母菌的遗传特性，并为从酵母菌到其他生物的研究提供了重要参考。
二、实验设计1. 实验目的确认酵母菌的遗传性状以及基因型之间的相互作用关系。
2. 实验步骤1.选取两个不同基因型的酵母菌株进行杂交。
2.将两个酵母菌株分别培养在适宜的培养基上，以获得足够数量的酵母菌细胞。
3.将两个酵母菌株的细胞混合在一起，使其进行杂交。
4.将混合后的酵母菌细胞培养在选择性培养基上，以筛选出杂交后的酵母菌子代。
5.观察酵母菌子代的表型特征，并将其形态记录下来。
3. 实验材料•两个不同基因型的酵母菌株•培养基及培养仪器•选择性培养基4. 实验结果通过观察酵母菌子代的表型特征，可以得到各个基因型对于特定性状的影响情况。
如果两个酵母菌株的基因型在某一性状上有不同表现，那么杂交后的子代在该性状上可能表现出两种不同的表型。
这种表型的分离现象可以帮助确定酵母菌的遗传性状。
5. 实验分析通过对大量的酵母菌子代进行观察和统计，可以得到不同基因型对于特定性状的影响程度，以及基因之间的相互作用关系。
这些数据可以用来构建酵母菌的遗传模型，推测特定基因在遗传性状中的作用机制。
三、实验应用酵母双杂杂交回复验证实验在酵母研究领域具有广泛的应用价值。
以下是一些应用示例：1. 基因功能研究通过观察不同基因型的酵母菌子代的表型，可以推测特定基因在酵母菌生命周期、代谢途径等方面的作用。
这对于全面理解基因功能具有重要意义。
2. 病原机制研究酵母双杂杂交回复验证实验可以帮助研究人员解析酵母菌导致疾病的机制。
通过分析酵母菌的基因型与特定疾病的发生关系，可以发现关键基因及其表达调控途径，为疾病治疗和预防提供新思路。
酵母双杂交检测（Yeast
酵母双杂交检测（Yeast Two酵母双杂交检测（Yeast Two-Hybrid Assay）产品专题检测原理：酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid assay）是⽤于体内研究蛋⽩相互作⽤的⼀种⾮常便利的⼯具，常⽤的如GAL4为基础的系统，使⽤酵母转录因⼦GAL4来检测转录激活后的蛋⽩相互作⽤。
某些转录因⼦（如GAL4）由两个可以分开，功能上相互独⽴的结构域组成，N端有⼀个147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain，BD），C端有⼀个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。
BD可以和上游激活序列（UAS）结合，⽽AD能激活UAS下游基因进⾏转录。
单独的BD或AD不能激活基因转录，两者只有通过某种⽅式结合在⼀起形成完整的转录激活因⼦的功能【见图1】。
酵母双杂交系统主要利⽤酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋⽩在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋⽩质的相互作⽤，对蛋⽩质之间微弱、瞬间的作⽤都能通过报告基因敏感的检测到。
酵母双杂交系统应⽤：1）对新的与已经蛋⽩相互作⽤的鉴定2）对预测蛋⽩相互作⽤的确认3）对蛋⽩相互作⽤区域的鉴定双杂交检测原理图。
两个蛋⽩分别表达，⼀个（诱饵蛋⽩bait protein）融合到Gal4 DNA 图1.双杂交检测原理图。
结合域表达，另⼀个（诱捕蛋⽩prey protein）融合到Gal4转录激活结构域（AD）表达。
在Y2HGold酵母菌株中，只有当两个蛋⽩之间相互作⽤并结合到Gal4反应性启动⼦上才能活化报告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表达。
酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）诱饵（the bait）⼀、⼀、诱饵（为了建⽴GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩，推荐使⽤质粒pGBKT7；要调查三元蛋⽩复合物，推荐使⽤含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩和第⼆个感兴趣蛋⽩，在bait和prey蛋⽩之间发挥桥梁作⽤。
酵母双杂实验步骤
2.1.1 酵母双杂交2.1.1.1 Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。
其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。
通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。
获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。
进行BP反应时，需注意以下几项：(1) 对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；(2) 为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3) 提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。
酵母双杂交实验步骤
LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。
分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株4. 对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒5. 引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
TAKARA酵母双杂交实验步骤
酵母双杂交实验方法一）酵母感受态细胞的制备1. 于YPDA平板上划线培养酵母Y2H Gold菌株，30℃培养约3d；2. 挑取单菌落（2-3mm）接种于YPDA液体培养基中，30℃、250rpm摇培8-12h；3. 接种0.5μL至5mL YPDA液体培养基中（1:1W的接种比例），30℃、250rpm 摇培至OD600 = 0.15~0.3（16-20h）；4. 700g离心5min，弃上清后用10mL YPDA（2倍体积）重悬；5. 30℃、230rpm摇培至OD600 = 0.4~0.5（3-5h）；6. 将10mL菌液分装成2管5mL，700g离心5min，用3mL ddH2O重悬（0.6倍体积）；7. 700g离心5min，用150μL 1.1×TE/LiAc重悬（0.05倍体积）；8. 转移至1.5mL离心管后，高速离心15s；9. 用60μL 1.1×TE/LiAc重悬（0.02倍体积）。
二）酵母感受态转化方法1. 感受态细胞转化体系：感受态细胞50μLYeastmaker Carrier DNA（10ng/μL）5μL质粒DNA 100ng**共转化时，prey的质粒DNA量两倍于bait于50μL酵母感受态细胞中依次加入5μL Carrier DNA、100ng 质粒DNA，共转化时，猎物蛋白（未知蛋白）质粒DNA量为诱饵蛋白的2倍。
2. 混匀后加入500μL PEG/LiAc，30℃孵育30min，每10min轻微混匀；3. 加入20μL DMSO，42℃水浴15min，每5min轻微混匀；4. 10000rpm离心15s，用1mL YPD Plus重悬；5. 10000rpm离心15s，用1mL 0.9% NaCl重悬；6. 涂布于二缺培养基，30℃培养。
酵母双杂交步骤
1.酵母质粒提取参考天根公司酵母小题试剂盒说明书步骤:1)柱平衡步骤:向吸附柱CPZ中(吸附柱放入收集管中)加入500ul的平衡液BL，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中（使用当天处理的柱子）。
2)取1-5ml酵母培养物，12000rpm离心lmin，尽量吸除上清。
3)破除酵母细胞壁:向菌液中加入300ul山梨醇buffer，加入大约50U Lyticase，充分混匀，并在摇床上220 rpm，30℃处理lh。
4000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀。
加入250ul 溶液YP1(已加RNaseA)，重悬沉淀。
4)向管中加入250ul YP2溶液，温和地上下翻转6-8次，使菌体充分混匀，室温静置5-10min。
5)向管中加入350ul YP3 溶液，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，出现白色絮状沉淀。
12000rpm离心20min。
6)小心地将上清液加入吸附柱CP2中，12000rpm离心1min，弃废液。
7)向吸附柱CP2中加入500ul缓冲液PD，12000rpm离心1min，弃废液。
8)向吸附柱CP2中加入600ul漂洗液PW(己加无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液。
9)重复步骤8。
10)将吸附柱CP2放入收集管中，12000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液。
11)将吸附柱CP2置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100ul洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2min，收集质粒，-20℃保存。
提取的酵母质粒浓度低很难凝胶电泳监测，可将其转入感受态DH5a，若转化成功即可认为质粒抽提合格，送交测序。
2. 酵母质粒DNA的提取1. 挑取经过酵母选择/诱导培养基初步鉴定的酵母单菌落，接种于5.0-10.0ml SD/-Trp液体培养基，30℃恒温，250rpm振荡培养20hr。
2. 室温离心5000xg×1min，弃上清，收菌。
酵母双杂交操作步骤
（酵母菌储存在-70 C 中，引物和质粒 DNA 储存在-20 C 中） 概念：1. 次序转化：指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是 DNA-BD/bait plasmid ）,在选择培 养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（ AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA 也就是节约质粒 DNA2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin （卡那霉素） pGADT7----的选择物是：ampicillin （ 氨苄西林）酵母氮源（YNB ：; -leu DO suppleme nt 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖20g （ 即2%）5） SD/-trp （1000 ml ）酵母氮源（YNB ：;-ade/-leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖20g （即2%）注意：YNB 有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
我们这用的是 含硫酸铵的。
（买 来就加进去了的）。
如果不含硫酸铵，那么要在终浓度 ％的 YNB 中再加入％的硫酸铵，即最终在1000 ml 溶液中加入总量为的YNB 与硫酸铵。
各种SD 培养基：1） SD/-ade （腺嘌呤）/-leu （亮氨酸）/-trp缺”）酵母氮源（YNB ：;-ade/-leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.60g 葡萄糖20g（即2%）2） SD/-leu/-trp/-his （1000 ml ）酵母氮源（YNB ：;-leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.62g ; 葡萄糖20g.（ 即2%） 3） SD/-leu/-trp （1000 ml ） （“二缺”）酵母氮源（YNB ：;-ade/-leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.64g 葡萄糖20g（ 即2%）（色氨酸）/-his（组氨酸）（1000 ml ）（"四（购买来就配好的）； （购买来就配好的）（购买来就配好的）实际配制的方法是：1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4 C）,过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55 C以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。
酵母双杂交实验原理及具体步骤
酵母双杂交原理：酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，用于检测蛋白质间的物理相互作用关系。
其原理基于转录因子的两个功能域的可拆分性。
①转录因子可拆分性：构建酵母诱饵（bait）和猎物（prey）表达载体：将目标蛋白分别将其编码序列分别克隆到两个表达载体中。
其中，诱饵载体通常包含一个“催化域”（activation domain，AD），用于连接目标蛋白和转录激活子域；猎物载体通常包含一个“DNA结合域”（DNA binding domain，BD），与转录因子的靶位点序列结合。
通过将目标蛋白的相互作用引入到转录因子中，可以重新组装功能域并激活报告基因表达。
②目标蛋白的诱饵和猎物构建：将目标蛋白分别克隆到诱饵载体和猎物载体中。
诱饵载体中的目标蛋白与BD结合，形成诱饵蛋白-BD复合物；猎物载体中的目标蛋白与AD结合，形成猎物蛋白-AD复合物。
③互补的转录因子和报告基因：将诱饵和猎物载体转化到同一酵母细胞中，诱饵蛋白与猎物蛋白发生相互作用后，诱饵蛋白的BD域与猎物蛋白的AD域重新组装为完整的转录因子。
该转录因子能够结合到特定的报告基因启动子上，激活报告基因的表达。
④报告基因表达和筛选：通过培养在所选的选择性培养基上，只有发生了特定蛋白相互作用的酵母细胞才能生长。
选择性培养基可能缺乏某些必需营养物质，当酵母菌株与目标蛋白质发生相互作用时，新的遗传特征和功能产物的表达则能够弥补酵母细胞在选择性培养基上的缺陷。
例如，当使用缺乏组氨酸（histidine）的培养基时，只有酵母菌株表达了完整的转录因子，才能够合成组氨酸并正常生长。
⑤结果验证：据此可以筛选出具有蛋白相互作用的酵母突变株。
验证通常通过进一步的亲和试验（如共免疫沉淀）或其他技术（如荧光共定位）来确认蛋白质相互作用的可靠性。
总体来说，酵母双杂交实验通过利用转录因子可拆分性的原理来检测蛋白质的相互作用。
第一实验：酵母双杂交（YeastTwo-Hybrid）
第一实验：酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）一、目的掌握酵母双杂交原理和方法。
利用酵母双杂交方法在拟南芥转录因子AP2-EREBP家族中筛选与拟南芥Med25有相互作用的蛋白。
二、原理酵母双杂交系统由 Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain，DBD)和转录激活结构域(transcription-activating domain，AD)。
DNA结合结构域可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域可在其连接区适当部位断开，仍具有各自的功能。
将两个待测蛋白分别与这两个结构域组成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与DBD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
图 1-1 酵母双杂交基本原理酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。
其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。
酵母双杂交实验步骤
LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。
分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株4. 对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒5. 引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
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10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）溶液：
不含-His，-Leu，-Trp，-Ura等成分的10×Dropout溶液：
氨基酸10×浓度（mg/L）称重(g)（1 L）称重(g)（500 mL）L-Isoleucine 异亮氨酸300 0.3 0.15
L-Valine 缬氨酸1500 1.5 0.75
L-Arginine HCl 精氨酸200 0.2 0.1
L-Lysine HCl 赖氨酸300 0.3 0.15
L-Methionine 蛋氨酸200 0.2 0.1
L-Phenylalanine 苯丙氨酸500 0.5 0.25
L-Threonine 色氨酸2000 2.0 1.0
L-Tyrosine 酪氨酸300 0.3 0.15
加ddH2O定容后4℃保存
100×氨基酸储备液：
每100ml溶液中分别含有下列成分，配制后保存于4℃氨基酸储备液100 mL中含量
100×His L-histidine HCl monohydrade 200 mg
100×Trp L-Trytohan 200 mg
100×Leu L-eucine 1 g
100×Uracil 200 mg
100×Adenine 400 mg
SD 培养基：
Yeast Nitrogen Base
0.17 g
(without amino acid and Ammonium Sulfate)
Ammonium sulfate 0.5 g
葡萄糖 2 g
10×DO(-His –Leu –Trp –Ura)10 ml
加ddH2O定容至100ml。
如果配固体培养基加入2％的琼脂粉。
SD相应的缺失培养基：加上除了缺失的氨基酸之外的其他的氨基酸储备液，100 ml S D+1 ml 100×氨基酸储备液。
例如：SD/-Leu：SD+100×His 、100×Trp、100×Uracil、100×Adenine各1 ml。
酵母双杂交所用试剂和培养基
试验中所需试剂包括50% PEG、1 M LiAc (10×)、10×TE Buffer、YPD Plus Liquid Medium、YPDA、SD-Leu 、SD-Trp 、X-a-Gal 、Aureobasidin A（AbA）、DMSO、NaCl、DMF等，培养基类型包括YPD、YPDA、2×YPDA、SD培养基、SD相应的缺失培养基等。
具体配制如下：
10×TE(100 mL)：Tris 1.21g，EDTA Na2 0.37g，用盐酸调pH=7.5，ddH2O定容。
10×LiAc（100 mL）：LiAc·2H2O 10.20g，冰醋酸调pH 7.5，ddH2O定容。
50% PEG（100 mL）：PEG3350 50g，ddH2O定容。
1.1×TE/LiAc（10 mL）：1.1 mL 1M LiAc，1.1 mL 10×TE Buffer，8.8 mL无菌H2O。
1×PEG/ LiAc（10 mL）：8 mL 50% PEG3350，1 mL 10×TE Buffer，1 mL 1M LiAc。
10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）溶液：L-Isoleucine 300mg，L-Valine 1500mg，L-Arginine HCl 200mg，L-Lysine HCl 300mg，L-Methionine 200mg，L-Phenylalanine 500mg，L-Threonine 2000mg，L-Tyrosine 300mg，加ddH2O定容至1000 mL, 高压灭菌20 min，4℃保存。
100×氨基酸储备液（每100 mL溶液中分别含有下列成分）：100×His L-histidine HCl monohydrade 200mg，100×Trp L-Trytohan 200mg，100×Leu Leucine 1g，100×Uracil 200mg，100×Adenine 400mg。
YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，琼脂粉20g (固体平板用)，加1 L dd H2O，高压灭菌20min。
YPDA：YPD+1 mL 100×Adenine（腺嘌呤）
2×YPDA：YPDA 培养基成分加倍。