发酵罐实验

（二）上罐前的准备及实罐灭菌
洗净发酵罐及各联接胶管 配制发酵培养基5.0L，置发酵罐内，加入几滴泡敌。 校正pH电极和溶氧（DO）电极。 把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好
后，开夹套出、进水阀V2、W1，使夹套充满水，用保护罩盖 住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气 阀V4，启动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min， 开启冷凝水出水阀V1，开启蒸气阀门S1，进行在位灭菌。
配制种子培养液600mL，分装50mL于一个250mL三角瓶中 （作一级种子瓶），余下550mL平均分装于三个500mL三角 瓶中（作二级种子用），同上灭菌。
2、接种与培养
上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜 面，37℃培养24h。
上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子 瓶， 37℃振荡培养12h，然后转接二级 种子瓶， 37℃振荡培养10h。
阀门代号 S1 W1 W2 W3 W4 V1 V2 V3 V4 A1 J1
J2
用途或名称 蒸气进气管
夹套注水 水进冷凝器
水进盘管 水自动进盘管
盘管排水 夹套溢流口 消毒蒸气平衡口 钟罩排气口
安全阀 平衡口弹簧夹 无菌空气反冲
弹簧夹
四、实验步骤
实验流程：
菌种
培养24h
培养12h
斜面
一级种子
二级种子
取同一发酵液，稀释2、5、10、20、50倍，于600nm下测OD值。 以OD值为纵坐标，菌液浓度（g/L)为横坐标，绘制标准曲线。
五．实验报告内容
（一）整理发酵过程中所测定的各种数据资料。以 时间为横坐标，干菌体浓度X（g/L），葡萄糖浓 度S（g/L），pH等为纵坐标，观察并分析各参数 的变化规律。
2-3
200
50
9:30 1
10:30 2
11:30 3
12:30 4
13:30 5
14:30 6
第一组实验安排（02 生工 1 班，共 31 人）11.29-12.1
组别 1组 菌种
时间 任务 周一：14:30～17:30 配种子培养基、灭菌
人数 4
参加人员
扩大 周二：8:00 接一级种子，晚上 9:00 接二级种子 2
培养
2组 周二：15:00～17:30 配发酵培养基、实罐灭菌 6
灭菌
周三：7:30～10:00 接种及发酵管理
3
3组
接种
10:00～12:00 发酵管理
3
发酵
12:00～14:00 发酵管理
2
4组
发酵
14:00～16:00 发酵管理
2
放罐
16:00～18:00 发酵管理、放罐、清洗
2
周三：15:00～18:00 分析检测：离心、总糖
将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作 开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液 体，将输出上限设在15%，下限设为“0”，待一切 准备就绪，将“手动”开关调节到“自动”状态。
设定搅拌转速为300r/min、空气流量2～3L/min、 pH7.0、DO100%，系统进入发酵状态。
（三）发酵操作
旋转式摇床、离心机、烘箱等。 试剂：泡敌、斐林试剂、0.1%标准葡萄糖溶
液、20%氢氧化钠等。
发酵罐
控制台
档板
夹套
机械消泡
搅拌
取样管
冷凝器
补料、酸、 碱口
接种口
消泡计入口
空气过滤器
电极入口 取样管
转子流量计
蠕动泵（补料、 加酸碱、消泡剂）
电源开关 进气压力
旋钮
压力表
安全阀 排气阀
保护罩
（七）发酵过程中各生理指标的测定 ——标准曲线绘制
菌体干重：取10mL离心管，于105℃烘2h至恒重，用镊子夹取 入干燥器，待冷却后于分析天平上称重（W0），精确到小数后 4位，然后准确取10mL发酵液，于3000r/min离心10min，弃去 上清液，用蒸馏水洗涤沉淀，同上离心，弃上清液，于100℃ 烘至恒重，用镊子夹取入干燥器中冷却，于分析天平上称重 （W1），精确到小数后4位，得细胞干重为W1－W0。
（二）以作图方式求出大肠杆菌的最大比生长速率 和以消耗葡萄糖为基准的平均细胞得率系数。
μm来自百度文库= dX /( X ⋅ dt)
Y = X / S ΔX − ΔS
五．实验报告内容
（三）要求
1、实验报告以小组为单位(每个小组由5-6人组成)，自 由组合，但需包括实验各部分人员。内容：按论文格 式，包括摘要、关键词、前言、材料与方法、结果与分 析。 2、实验报告一律用电脑打印，用Excel作图。 3、实验报告首页写明班级、姓名（亲笔签名）。实验报 告完成后由班里统一交齐。
（二）上罐前的准备及实罐灭菌
连接通气管路，将进气过滤器K7口与控制台左侧 空气出口连通，开弹簧夹，接通空气压缩机电 源，对发酵罐进行通气，调整空气流量3～ 5L/min。
当温度达到37℃时，将预先灭菌的pH电极、DO电 极（75%酒精消毒、UV消毒）接入发酵罐，连接 各电极导线。
（二）上罐前的准备及实罐灭菌
（二）上罐前的准备及实罐灭菌
当保护罩顶部阀门V4有蒸气排出时，2min后关闭阀 门，当罐温接近灭菌温度时，微开阀V4适当排气， 并调整蒸气阀S1维持罐温。保温结束后，关蒸气阀 S1，全开冷凝水出水阀V1，开进水阀W3，将温度设 定在37℃，切入自动。
当温度降到100℃以下，缓缓开排气阀V4，使保护罩 顶压力表指示为零，移去保护罩。
大肠杆菌是遗传工程研究过程中常用的受体菌。通过控制 合适的培养条件，可使大肠杆菌迅速持续地生长，获得所要求 的高产培养物。
为了解发酵过程中菌体的生长及对培养基的利用情况，需 在发酵过程中定时地取样测定。包括对菌体进行镜检、测定不 同时期发酵液的细菌浊度及残留还原糖的变化。
三、实验材料及仪器设备
菌种：大肠杆菌（E.coli)。 培养基：种子培养基、发酵培养基。 仪器设备：发酵罐（7L）1套、 分光光度计、
当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，进行 如下操作：
取样：松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液 压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料 瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料 瓶，开J2、J3排出取样管内残料，夹紧J2、J3。
（三）发酵操作
接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口， 点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入 二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种 后立即进行第一次取样，用于测定细菌OD值。
（七）发酵过程中各生化指标的测定
总糖的测定：见食品分析P157“还原糖的测定”。 吸光度：
将721分光光度计开机，选用A600波长，预热20min，用 蒸馏水调节零点，将对照样倒入比色杯中，作为空白对照， 并对不同样液依次进行测定，对浓度大的菌悬液用对照样适 当稀释后测定，使其OD值在0.1～1.0之间，经稀释后测定的 OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。
（五）放罐
经过发酵约10h后，菌量增长（OD）值缓慢时， 便可放罐。排放液需经灭菌处理才可进入下水道。
（六）清洗
放罐后，将发酵罐清洗干净，关闭所有电源。
（七）发酵过程中各理化指标的测定
样品处理： 样品→振荡均匀→取样5mL→测OD值
↓ 离心（3000r/min，10min) ↓ 上清液 测定总糖
（四）发酵过程中的管理
每小时记录发酵过程温度、pH、DO、通风、转速的测 定数值，并记录操作情况。
注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在合 适的范围内，遇有故障及时排除。(例：当在某一时段 泡沫大量生成时，系统消泡不运转，可将消泡泵切入 到手动加入几滴消泡剂)。
每小时取一次样。每次取样50mL。取样时，用量筒准 确取流出的培养液50mL, 对号倒入三角瓶中，封口， 立即放入冰箱保存。
《发酵工艺原理》综合实验
小型发酵罐的使用及发酵过程 中主要生化指标测定
一、实验目的
了解小型发酵罐的基本结构。学习 和掌握发酵罐的使用及在实验室内大规 模培养微生物细胞的方法。
二、实验原理
发酵罐是进行液体发酵的专用设备。发酵罐配备控制系 统，它主要是对发酵过程中的各种参数如温度、pH、溶解氧、 搅拌速度、空气流量、补料、泡沫水平等进行设定、显示、记 录以及对这些参数进行反馈调节控制。
《微生物工程工艺学原理》实验发酵记录
班级：08 营养 1 班 接种时间：2010.11.4
发酵 时间 时间 温度 pH
℃值 h
8:30
DO %
通风 L/min
转速 消 取样 r/min 泡 mL
日期：2010.11.4 值班人
空白 37 7.0 100 2-3
200
200
8:30 0 37 7.0
4
5组
分析
15:00～18:00 吸光度及菌体干重
3
培养10h
37 ℃（250mL摇瓶) 37℃ (500mL摇瓶） 37℃
培养基
发酵罐
管路准备
8～10h 实罐灭菌 发酵 37℃ 放罐
取样 分析测定
（一）菌种准备
1、配制培养基
配 制 种 子 固 体 培 养 基 100mL ， 分 装 试 管 ， 0.1MPa 灭 菌 20min，然后摆成斜面。