最新整理赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶知识讲解
最新丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定
1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？
2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要 避免溶血？
丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定
【目的要求】
1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作
方法。
3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。
二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖 氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全 相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法 30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是： 每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单 位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作 用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定 义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位 的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血 清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质 的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的 定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系： 1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。
பைடு நூலகம்原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。
由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
实验六-血清丙氨酸氨基转移酶的活力测定
（2）样品测定
取2支试管，标记，按下表依次加入试剂。
管号 血清/mL 基质液/mL
2，4-二硝基苯肼/mL
基质液/mL NaOH溶液/mL
对照管 0.10 ——
混匀，37℃水浴30min 0.50
混匀，37℃水浴20min 0.50 5.00
混匀，室温放置10min
测定管 0.10 0.50
0.50
—— 5.00
在505nm波长下用对照管调零，读取测定管的吸光度值， 对照标准曲线求得ALT相应的酶活力单位。
【临床意义】
肝细胞中ALT含量最丰富，，当肝脏疾病导致肝细胞损伤后， ALT即大量释放进入血液中，导致血清中ALT活性明显增高。 故测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。 ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死； 中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞； 轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、
实验六
【实验目的】
掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理及操作； 熟悉ALT标准曲线的绘制； 熟悉酶活力概念； 了解赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的评价
【实验原理】
赖氏法：
在37℃、pH7.4的条件下，以丙氨酸和ɑ-酮戊二酸为底物，ALT 催化生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸产量的多少，即反应酶活性 的大小；
试管和试管架
【实验方法】
（1试剂。
管号
空白管
1
2
3
4
5
丙酮酸标准液/mL
0
0.05 0.10
0.15
0.20
0.25
基质液/mL
0.50
0.45 0.40
0.35
0.30
实验1 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶
实验1 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【实验目的】掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理和校准曲线的绘制。
熟悉丙氨酸氨基转移酶测定的临床应用。
了解固定时间法测定酶活性的特点与应用。
【原理】丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase ，ALT ，EC 2·6·1·2）催化L-丙氨酸与α-酮戊二酸间的氨基移换反应，生成α-丙酮酸和L-谷氨酸。
经30min 反应后，加入2,4-二硝基苯肼终止反应，并与反应液中的两种α-酮酸生成相应的2,4-二硝基苯腙（丙酮酸苯腙和α-酮戊二酸苯腙）。
在碱性条件下，两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在500nm~520nm 处差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的呈色强度约为α-酮戊二酸苯腙的3倍。
据此可以计算出丙酮酸的生成量。
谷氨酸丙酮酸酮戊二酸丙氨酸-+-−−→−-+-L L ALT αα二硝基苯腙，二硝基苯肼，酮酸碱性条件-−−−→−-+-4242α（红棕色，λ=505nm ）【试剂与器材】1．0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液 称取KH 2PO 4 13.61g ，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml ，4℃保存。
2．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液 称取Na 2HPO 414.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml ，4℃保存。
3．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液420ml 和0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液80ml ，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
加氯仿数滴，4℃保存。
4．基质缓冲液（200mmol/L 丙氨酸/2.0mmol/L α-酮戊二酸） 精确称取DL-丙氨酸1.79g ，α-酮戊二酸29.2mg ，溶于0.1mol/L 磷酸盐缓冲液约50ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml ，4℃～6℃保存，该溶液可稳定2周。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定
标本的测定（改良赖氏法）
❖ 取适量基质缓冲液和待测血清，37℃水浴预温5min。 ❖ 取干净试管2支标明管号，按下表所示操作。
（对照管） 0.10 ---
基质缓冲液
0.50
❖ 混匀，放置5min，在505nm处以蒸馏水调零，读取各管吸光
度。
❖ 以测定管A测-A对之值作为标本的吸光度值，在标准曲线查得相
反应总体积
样本体积 比色杯光径
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注意事项
1、尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化 合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm的吸光度 远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定 时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了 赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确。
可不同程度的损害肝细胞，引起ALT的升高。
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器材：分光光度计、半自动生化分析仪、恒温水浴箱、微量进样
器、移液管等。
待测标本：血清
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标准曲线的绘制（改良赖氏法）
❖ 取干净试管5支标明管号，按下表所示操作。
加入物（ml）
0
1
2
3
4
0.1mol/L磷酸盐缓冲液 2.0mmol/L丙酮酸标准液
基质缓冲液 2,4二硝基苯肼溶液
0.4mol/L NaOH溶液
完全。加入NaOH溶液的方法和速度要一致，不同的
方法及速度也会导致吸光度读数的差异。
5、底物中的α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼均为呈色物
质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下
波动不应超过0.015，如超出次范围，应检查试剂及
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)
授课对象：06级检验1-5班课时：2学时血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理：丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。
生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。
根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。
试剂：1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。
2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH （COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。
3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNH AR]19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。
4．0.4mol/L NaOH溶液。
5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。
此液应新鲜配制，不得久放。
操作：血清ALT测定步骤（赖氏法）加入物（mL）R B血清0.1 0.1ALP基质液0.5 —混匀，置37o C水浴30min2.4-二硝基苯肼0.5 0.5ALP基质液—0.5混匀，置37o C水浴20min0.4mol/L NaOH 5.0 5.0将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。
实验七血清丙氨酸氨基转移酶
实验七血清丙氨酸氨基转移酶（ALT ）测定——改良赖氏法一、实验目的了解丙氨酸氨基转移酶测定原理及方法。
二、实验原理丙氨酸氨基转移酶（ALT）又称谷一丙转氨酶（GPT）。
它催化L—丙氨酸和L—谷氨酸之间氨基的转移，反应式为：丙酮酸与2，4—二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙。
此二硝基苯腙在强碱溶液中显红棕色，色泽深浅与产生的丙酮酸多少即酶活性成正比。
三、仪器和试剂1 •仪器：37C水浴恒温装置，试管和试管架，吸管，722型分光光度计。
2．试剂：⑴0.0667 mol/L 磷酸盐缓冲液。
⑵丙氨酸氨基转移酶基质液：称取DL丙氨酸1.78克，？一酮戊二酸30毫克，先溶于0.0667 mol/L 磷酸盐缓冲液约20 毫升中，用1mol/L NaOH （约0.5毫升）调节pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100毫升。
4~6 C中保存，并加一至二滴氯仿，防止细菌分解作用。
⑶2,4-二硝基苯肼溶液：溶2,4-二硝基苯肼200 毫克于热1 mol/L HCl 中，并用1 mol/L HCl 加至1 升刻度，避光保存。
⑷0.4 mol/L NaOH 溶液。
⑸丙酮酸标准液（2mmol/L ）:溶丙酮酸钠22毫克于缓冲液100毫升中，存放冰箱，此溶液在数天内是稳定的。
四、实验步骤加入物（ml）测定管测定空白管血清0.10 —加温至37 C的丙氨酸氨基转移酶基质液0.50 0.50各管分别混和，置37 C水浴30分钟，取出。
2, 4 —二硝基苯肼溶液0.50 0.50血清一0.10各管分别混匀，置37 T水浴20分钟，取出。
0.4 mol/L NaOH 溶液5.00 5.00在30分钟内用波长505nm比色，以蒸馏水校正零点和100%，读取各管吸光度测定管吸光度减去测定空白管吸光度后，于标准曲线上查得酶活性单位。
标准曲线绘制：（所加试剂按毫升计）加入物（ml）管号1 2 3 4 5丙酮酸标准液（2mmol/L ）0 0.05 0.10 0.15 0.20丙氨酸氨基转移酶基质液0.50 0.45 0.40 0.35 0.300.0667 mol/L 磷酸盐缓冲液0.10 0.10 0.10 0.10 0.10相当于丙酮酸实际含量（？mol/L）0 0.1 0.20 0.30 0.40相当于丙氨酸氨基转移酶活力（卡门氏单位）0 28 57 97 150各管混匀后置37 T水浴5分钟，加2,4—二硝基苯肼溶液0.5毫升混匀，置37 C 水浴20分钟，取出，每管各加0.4 mol/L NaOH溶液5.0毫升，于30分钟内用波长505nm比色，以蒸馏水校正零点和100%，读取各管吸光度。
赖氏法实验报告
1. 掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的原理和方法。
2. 学会操作赖氏法测定ALT活性的实验步骤。
3. 熟悉ALT测定的临床应用及注意事项。
二、实验原理赖氏法是一种常用的酶偶联速率法，用于测定血清中ALT活性。
该方法利用ALT催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸在磷酸盐缓冲液中进行反应，生成L-丙酮酸和α-酮戊二酸，同时NADH被氧化为NAD+。
在特定波长下，NADH的吸光度与ALT活性呈线性关系，通过测定吸光度变化，计算出ALT活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）血清样本（2）赖氏法ALT测定试剂盒（3）磷酸盐缓冲液（4）L-丙氨酸（5）α-酮戊二酸（6）NADH（7）NAD+（8）分光光度计2. 实验仪器：（1）恒温水浴箱（2）移液器（3）离心机（4）微量滴定板1. 样本处理：取血清样本，按照试剂盒说明书进行稀释。
2. 标准曲线制备：（1）取6个微量滴定板，分别加入不同浓度的标准ALT溶液。
（2）向每个板中加入一定量的磷酸盐缓冲液，混匀。
（3）加入一定量的L-丙氨酸和α-酮戊二酸，混匀。
（4）将滴定板放入恒温水浴箱中，设定反应时间。
（5）反应结束后，加入一定量的NADH和NAD+，混匀。
（6）在特定波长下测定吸光度，以ALT浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样本测定：（1）按照标准曲线制备的步骤，向微量滴定板中加入血清样本。
（2）按照标准曲线制备的步骤，进行反应和测定吸光度。
（3）根据标准曲线，计算血清样本的ALT活性。
五、结果与分析1. 标准曲线制备：根据标准曲线，得出线性方程为y=0.0068x+0.0015，其中y为吸光度，x为ALT浓度。
2. 样本测定：根据标准曲线，计算血清样本的ALT活性为40 U/L。
六、讨论1. 赖氏法测定ALT活性的原理和步骤简单，操作方便，准确度高。
2. 实验过程中，要注意反应时间的控制，以保证反应充分进行。
3. 标准曲线的制备是实验的关键环节，要确保标准曲线的线性关系良好。
赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶
附：血清门冬氨酸氨基转移酶测定
实验原理
AST速率法测定中的酶偶联反应式为：
L 天门冬氨酸 酮戊二酸 AST L 谷氨酸 草酰乙酸
草酰乙酸 NADH H MDH L 苹果酸 NAD
连续监测法测定NADH被氧化为NAD+，可在340nm处连续监测到 NADH的被氧化引起吸光度下降速率（-ΔA/min），该下降速率与 AST活性呈正比。
2.待测标本 病人血清或质控血清
3.仪器以半自动生化分析仪为例
操作步骤
向光径1.0cm的石英比色皿中加入血清100μl，加入 预温试剂1 000μl，混匀，（37±0.1）℃。在波长 340nm处，孵育时间90s，连续监测吸光度下降速 率60s。根据线性反应期吸光度下降速率（ΔA/min），计算出AST活性单位。
t b
Vs
b
Vs
思考题
1．赖氏法测定血清ALT时校准曲线为何不是直线？校准曲线制作有哪些特点？
。 2．简述固定时间法测定酶活性的优缺点（见P268)
返回章目录ຫໍສະໝຸດ 4．严重脂血、黄疸及溶血血清可增加测定的吸光度。 糖尿病酮症酸中毒病人血中因含有大量酮体，能和 2,4-二硝基苯肼作用呈色，也会引起测定管吸光度 增加。因此，检测此类标本时，应作血清标本对照 管。
5．绘制校准曲线时必须注意：由于赖氏方法的特点， 每一个点必须做3管以上的重复测定，显色后以蒸馏 水调节吸光度为零，读取各管的吸光度。求出各标 准管的吸光度均值，减去“1”管吸光度均值后，对 照赖氏单位绘制校准曲线。由于每批试剂都有差异， 因此每换一个批号的试剂必须重新绘制曲线。
❖
2.ALT、AST、ALT/AST指标的临床应用
实验原理
L 丙氨酸α 酮戊二酸ALTα 丙酮酸 L 谷氨酸 α 酮酸 2，4 二硝基苯肼碱性条件2，4 二硝基苯腙
血清丙氨酸氨基转移酶
医学ppt
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实验试剂：
（1）ALT底物液【2 mmol/Lα-酮戊二酸 , 20 mmol/L丙
氨酸】
（2）pH=7.4的PBS
（3）丙酮酸标准液[2 mmol/L] （4）2,4二硝基苯肼
溶液【1 mmol/L]
(5) 0.4 mmol/L NaOH
制（ 作）
活 力 的 测 定 标 准 曲 线 的
？
答：α-酮戊二酸因其量不多，加之对520nm的 吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强 ，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单 位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖 氏法一些固有弊端，α-酮戊二酸对于结果影响 不大，测定结果也比其他比色法（金氏法（King法
）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法））
体内，可引起高铁血红蛋白血症，出现
紫绀 遇明火极易燃烧爆炸。干燥时
经震动、撞击会引起爆炸。燃烧时放出
有毒的刺激性烟雾。与氧化剂混合能形
成爆炸性混合物。【有害燃烧产物】
医学一pp氧t 化碳、二氧化碳、氮氧化物
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α-酮戊二酸也能与 2,4二硝基苯肼结合成相应的 苯腙，在碱性条件下显色。对实验结果有何影响
卡氏测定ALT活力的原理
答：丙氨酸+ α-酮戊二酸 ALT 谷氨酸+丙酮酸 丙酮酸+NADH 乳酸脱氢酶 乳酸+NAD+
医学ppt
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小结：区别与联系
医学ppt
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实验原理：
医学ppt
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知识链接：
• 转氨基作用
是一种α-氨基酸的α-氨基转移到一种α-酮酸上的过程。转氨
基作用是氨基酸脱氨基作用的一种途径。其实可以看成是氨
实验7赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶20页PPT
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)
授课对象：06级检验1-5班课时：2学时血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理：丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。
生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。
根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。
试剂：1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。
2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH （COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。
3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNH AR]19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。
4．0.4mol/L NaOH溶液。
5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。
此液应新鲜配制，不得久放。
操作：血清ALT测定步骤（赖氏法）加入物（mL）R B血清0.1 0.1ALP基质液0.5 —混匀，置37o C水浴30min2.4-二硝基苯肼0.5 0.5ALP基质液—0.5混匀，置37o C水浴20min0.4mol/L NaOH 5.0 5.0将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。
赖氏法-ALT
赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【原理】L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 α-丙酮酸 + L-谷氨酸 α-丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼 2，4-二硝基苯腙（红棕色，λ=505nm ）利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，求出样品中丙氨酸氨基转移酶（ALT ）活性。
【试剂】1．0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液 称取KH 2PO 4 13.61g ，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml ，4℃保存。
2．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液 称取Na 2HPO 414.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml ，4℃保存。
3．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取420ml 0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
加氯仿数滴，4℃保存。
4．基质缓冲液 精确称取D-L-丙氨酸1.79g ，α-酮戊二酸29.2mg ，先溶于0.1mol/L 磷酸盐缓冲液约50ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml ，4～6℃保存，该溶液可稳定2w 。
每升底物缓冲液中可加入麝香草酚0.9g 或加氯仿防腐，4℃保存。
配成200mmol/L 丙氨酸与2.0mmol/Lα-酮戊二酸基质缓冲液。
5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液 称取2，4-二硝基苯肼（AR ）19.8mg ，溶于1.0mol/L 盐酸100ml ，置棕色玻璃瓶中，室温中保存，若冰箱保存可稳定2个月。
若有结晶析出，应重新配制。
6．0.4mol/L NaOH 溶液 称取NaOH 1.6g 溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至100ml ，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。
7．2.0mmol/L 丙酮酸标准液 准确称取丙酮酸钠（AR ）22.0mg ，置于100ml 容量瓶中，加0.05mol/L 硫酸至刻度。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定(改良赖氏法)
什么是改良赖氏法？
卡门法
赖氏法
丙酮酸+α-酮戊二酸 谷氨酸+丙氨酸 丙酮酸→NAD++乳酸 在紫外分光光度法中，NADH在 340nm波长处的吸光度降低值与ALT 活性成正比。 卡门氏酶单位：1ml血清（反应溶液 总量为3ml）在340nm波长下，用内 径喂1.0cm的比色皿，在25摄氏度， 1分钟内生成的丙酮酸，在乳酸脱氢 酶催化下，使NADH+H+变成NAD+， 光密度下降0.001为一个转氨酶活性 单位。
临床意种组织中，但 在肝细胞中含量最多，当肝脏有病变，特别是 急性肝炎及肝细胞坏死是，血清中ALT活性显 著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时，此 酶活性也可或轻度增高。另外，其他脏器或组 织的疾病，该酶活性也升高。
注意事项
1.不同血清对照管光密度基本相同，因此，同一批标本制作2~3个血清 对照管求其平均值即可，亦可用空白管代替对照管。对超过正常的标本 进行复查时，每份标本均应作对照管。 2.严重脂血症、黄疸或溶血的血清都能引起测定管OD值增加，因此，检 查此类标本时，应做血清对照管。 3.赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位，其线性关系良好。超过此活力的 标本，应将血清稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。 4.ALT底物液与2，4-二硝基苯肼液配置要准确，每次测定时空白管的 OD值上下波动不应超过0.015.如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的 问题。 5.除了丙酮酸与2，4-二硝基苯肼再碱性溶液中能成腙外，α -酮戊酸亦 能与2，4-二硝基苯肼产生苯腙，两种苯腙的吸光度在520nm处有较大 差异，因此超过一定范围时，该方法所绘制的标准曲线呈抛物线。
2.酶活性的测定：取试管2支，注明测定管及对照管，
生化检验实验赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶
步骤：一．组长取5个试剂瓶贴标签注明将要装的实际名称，然后倒取试剂。
血清由老师分装后，由组长领取。
二．测定血清ALT1.取2支试管，贴标签注明组别、学号、对照管（B）和测定管（U），用微量移液器分别加0.1ml血清。
2.用移液管向U管中加入0.5ml基质缓冲液。
B管不加。
混匀后同时在水浴温箱中37℃保温30min。
作用：U管中有酶促反应，B管无。
3.用移液管向B、U管各加0.5ml 2,4-二硝基苯肼溶液。
作用：终止反应，生成显色物质。
4.用移液管向B管加入0.5ml基质缓冲液，U管不加。
混匀后在水浴温箱中37℃保温20min。
作用：保证检测条件的一致性。
5.用移液管向B、U管各加2,4-二硝基苯肼溶液作用：碱性条件，显色。
6.B、U管室温放置5min，在波长505nm以蒸馏水调零，读取吸光度。
注意：基质缓冲液和2,4-二硝基苯肼溶液的加入顺序不能颠倒A。
表13-7三．ALT标准曲线绘制1.取5支试管，贴标签标明组别、学号、序号（0、1、2、3、4）。
用移液管取0.1 mol/l磷酸盐缓冲液，各加0.1ml。
2.用移液管取2.0 mol/l丙酮酸标准液加入各试管，0管不加，1、2、3、4管各加0.05、0.10、0.15、0.20ml。
作用：代替酶促反应产物。
3.用移液管取基质缓冲液加入各试管，0、1、2、3、4管分别加0.50、0.45、0.40、0.35、0.30ml。
4.用移液管取2,4-二硝基苯肼溶液加入各试管，各加0.5ml。
5.混匀，各试管同时在水浴温箱中37℃保温20min。
6.用移液管向各试管加2,4-二硝基苯肼溶液。
7.混匀，室温放置5min，在波长505nm以蒸馏水调零，读取吸光度A。
各管吸光度减去0管吸光度为该标准管的吸光度值。
8.以吸光度值为纵坐标，对应的卡门单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸光度值作图，即成标准曲线。
表13-6。
标曲线血清丙氨酸氨基转移酶测定(赖氏法.
3. 标本的测定 按表2操作。
表二：
对照管 基质液（ul） 样品（ul） 显色剂 50 250 μ L 混合37℃水浴30分钟 250 μ L 样品管 250 50
基质液（ul） 37℃水浴20分钟
稀释氢氧化钠
250
2.5ml 2.5ml
室温放置3min，在波长510nm处，以蒸馏水调零，读取各 管吸光度。
血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）
【实验要求】 掌握血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）的 原理 操作方法及标准曲线的绘制； 了解试剂的配制和临床意义。
【实验原理】
L-丙氨酸与α -酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶 （alanine aminotransferase，ALT，EC 2.6.1.2）催化下生成丙酮酸和L-谷氨酸，加入 2，4-二硝基苯肼终止酶反应，并与丙酮酸生 成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，苯腙在碱性条件 下显红棕色，在波长510nm处读取吸光度， 即可计算出丙氨酸氨基转移酶的活性。
【计算】 以空白调零，测定管吸光度减去对照管吸光度 的差值为标本的吸光度，用该值在标准曲线上 查得ALT的卡门单位。 或者以对照管调零，直接读出测定管吸光度值， 用该值在标准曲线上查得ALT的卡门单位。
【参考范围】 0～50卡门单位 【临床意义】 1.血清ALT活性增高可见于下述疾病：（1）肝胆疾病 传染性肝炎、肝癌、肝硬化活动期、中毒性肝炎、脂 肪肝、胆管炎和胆囊炎等；（2）心血管疾病 心肌梗 死、心肌炎、心力衰竭时的肝脏淤血、脑出血等；（3） 骨骼肌疾病 多发性肌炎、肌营养不良等。 2.一些药物和毒物可引起ALT活性升高 如氯丙嗪、异 烟肼、利福平、奎宁、地巴唑、水杨酸制剂、乙醇、 铅、汞、四氯化碳、有机磷等。停药后ALT活性就可下 降。
赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶(相关知识)
实验十九 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【原理】L-丙氨酸 + α-酮戊二酸−−→−ALT α-丙酮酸 + L-谷氨酸 α-丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼−−−→−碱性条件下2，4-二硝基苯腙 （红棕色，λ=505nm ）利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，求出样品中丙氨酸氨基转移酶（ALT ）活性。
【试剂】1．0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液 称取KH 2PO 4 13.61g ，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml ，4℃保存。
2．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液 称取Na 2HPO 414.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml ，4℃保存。
3．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取420ml 0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
加氯仿数滴，4℃保存。
4．基质缓冲液 精确称取D-L-丙氨酸1.79g ，α-酮戊二酸29.2mg ，先溶于0.1mol/L 磷酸盐缓冲液约50ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml ，4～6℃保存，该溶液可稳定2w 。
每升底物缓冲液中可加入麝香草酚0.9g 或加氯仿防腐，4℃保存。
配成200mmol/L 丙氨酸与2.0mmol/Lα-酮戊二酸基质缓冲液。
5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液 称取2，4-二硝基苯肼（AR ）19.8mg ，溶于1.0mol/L 盐酸100ml ，置棕色玻璃瓶中，室温中保存，若冰箱保存可稳定2个月。
若有结晶析出，应重新配制。
6．0.4mol/L NaOH 溶液 称取NaOH 1.6g 溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至100ml ，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。
7．2.0mmol/L 丙酮酸标准液 准确称取丙酮酸钠（AR ）22.0mg ，置于100ml 容量瓶中，加0.05mol/L 硫酸至刻度。
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实验十九 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶
【原理】
L-丙氨酸 + α-酮戊二酸
−−→−ALT α-丙酮酸 + L-谷氨酸 α-丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼
−−−→−碱性条件下2，4-二硝基苯腙 （红棕色，λ=505nm ）
利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，求出样品中丙氨酸氨基转移酶（ALT ）活性。
【试剂】
1．0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液 称取KH 2PO 4 13.61g ，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml ，4℃保存。
2．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液 称取Na 2HPO 414.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml ，4℃保存。
3．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取420ml 0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
加氯仿数滴，4℃保存。
4．基质缓冲液 精确称取D-L-丙氨酸1.79g ，α-酮戊二酸29.2mg ，先溶于0.1mol/L 磷酸盐缓冲液约50ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml ，4～6℃保存，该溶液可稳定2w 。
每升底物缓冲液中可加入麝香草酚0.9g 或加氯仿防腐，4℃保存。
配成200mmol/L 丙氨酸与2.0mmol/Lα-酮戊二酸基质缓冲液。
5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液 称取2，4-二硝基苯肼（AR ）19.8mg ，溶于1.0mol/L 盐酸100ml ，置棕色玻璃瓶中，室温中保存，若冰箱保存可稳定2个月。
若有结晶析出，应重新配制。
6．0.4mol/L NaOH 溶液 称取NaOH 1.6g 溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至100ml ，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。
7．2.0mmol/L 丙酮酸标准液 准确称取丙酮酸钠（AR ）22.0mg ，置于100ml 容量瓶中，加0.05mol/L 硫酸至刻度。
此液不稳定，应临用前配制。
丙酮酸不稳定，开封后易变质（聚合），相互聚合为多聚丙酮酸，需干燥后使用。
8．待测标本 病人血清或质控血清。
【操作步骤】
1．ALT 校正曲线绘制：
（1）按表19-1向各管加入相应试剂。
表19-1 ALT 各标准管的配制方法
加入物（ml ） 1 2 3 4 5 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 2.0mmol/L 丙酮酸标准液 0 0.05 0.10 0.15 0.20 基质缓冲液 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 2,4-二硝基苯肼溶液
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
混匀，37℃水浴20min
0.4mol/L NaOH溶液 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
相当于酶活性浓度（卡门氏单位）0 28 57 97 150 （2）混匀，放置5min，在波长505nm处，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，各管吸光度均减“1”号管吸光度为该标准管的吸光度值。
（3）以吸光度值为纵坐标，对应的酶卡门氏活性单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸光度值作图，即成校正曲线。
2．标本的测定
（1）在测定前取适量的底物溶液和待测血清，37℃水浴预温5min后使用；具体操作按表19-2进行。
表19-2 赖氏法测定ALT操作步骤
加入物（ml）对照管测定管
血清0.1 0.1
基质缓冲液－0.5
混匀后，置37℃保温30min
2,4-二硝基苯肼溶液0.5 0.5
基质缓冲液0.5 －
混匀后，置37℃保温20min
0.4mol/L NaOH溶液 5.0 5.0
（2）室温放置5min，在波长505nm处以蒸馏水调零，读取各管吸光度。
【计算】
测定管吸光度减去样本对照管吸光度的差值为标本的吸光度。
该值在校正曲线上查得ALT的卡门氏单位。
【参考范围】
血清ALT：5～25卡门氏单位。
【临床意义】
ALT在肝细胞中含量较多，且主要存在于肝细胞的可溶性部分。
当肝脏受损时，此酶可释放入血，致血中该酶活性浓度增加，故测定ALT常作为判断肝脏受损指标。
1．肝细胞损伤的灵敏指标急性病毒性肝炎转氨酶阳性率为80%～100%，肝炎恢复期，转氨酶转入正常，但如在100U左右波动或再度上升为慢性活动性肝炎；重症肝炎或亚急性肝坏死时，再度上升的转氨酶在症状恶化的同时，酶活性反而降低，是肝细胞坏死后增生不良，预后不佳。
以上说明，监测转氨酶可以观察病情的发展，并作预后判断。
2．慢性活动性肝炎或脂肪肝转氨酶轻度增高（100～200U），或属正常范围，且AST＞ALT。
肝硬化、肝癌时，ALT有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后严重。
其它原因引起的肝脏损害，如心功能不全时，肝淤血导致肝小叶中央带细胞的萎缩或坏死，可使ALT、AST明显升高；某些化学药物如异菸肼、氯丙嗪、苯巴比妥、四氯化碳、砷剂等可不同程度地损害肝细胞，引起ALT的升高。
3．其他疾病或因素亦会引起ALT不同程度的增高，如骨路肌损伤、多发性肌炎等。
【注意事项】
1．丙酮酸标准液的配制丙酮酸不稳定，见空气易发生聚合反应，生成多聚丙酮酸，而失去其化学性质。
在配制校正曲线时，不会出现显色反应。
此时应将变性的丙酮酸放在干燥箱（40～55℃）2～3h，或干燥器中过夜后再使用。
2．基质液中的α-酮戊二酸和显色剂2，4-二硝基苯肼均为呈色物质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，如超出此范围，应检查试剂及仪器等方面问题。
3．血清中ALT在室温（25℃）可以保存2d，在4℃冰箱可保存1w，在－25℃可保存1个月。
一般血清标本中内源性酮酸含量很少，血清对照管吸光度接近于试剂空白管（以蒸馏水代替血清，其它和对照管同样操作）。
所以，成批标本测定时，一般不需要每份标本都作自身血清对照管，以试剂空白管代替即可，但对超过正常值的血清标本应进行复查。
严重脂血、黄疸及溶血血清可引起测定的吸光度增高；糖尿病酮症酸中毒病人血中因含有大量酮体，能和2，4-二硝基苯肼作用呈色，也会引起测定管吸光度增加。
因此，检测此类标本时，应作血清标本对照管。
4．赖氏法考虑到底物浓度不足，酶作用产生的丙酮酸的量不能与酶活性成正比，故没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位。
赖氏法校正曲线所定的单位是用比色法的实验结果和卡门分光光度法实验结果作对比后求得的，以卡门氏单位报告结果。
卡门法是早期的酶偶联速率测定法，卡门氏单位是分光光度单位。
定义为血清1ml，反应液总体积3ml，反应温度25℃，波长340nm，比色杯光径1.0cm，每min吸光度下降0.001A 为一个卡门氏单位（相当于0.48U）。
赖氏法的测定温度原为40℃，校正曲线只到97个卡门氏单位，后来改用37℃测定将校正曲线延长至150卡门氏单位。
赖氏比色法测定由于受底物α-酮戊二酸浓度和2，4-二硝基苯肼浓度的不足以及反应产物丙酮酸的反馈抑制等因素影响，校正曲线不能延长至200卡门氏单位。
当血清标本酶活力超过150卡门氏单位时，应将血清用0.145mol/L NaCl溶液稀释后重测，其结果乘以稀释倍数。
5．加入2，4-二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全。
加入NaOH溶液的方法和速度要一致，如液体混合不完全或NaOH溶液的加入速度不同均会导致吸光度读数的差异。
呈色的深浅与NaOH的浓度也有关系，NaOH浓度越大呈色越深。
NaOH溶液＜0.25mol/L 时，吸光度下降变陡，因此NaOH浓度要准确。
【评价】
1．重复性差其原因有三：①由于限制底物α-酮戊二酸的用量，如一般采用2.0mmol/L 的浓度，反应速度只有最大反应速度的65%，使产物生成量与酶的活性之间不能呈现良好的线形关系。
②2，4-二硝基苯肼在碱性条件下也能显色，为了降低试剂空白的吸光度而不得不使用低浓度的2，4-二硝基苯肼（1.0mmol/L）。
此种水平的2，4-二硝基苯肼仅能与反应体系中的两种酮酸的一半反应。
酶促反应中2，4-二硝基苯肼与这两种酮酸的结合显色度不易控制。
低浓度的2，4-二硝基苯肼使校正曲线弯曲呈非线性也影响测定结果。
③产物旁路效应，即ALT催化生成的产物丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下而消耗，从而影响测定结果。
这种现象称为产物旁路效应。
2．准确性差①由于线性范围狭窄，测定温度为40℃，校正曲线只到97个卡门氏单位，测定温度为37℃时校正曲线延长至150卡门氏单位。
但临床病人标本多见为200卡门氏单位以上。
尽管采用标本稀释后再测定，结果乘以稀释倍数，但偏差大。
②影响实验条件的因素多，而且不易控制，系统误差大。
3．试剂稳定性差基质液不易保存（易长菌），易失效，故保存期短。
影响试剂的批间结果的一致性。
4．操作简便，实验条件要求不高，便于基层医疗单位开展。
5．赖氏法是比色法中比较合理的方法。
可以理解为它最大限度地减小了比色法所固有的缺点，使测定结果能较好地反映酶的真实活性。
但从总体上说，由于设计原理的不足，使赖氏法不能成为ALT的理想测定方法并终将被连续监测法或其他先进方法所取代。