酵母双杂交系统及其应用

酵母双杂交系统及其应用

Y east Two-hybrid System and Its Application

1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物学特性

（1）单细胞真核生物

尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。

（2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少；

1996年已完成酵母全基因组测序（ 1.5 x 107 bp），是第一个被测序的真核生物。大约有6000个基因。目前已经建立了一个6000个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。其中5000多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。

（3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖

在指数生长期每90分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。

（4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析

酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。

有两种单倍体细胞类型，分别为a型和α型。在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/α双倍体细胞。在营养匮乏时，a/α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。

一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒

bud，芽, 蓓蕾starvation，饥饿, 饿死

ascus，n.[微生物]子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂

haploid，n.[生物]单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的

diploid，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体

ascospore，n.[植]囊孢子

rupture，v.破裂, 裂开, 断绝(关系等), 割裂。n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂

spore，n.孢子vi.长孢子germinate，v.发芽, 发育, 使生长

酿酒酵母生活周期

2 酵母双杂交系统的原理

蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动几乎都是通过蛋白质之间的相互作用而实现的。在生物体发育的不同阶段，细胞分裂、分化的不同时期，都离不开蛋白质间的相互作用。

酵母双杂交系统是一种采用分子遗传学手段、通过鉴定报告基因的转录活性检测蛋白质－蛋白质相互作用的方法。Y2H是由纽约州立大学的Stanley Fields于1989年首先创立的。

转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互

独立的结构域构成。

●DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)

●转录激活结构域(activation domain, AD)

例如，酵母转录子Gal4分子由一条多肽链组成，含有881个氨基酸。它有两个结构域：●DNA结合结构域（DNA binding domain, DB）由位于N-末端1~147个氨基酸构成，

能识别效应基因的上游激活序列（UAS, upstream activating sequence）,此外，在其N-端还具有一段核定位序列；转录激活结构域（activation domain, AD）由位于C-末端的768~881位氨基酸构成。

当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性。

Fields等将Snf1与DB融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上。其中，Snf1是一

种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是它的一个结合蛋白。

研究者将两种穿梭质粒转化酵母GGY: 171菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因。该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录。一般地，将DB-x的融合蛋白称作诱饵(bait) , X往往是已知蛋白; AD-Y称作猎物(prey) ,Y称作猎物;整个实验过程称作“狩猎”( hunt或fish)。

3 酵母双杂交系统的应用

目前,在许多具有国际水准的实验室中,酵母双杂交系统及其衍生方法已成为研究蛋白质相互作用的首选方法,而且利用它已揭示了大量未知蛋白质的相互作用。据对文献的统计,目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。

●鉴定两种已知蛋白之间有无相互作用

●鉴定已明确有相互作用蛋白质发生作用所必需的的结构域及特定氨基酸的改变对相互

作用的影响寻找与某一特定蛋白质有相互作用的蛋白质

●蛋白质相互作用图谱的绘制

随着基因组研究计划的发展，以及mRNA在不同组织器官及不同发育阶段的表达图谱的构建(body map)，蛋白质在不同时空状态下相互作用图谱（即基因组蛋白连锁图谱Genome Protein Linkage Map）。的构建也逐渐展开。在双杂交系统的BD及AD均接上cDNA库，让它们随机表达蛋白，这样检测报告基因表达的可能是A-B，B-C…等一系列崭新的蛋白一蛋白相互作用，据此可以绘出A→B→C的蛋白联系图谱。Fromont-Racine等采用了相互作用结合技术(interaction mating strategy)，将BD-诱饵蛋白质(X)与AD－基因组文库(Y)分别转化两种不同交配型单倍体酵母菌株，使两者在滤膜上结合，然后涂布于选择培养基上，挑选出阳性克隆作为诱饵蛋白质进行第二轮筛选。该方法省去了利用二倍体菌株表达时筛选过程中繁琐的交叉影印以及大量培养皿的使用，并可以显著地提高效率。

研究蛋白质－蛋白质相互作用的方法有Western blotting、免疫沉淀法、噬菌体展示技术。

4 Y2H的优点

1.酵母双杂交体系研究蛋白一蛋白相互作用的整个过程只对核酸进行操作，充分利用了