5 生产菌种的制备和保藏
发酵工程第五章
发酵工程
3.一级种子培养 培养基：水解糖2.5%，尿素0.5%，玉米 浆 2.5%，K2HPO4 0.1%, ph7.0
培养条件：在种子罐中培养, 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
发酵工程
最终发酵 培养基成分：水解糖2.5%；尿素0.5%，玉米
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶 段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌 体。
如： 谷氨酸的种子培养。
发酵工程
b.对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子 在固体培养基上产生大量孢子
获得一定数量和质量的菌丝体 在液体培养基中生产大量菌丝
发酵工程
2.2培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对 孢子培养基应该是有利于孢子的生长。
发酵工程
根据文献记载，多数微生物，如病毒、 细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等 都能冻干保藏。许多菌种用此法可保 藏10年以上。
发酵工程
5. 液氮超低温保藏法
几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液 氮超低温保藏。只有少量对低温损伤敏感 的微生物例外。
发酵工程
液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存 于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管(材料应 能耐受较大温差骤然变化)内，放到-150～ -196℃的液氮罐或液氮冰箱内保藏。操作 过程中一大原则是“慢冻快融”。
发酵工程
为了减轻冷冻损伤程度，可采用保护剂。 如甘油和二甲亚砜。
发酵工程
注意：
液氮冷冻保藏管应严格密封。若有液氮渗 入管内，在从液氮容器中取出时，管中液 氮的体积将膨胀680倍，具很强的爆炸力， 必须特别小心。
菌种保存方法
菌种保藏方法中国工业微生物菌种保藏管理中心微生物菌种保藏对于微生物菌种的研究和利用至关重要。
以下是中国工业微生物菌种保藏管理中心整理的目前国际国内常用的菌种保藏方法，包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法，各种菌种保藏方法都有详细的步骤说明。
定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
生产菌种的扩大培养与保藏简介
生产菌种的扩大培养与保藏简介1. 引言生产菌种的扩大培养与保藏是微生物工程中不可或缺的重要环节。
在微生物工业中，菌种数量的扩大和保藏对于生产规模的控制和后续的实验操作至关重要。
本文将介绍生产菌种的扩大培养和保藏的基本原理、方法和注意事项。
2. 菌种的扩大培养菌种的扩大培养是将初始的菌株培养至足够数量供生产使用的过程。
以下是菌种的扩大培养的基本步骤：2.1 选择培养基根据菌株的特性和要求，选择适当的培养基进行扩大培养。
常见的培养基包括富含营养物的培养基和特殊功能的培养基。
2.2 菌种的预培养在扩大培养前，先进行菌种的预培养。
从保存的菌种中挑取适量的菌落或菌点接种到预培养培养基中，进行为期数小时的预培养。
2.3 液体扩大培养将预培养的菌种转移到液体培养基中，并进行液体扩大培养。
根据需要的菌种数量，选择适当的容器和培养条件进行扩大培养。
2.4 固体扩大培养液体培养经过一定周期后，可以将菌种转移到固体培养基中进行固体扩大培养。
固体培养可以有助于菌落的生长和分离。
2.5 菌种的检测和纯化在扩大培养结束后，需要对菌种进行检测和纯化。
常用的方法包括菌落PCR、生化测试和纯化子代的分离。
3. 菌种的保藏菌种的保藏是为了长期保存和储备菌种，保证其稳定性的一系列措施。
以下是常见的菌种保藏方法：3.1 冷冻保存法将菌种在适当的保存液中制备冻存物，并存放在低温冰箱或液氮罐中。
常用的保存液包括甘露醇、甘油等。
3.2 干燥保存法将菌种在无菌条件下培养至晚期生长期，用无菌纱布吸干培养基上的菌落，将菌落贴附在无菌纸上，然后将纸张放置在干燥剂中保存。
3.3 冷冻干燥法通过冷冻和干燥的交替操作，将菌种制备为干燥粉末，再用密封容器保存。
冷冻干燥法在菌种保存期间能保持菌种的高度稳定。
3.4 液氮冷冻保存法将菌种悬浮液或培养物直接置于液氮罐中，利用极低温度保存菌种。
这种方法能够保留菌种的生物学特性，并保证菌种长期保存。
4. 注意事项在进行生产菌种的扩大培养和保藏时，需要注意以下事项：•严格遵守无菌操作规范，防止污染和交叉感染。
菌种制作及保藏
第六节 消毒与灭菌
一、概念 1、 灭菌 ：在一定范围内彻底杀灭物料及其容 、 器中的一切微生物。 器中的一切微生物。 2、消毒： 用物理或化学的方法，消灭物体表 、消毒： 用物理或化学的方法， 面或环境中一部分微生物的措施。 面或环境中一部分微生物的措施。也称简易非 彻底的灭菌。 彻底的灭菌。在医学上泛指对病原微生物的杀 灭。
加棉塞
质检
三、 各级菌种的培养时间 1、试管种 7-10天 、 天 2、二级种 30-60天 、 天 3、三级种 30-60天 、 天
四、全年菌种生产时间安排 时间 名称 香菇 木耳 银耳 金针菇 侧耳类 猴头菇 双孢菇 草菇 段木 2-4月 月 3-4月 月 3-4月 月 袋料 8-9月 月 2-3月(春) 8-9月(秋) 月春 月秋 3-4月(春) 9-10月(秋) 月春 月秋 11-1月 月 2-4月(春) 8-10月(秋) 月春 月秋 3-4月(春) 8-9月(秋) 月春 月秋 9-10月 月 6-8月 (华中 4-10月(华南 华中) 华南) 月 华中 月 华南
三、常用药品 1、HgCl2 、 2、C2H5OH（60%—70%） 、 （ ） 3、KMnO4 、 4、CH3COOOH（过氧乙酸） 、 （过氧乙酸） 5、HCHO(38%) 、 6、C6H4CH3OH（来苏尔） 、 （来苏尔） 7、C6H5OH 、 8、C21H38NB（新洁尔灭） 、 （新洁尔灭） 9、气雾消毒盒 、
二、培养基的类型及应用 (一)、按培养基的物理状态分液体培养基、固化 一 、按培养基的物理状态分液体培养基、 培养基和固体培养基 (二)、按营养物质的成分；可分为天然培养基、 二 、按营养物质的成分；可分为天然培养基、 半合成培养基和合成培养基 (三)、根据培养基的主料，可分为马铃薯培养基、 三 、根据培养基的主料，可分为马铃薯培养基、 玉米粉培养基、胡萝卜培养基、果汁培养基、 玉米粉培养基、胡萝卜培养基、果汁培养基、棉 籽壳培养基、麦粒培养基、木屑培养基、木块培 籽壳培养基、麦粒培养基、木屑培养基、 养基、粪草培养基等。 养基、粪草培养基等。
菌种保藏的方法
菌种保藏的方法菌种是国家重要的生物资源，鉴于其自身的遗传性和变异性，在菌种保藏过程中，如何降低菌种的衰亡速度，防止杂菌污染，保持菌种遗传性状不变异，使优良高产菌株长期在生产中应用，成为食用菌领域一项重要的课题。
为适应群众性生产的需要，为适应群众性生产的需要，本文介绍了几种简单易行、实用效果好的菌种保藏方法。
一、菌种保藏基本原理通过低温、干燥、缺氧和饥饿等手段来达到最大限度降低菌丝体的生理代谢。
首先要挑选优良纯菌种，包括菌丝体和它们的孢子；其次，根据其生理、生化特点，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。
二、菌种保藏的方法试管斜面菌种系列保存方法1低温定期移植保藏法将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3~5℃低温干燥处或4℃冰箱中保藏，每隔3~6个月移植转管1次，具体应根据菌种特性决定。
保藏时要注意环境湿度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。
因此，若用棉塞，可用干净的塑料薄膜或牛皮纸包扎棉塞，也可用无菌的白胶塞，并用石蜡涂封，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。
除草菇外，大多食用菌菌种都能采用此法保藏。
2液体石蜡保藏法取化学纯液体石蜡装于三角瓶中高压灭菌后，放入40℃恒温箱中，蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。
将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28～30℃下培养2～3d，证明无杂菌生长方可使用。
然后将母种接在斜面培养基上，当菌丝在斜面上生长丰满后，将液体石蜡注在斜面上，注入量以高出斜面1cm为宜，使菌种与空气隔绝，降低其新陈代谢能力。
管口用灭过菌的白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，直立放在室内干燥处或冰箱内保藏。
一般可保存1年以上，在低温下保藏时间还可延长。
使用时从斜面上挑取菌丝少许，移接到新鲜斜面培养基上，经培养即可。
由于菌丝体沾有液体石蜡而影响其生长，需再经1次移接才能恢复正常生长。
生产菌种的选育培养—菌种的扩大培养及保藏
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
食用菌技术复习题答案
第一章食用菌基础1.名词解释菌丝：在培养基上向各个方向呈辐射状延伸、分支的每一根细线，称为菌丝。
细胞管状，壁薄、透明，细胞内含有一个、两个或多个细胞核。
菌丝体：是由基质内无数纤细的菌丝交织而成的丝状体或网状体。
单核菌丝：由担孢子萌发后，先形成没有隔膜的多核初生菌丝，然后再形成许多隔膜，使之成为每个细胞仅有一个细胞核的菌丝，称为单核菌丝。
双核菌丝：担子菌类食用菌中，单核菌丝仅占很短时间，两个单核菌丝很快结合，发生质配，但不核配，形成每个细胞内含有二个细胞核的菌丝，称双核菌丝。
锁状联合：是双核菌丝细胞分裂的一种特殊形式，先在双核菌丝的顶端细胞的两核之间的细胞壁上产生一个小突起，形似小分枝，分枝向下弯曲，其顶端与细胞的另一处融合，在显微镜下观察，形似一把锁，故称为“锁状联合”菌核：真菌在生活过程中由菌丝密集而形成的块状或颗粒状的休眠体。
菌索：由菌丝密集而成的绳索状的结构。
其外貌与根相似，故又称根状菌索。
子座：由菌丝密集而成的容纳子实体的垫状结构。
子实体：是食用菌的繁殖器官，是由分化的菌丝体组成，能产生孢子的菌体或菇体。
菌褶：菌盖下面辐射状生长的薄片叫菌褶。
孢子：是一种有繁殖功能的休眠细胞，分为有性孢子和无性孢子两大类。
菌柄：位于菌褶下方，是菌盖的支持物。
菌环：有些食用菌在幼小时，菌柄和菌盖之间有一包膜相连，子实体长大时，该膜破裂，一部分留在菌盖边缘，一部分留在菌柄上。
留在菌柄上的称为菌环。
菌托：有些食用菌幼年时，其菌蕾的外包着一层膜。
菌蕾长大，外膜破裂，留在菌柄基部的残膜称为菌托。
同宗配合：由一个担孢子萌发的两条单核菌丝能进行结合而生育后代者，称为同宗结合或自交亲和。
初级同宗配合：由同核体产生的同宗结合，如草菇：细胞内两个核没有遗传性差异。
（次级同宗配合：由异核体产生的同宗结合，如双孢蘑菇：担子上只生两个担孢子，每个担孢子含有一对异核体。
异宗配合：多数食用菌的单核菌丝有性别之分，常用“－”与“＋”表示。
生产菌种的培养与保存
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；
(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几 度的细胞冻结点(通常为-30℃)；
(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生 相变；
(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；
(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或 气相(-156℃)中 保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰 箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
种子扩大培养是指将保存在砂土管、 冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入 试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质 量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子 。
种子扩培的目的
接种量的需要
菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积 20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧， 则需先用玻璃珠打散；0.5-1ml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专 用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置 于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。
生产中常用菌种的分离、选育和保藏
生产中常用菌种的分离、选育和保藏在生产中，分离、选育和保藏常用菌种是非常重要的步骤，这些菌种可以用于各种不同的应用，如发酵过程中的生物转化、抗生素的生产以及食品工业中的乳酸发酵等。
以下是常用菌种的分离、选育和保藏的基本步骤：1. 分离：分离菌种是指从自然环境中分离出纯种菌株的过程。
首先，需要选择合适的样品来源，如土壤、水样或食品样品等。
然后，将样品进行稀释、接种到固体培养基上，培养出菌落。
最后，从菌落中挑选单一菌株，并进行纯化培养，得到纯种菌株。
2. 选育：选育是指对已有菌种进行进一步培养和筛选，选出优良品系。
在选育过程中，可以根据所需特性进行筛选，如产量高、抗性强或代谢产物优良等。
通过连续传代培养和筛选，可以逐步培育出符合要求的优良品系。
3. 保藏：保藏是为了长期储存和保存已经分离和选育得到的菌种。
常用的保藏方法包括冷冻保存和冷冻干燥等。
冷冻保存是将菌种保存在低温 (-80℃或液氮温度下)，可以长期保存并保持菌株的生物学性状。
而冷冻干燥则是在低温下将菌种先冷冻，然后通过真空蒸发使其脱水，最后用密封容器保存。
冷冻干燥具有长期保存时间和较小的储存体积的优点。
在菌种的分离、选育和保藏过程中，需要注意的是严格遵守无菌操作规范，以防止杂菌污染。
另外，应该建立相应的菌种信息管理系统，记录并标注每个菌株的来源、特性以及保藏条件等重要信息，以便日后使用和查询。
菌种的分离、选育和保藏在生产中扮演着极其重要的角色。
下面将进一步探讨这些过程，并介绍一些常用的菌种及其应用领域。
在分离菌种的过程中，重要的是选择适当的样品来源。
不同的环境中存在着各种微生物，如土壤、水体、植物、动物及其制品等。
通过采集不同来源的样品，可以获得不同类型和特性的微生物，从而得到多样性的菌株资源。
在接种前，样品经过稀释，使微生物适当分散。
然后将稀释液均匀接种于固体培养基上，并进行孵育。
在培养过程中，微生物通过分裂繁殖形成菌落，而每个菌落代表一个菌株。
5菌种保藏的原理和方法
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方法。
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（六）液氮保藏法
原理：低温 悬浮介质： 10%甘油或5%的二甲亚砜 机理：甘油或二甲亚砜可进入细胞，并通过降低强烈的
脱水作用而保护细胞。 甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 适用菌种：适用于所有微生物、动植物细胞保藏。 保藏期：置液氮内（-196 ℃ ），保存5-10年。 特点：保藏期最长，但保藏费用高，仅用于保存经济价
4 菌种保藏的原理和方法
菌种保藏原理及条件 菌种保藏的方法 菌种保藏的注意事项 菌种保藏机构
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一、菌种保藏原理
原理：
根据菌种的生理生化特性，人为创造条件使菌 体的代谢活动处于休眠的状态。
条件：
挑取优良纯种，最好是休眠体（孢子、芽孢等）
创造一个最有利于休眠的环境条件，如：降低培 养基营养成分、低温、干燥、隔氧及添加保护剂 等方法。
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二、菌种保藏的方法
斜面保藏法 穿刺保藏法 固体曲保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
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（一）斜面保藏法
原理：低温 方法： 将培养好的斜面菌种，置于4-5℃冰箱保存，定期
移植到新的斜面培养基上继续保藏。 一般保存期3-6个月。 注意事项: 冰箱的温度； 培养基水分蒸发情况（用橡皮塞代替棉塞）。 优点：简便，适合于实验室中菌种的短期保藏。 缺点：短期内多次传代，易引起菌种变异、退化，染菌
过筛、灭菌并干燥的沙土为保藏介质，
可用硅胶、磁珠或多孔玻璃珠，但适于这些载 体的微生物不多，保存期短，不及沙土实用。
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（五）真空冷冻干燥保藏法
原理：在低温下迅速地将细胞冻结以保持细胞结构完整， 然后在真空下使水分升华（最有效方法之一）。
第5章 菌种保藏的原理和方法
这种保藏方法的弊端在于短期内多次传代
–容易引起菌种发生变异，
–杂菌污染的机会也随之增多。
采用这种方法保藏菌种时， –可以在可能的范围内减少碳水化合物的 含量， –或者将试管口更好地密封， 减少培养基失水和杂菌污染，以延长保 藏期。
斜面保藏法
5.1.2 穿刺保藏法
穿刺保藏法是斜面保藏法的一种改进，常用于 各种好气性细菌的保藏。 （1）其方法是配置1%的软琼脂培养基，装入小 试管或螺口小管内，高度1～2cm。
世界上现有700多家菌种保藏机构，其中国际 知识产权组织承认的法定保藏机构仅有28家。
–如美国的标准菌种保藏所（ATCC，American Type Culture Collection，Rockvill，Maryland， USA），保藏各类菌种一万株以上。 –美国农业部农业研究服务部（ARS）菌种保藏所收 藏近两万株，主要是有关农产品加工所用的菌种， 其中酵母近一万株。 –英国国立标准菌种保藏所（NCTC，National Collection of Type Culture）。 –荷兰霉菌中心保藏所（CBS）保藏各种菌种达两万 株，其中霉菌有一万株以上。 –日本大阪发酵研究所等。
（2）121℃灭菌后不制成斜面而使其凝固，
（3）用接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处。
（4）经培养后，微生物在穿刺处和培养基表面 均可生长， 冰箱保藏，可保藏6～12个月。
• 液体石蜡能够防止培养基失水并隔绝氧气，降低 微生物的代谢作用，因此保藏效果比斜面要好。 • 如果直接将液体石蜡加入生长好菌种的斜面上， 也可以得到相似的效果。 • 在保藏期间如果发现液体石蜡减少，应及时补充。 • 这种方法的适用范围较广，也可用于放线菌和真 菌的保藏。
• 种保藏法适用于产生孢子的丝状真菌和放线菌， 或形成芽孢的细菌。 • 其原理是造成干燥和寡营养的保藏条件。 • 它的制备方法见书p48。 • 也有只用土或只用沙作载体进行保藏的。保藏期 一般为两年，有的微生物可保藏长达10年之久。
菌种的传代、保藏及菌液的制备
菌种的传代、保藏及菌液制备标准菌种的概念及其管理§§检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中菌种的名称§生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］§白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］§微生物菌种的使用、保存与管理、验证。
§一.制定菌种使用保藏管理程序§§标准菌种的保藏形式培养基的选择§菌种的传代§§§菌种的接种菌种的复苏《的传代次数不得超过从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第严格控制菌种的传代§1.复溶菌种并转种按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）2.鉴定菌种后制甘油冷冻管后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管面，工作用菌种（为第三代）§3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验§保存管（第三代）斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代）§将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。
§当工作用用菌种代数小于上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接§转接第四代，直至四代转为五代。
菌种保藏标签的规范与要求菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：称，系列号旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉处理过程应记录。
严格菌种的质量控制，确保菌种的质量菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统。
因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。
菌种保藏技术
菌种保藏技术概述菌种保藏技术是指将某种菌株保存至较长时间内保持菌株活力的技术。
这项技术在微生物学和生物工程领域中具有重要的应用价值。
通过菌种保藏技术，我们可以确保菌株的长期保存，以便进一步开展研究、生产和应用。
菌种保藏方法菌种保藏方法多种多样，根据不同的菌株特性和研究需求，可以采用不同的保存方法。
常见的菌种保藏方法包括以下几种：冷冻保藏法冷冻保藏法是最常见和简单的菌种保藏方法之一。
它是通过将菌株培养物加入到含有甘露醇、甘油等低温保护剂的液体培养基中，然后暴露在低温环境下保存。
通常采用-80℃的低温保存，也可以使用液氮等更低的温度进行保存。
冷冻保藏法适用于大部分细菌和真菌的保藏。
干燥保藏法干燥保藏法是一种将菌株保存在干燥状态下的方法。
这种方法适用于较为耐干旱的菌种，通过将菌株培养物均匀涂布在无菌耐热材料上，然后置于通风干燥室中，使其自然脱水，最后将干燥的菌株保存在密封的容器中。
干燥保藏法可以延长菌株的保存时间，并且保存过程中不需要低温设备。
明胶培养块保藏法明胶培养块保藏法是一种将菌株保存在明胶基质中的方法。
通过将菌株培养物与明胶混合，制成固态培养块，然后保藏至低温环境中。
这种方法适用于一些不适合冷冻保藏的菌株，可以有效地保护菌株的活力。
液氮冷冻保藏法液氮冷冻保藏法是一种将菌株保存在液氮中的方法。
液氮的温度非常低，可以有效地保持菌株的冷冻状态。
通过将菌株培养物与低温保护剂混合后，加入到液氮中进行冷冻保存。
液氮冷冻保藏法适用于保存较为敏感的菌株，能够保持菌株较长时间内的生存能力。
菌种保藏的重要性菌种保藏技术在微生物学和生物工程领域具有重要的应用意义。
具体有以下几个方面的重要性：科学研究菌种保藏技术使得科学家可以随时随地地保存特定的菌株，从而方便后续的研究。
科学家可以根据需要，随时提取保存的菌株，进行各种实验和研究。
菌种保藏技术的应用，促进了科学研究的发展和进步。
产业应用许多微生物有着重要的产业应用价值，如工业发酵和药物生产等。
菌种的保藏与复壮
(四)干燥保藏
微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于干燥条件下停 止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。此法 用于细菌芽孢或产分生孢子的菌种，是现在发酵工业生 产中较常用的菌种保藏方法。为了转接方便，控制接种 量以及对菌种的保护作用，通常将菌种的分生孢子、芽 孢，甚至菌丝体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进 行常压干燥或真空干燥，所用载体有沙土、滤纸、硅胶 及大(小)米等。
工业微生物菌种保藏与其他目的 的菌种保藏要求有所不同。工业 微生物菌种保藏，是要使菌种生 产能力和与生产工艺相适应的优 良性状保持稳定，当然做不到绝 对不变，只是力求把这种衰退现 象推迟减缓到最低限度。
菌种保藏
菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性 状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。保藏的一般程 序是选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽孢等休 眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。微生物生长要 求适宜的温度、水分、空气和营养物质等，如将菌种处于 低温、干燥、无氧和缺乏营养的条件下，就可以使菌种暂 时处于休眠状态。
1.沙土管法
取河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10％盐酸 浸泡24h，倒去盐酸用清水冲洗至pH呈中性，去水 烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，把烘干的 沙土按3：2或1：1混合装入指形管或高100mm，直 径 为 10mm 的 小 试 管 中 ， 高 约 1cm( 约 2g) ， 塞 棉 塞 121℃灭菌1h，也可用170℃2h干热灭菌(或蒸汽三 次间歇灭菌)，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确 实证明无菌即可使用。将要保存的斜面菌种制成浓 孢子悬液(≥106/ml)，用灭菌滴管或吸管吸取孢子 悬液滴入无菌沙土上，每管约0.3～0.5ml，用接种 环将其混合均匀。
(三)石蜡油低温保藏法
菌种生产的主要程序
菌种生产的主要程序菌种生产是指通过特定的技术和方法，将选定的微生物菌株进行培养、繁殖，使其数量增加，形成具有一定活性和功能的微生物群体的过程。
菌种生产的主要程序包括以下几个步骤：1. 菌种筛选与鉴定：根据生产需求，从自然界或菌种保藏中心筛选出具有特定功能和应用价值的菌株。
通过对菌株的形态、生理生化特性、遗传特性等方面的研究，确定其分类地位和功能特性。
2. 菌种保藏：将筛选出的优良菌株进行长期保藏，以保持其活性和稳定性。
常用的菌种保藏方法有低温保藏、冷冻干燥保藏、液氮保藏等。
3. 菌种活化：将保藏的菌种在适宜的培养基上进行活化培养，使其恢复生长活性。
活化过程中需要注意温度、湿度、氧气等环境条件的控制。
4. 菌种扩繁：将活化后的菌种接种到适当的培养基中，进行大规模的繁殖培养。
扩繁过程中需要严格控制培养条件，如温度、pH 值、营养物质浓度等，以保证菌种的生长速度和活性。
5. 菌种制备：将扩繁后的菌种进行收集、浓缩、干燥等处理，制成适合不同应用场景的菌种产品。
如液体菌种、固体菌种、冻干菌种等。
6. 菌种检测：对生产出的菌种产品进行质量检测，包括菌种纯度、活性、功能性能等方面的评价。
确保产品质量符合相关标准和要求。
7. 菌种包装与储存：将合格的菌种产品进行包装，采用适当的包装材料和方法，以保证产品在运输、储存过程中的稳定性和安全性。
同时，根据产品的特性和使用要求，选择合适的储存条件，如温度、湿度等。
8. 菌种应用：将生产出的菌种产品应用于实际生产中，如农业、食品、医药、环保等领域。
在使用过程中，需要根据具体的应用场景和目标，合理选择菌种类型、剂量、使用方法等，以达到预期的效果。
总之，菌种生产的主要程序包括菌种筛选与鉴定、保藏、活化、扩繁、制备、检测、包装与储存、应用等环节。
在整个生产过程中，需要严格控制各个环节的条件和质量，以确保菌种产品的活性、稳定性和功能性能。
菌种操作规程
菌种操作规程菌种操作是微生物实验室中非常重要的一项工作，它涉及到菌种的储存、分离、培养和传代等操作。
以下是一份常见的菌种操作规程，以确保实验室操作的安全性和结果的准确性。
一、菌种的储存1. 菌种的储存通常采用液氮冷冻或低温冰箱冷冻的方式。
2. 菌种的储存容器应该选择无菌的冻干管、冻存瓶或冷冻管，并在储存前进行无菌处理。
3. 在冷冻储存前，应制备菌种的冻存物质，如15%甘油溶液，以确保菌种冷冻过程中的生存率。
二、菌种的分离1. 菌种的分离通常采用扩散法、涂布法或稀释法等方法。
2. 在进行菌种分离前，实验室的工作台、培养皿和所需工具应进行彻底的消毒和无菌处理。
3. 分离出的纯菌落应进行单克隆处理，避免混菌的情况。
三、菌种的培养1. 发放和接收菌种时，应注意标签的准确性，并确认菌种的来源和鉴定信息。
2. 菌种的培养应选择适当的培养基和培养条件，以促进菌种的生长和代谢。
3. 在进行菌种培养时，应注意无菌操作，避免菌种的污染。
四、菌种的传代1. 菌种的传代应选择适当的传代方法，如子代分离、液体培养或固体培养等。
2. 传代菌种前，应将培养皿等实验器具进行干燥消毒，并进行无菌处理。
3. 在进行菌种传代时，应注意选择合适的传代时间和传代次数，避免菌种的突变和变异。
五、菌种的保管1. 菌种的保管应采取适当的方法，如冷冻保存、液氮冷冻保存或继代保存等。
2. 在进行菌种保管时，应注意保存容器的密封性和标识的清晰性。
3. 对于保存已久的菌种，应定期进行复苏培养，以维持菌种的活力和纯度。
六、菌种的管理1. 每次使用菌种前，应查验菌种的保藏情况和标签信息，并进行必要的鉴定。
2. 菌种管理应建立清晰的档案记录，包括菌种的来源、分离日期、储存方式和使用情况等。
3. 菌种的使用应按照实验室的安全操作规程进行，避免对环境和人员的污染。
对于菌种操作的规程，实验室应制定具体的操作细则，并根据实验室的实际情况进行调整和完善。
同时，实验室操作人员应接受相关培训，掌握正确的操作技巧和安全意识，以确保菌种操作的准确性和安全性。