13章 程序性细胞死亡和细胞衰老

2、细胞凋亡特征
（1）、形态学特征 ◆凋亡小体的形成： ◆凋亡的起始：细胞表面的特化
结构如微绒毛消失，细胞间接触的消 核染色质断裂为大小不等的片段，与某 失，但细胞膜依然完整；线粒体大体 ◆凋亡小体为邻近细胞吞噬并消化 些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的 完整，但核糖体逐渐从内质网上脱 细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多 离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜 泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡 融合；染色质固缩，形成新月形帽状 小体 结构等形态，沿着核膜分布 ◆凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG （tissue Transglutaminase）积累并达到较高水平 ◆凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化
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细胞中还具有 caspase 的抑制因子，称为 IAPs（inhibitors of apoptosis proteins），属于一个庞大的蛋白家族。它们能通过 BIR 结构域（baculovirus IAP repeats domain）与 caspase 结合，抑制其活性，如XIAP。
参与炎症反应
（2）、Caspase 活化
Caspase 自身以非活化的 Procaspase存在，其激活依赖于 其他的 Caspase 在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化。 两类caspase
启动者（initiator）在外来蛋白信号的作用下被切割激活。 执行者（executioner或effector），激活的启动caspase对执行 者caspase进行切割并使之激活，被激活执行者caspase通过对 caspase靶蛋白的水解，导致程序性细胞死亡。
程序性细胞死亡途径及相关基因
1、Caspase 家族与凋亡
（1）、Caspase家族 Caspase属于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，相 当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键 酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使 细胞不可逆的走向死亡。它们均有以下特点： ① Caspase活性位点：半胱氨酸(Cysteine) ； ②裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，所以命 名为caspase（ Cysteine aspartic acic specific protease ），方便起见称之为凋亡酶； ③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚 基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。
凋亡促进剂，亦可作抑制剂，可与 BCL-2，BCL-X 和 E1B19K 结合
凋亡抑制剂 凋亡促进剂，与 BCL-2 和 BCL-XL 结合 线虫中的凋亡抑制剂，BCL-2 同源物 腺病毒凋亡抑制剂，与 Bax 和 Bak 结合
（2）、生化学特征
3、诱导细胞凋亡的因子
◆物理性因子：
包括射线（紫外线，γ 射线等），较温和的温度 刺激（如热激，冷激）等
◆化学及生物因子： 包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的
抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子α （TNFα），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等
4、细胞凋亡的检测
调节因子（或者 抗凋亡蛋白）： 线虫：Ced-9 哺乳动物：Bcl-2 效应物为半胱氨酸蛋白酶，称为 caspases 1, 或 者 ICE (Ced-3) （线虫中） Apaf1(凋亡蛋白酶活化因子) or Ced-4, 促进 caspases 或者 Ced-3 活性
2、Bcl2 家族、线粒体与细胞凋亡
第十三章
程序性细胞死亡与细胞衰老
一、细胞凋亡(Apoptosis) （一）、细胞凋亡的概念及其生物学意义
1、细胞凋亡（apoptosis）的概念：
apoptosis=“αποπτοσισ ” “apo（离开，分离）+ptosis（下降，掉 下来）”=falling off
单个或多个细胞发生的以核皱缩、胞膜泡状 形态学概念： 突出或凹陷，DNA规律性断裂，形成单位膜 包裹的大小不一的“颗粒”，不引起炎症反应 等为特征的细胞死亡
（1）、形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察
a 正常T细胞杂交瘤细胞
b 凋亡细胞(扫描电镜)
c 凋亡细胞(透射电镜)
（2）、DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带 （3）、TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法
（4）、 Annexin V-GFP标记 凋亡早期细胞，细胞膜由于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻被 Annexin V-GFP标记在荧光显微镜下观察呈现绿色荧 光；凋亡晚期细胞呈现红色荧光，是由于细胞膜与核膜 破损，PI进入核区与DNA结合。而对照组正常细胞不显 示任何荧光。
BCL-2家族成员
基因产物 BCL-2 BCL-x BCL-w Bax Bak MCL-1 Bad Ced-9 E1B19K 功 能 凋亡抑制剂，可和 Bax 及 Bak 结合 其 L 型抑制凋亡，S 型促进凋亡，与 Bax 及 Bak 结合 凋亡抑制剂 凋亡促进剂，可与 BCL-2，BCL-XL，EIB19K 结合
使抑制凋亡因子失活， 如CAD(caspaseactivated Dnase )/ICAD 破坏细胞结构，如核纤 层蛋白 将调节区与催化区分 离，使蛋白失活，如 Gelsolin
线虫(C.elegans)凋亡研究发现ced3，ced4基因促进细胞凋亡， ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。Ced3哺乳类 同源物是ICE，即Caspase1。 ICE蛋白酶参与 Fas 诱导的细胞凋亡，与线虫细胞凋亡基因 ced-3 同源。 ced-4 在哺乳动物中的同源体为Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)，能激活Caspase3 ，这一过程需要细胞色 素c（Apaf-2）和Apaf-3的参与。
（5）、wk.baidu.com式细胞分析
（6）、彗星电泳
（三）、细胞凋亡的分子调控机理
Sydney Brenner
H. Robert Horvitz John E. Sulston
线虫体细胞凋亡研究：PCD相关基因15个
1、与PCD有关的基因，负责PCD控制：ced-3、ced-4和ced-9。 2、与PCD过程吞噬作用有关：ced-1、ced-2、ced-5-8 和 ced10。 3、核酸酶基因（nuc-1）, 控制DNA降解，但非PCD所必须。 4、影响特异细胞类型PCD的基因：ces-1、ces-2、cgl-1、和 her-1.
◆ Bcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4），并且通常羧
基末端有一穿膜的结构域 (transmembrane region，TM)。其中BH4是抗 凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与促进凋亡有关的结构域。
◆根据功能和结构可将Bcl-2基因家族分为两类：
-----抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl1； -----促进凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、 Bim，在促凋亡蛋白中还有一类仅含BH3结构，如Bid、Bad。
● 程序性细胞死亡分为两个阶段：
死亡激活期(activation phase), (接受来自内部或外部的死亡
信号(death signals)并做出反应，即接受指令并决定死亡。)
●决定死亡的两个基因，即ces-1(ces表示CE细胞存活
的调控基因)和ces-2基因 死亡执行期（execution phase）,(执行一套死亡程序，包
括发生染色质凝缩并逐步分布在核膜周围；细胞质浓缩, 膜泡形成 凋亡小体，最后被吞噬细胞吞噬和降解等)
● 执行死亡的4个基因： ced-3、ced-4、ced-9和egl-1
基因。
ced-4是细胞杀手, ced3,ced4基因促进细胞凋亡;ced-9是 存活因子,抑制细胞凋亡
程序性死亡的细胞之所以能够被吞噬细胞 识别和吞噬，是因为这些细胞的表面具有“将我 吃掉”的信号，这种信号在正常细胞的表面是不 存在的。研究得最清楚的被吞噬信号是存在于 程序化死亡细胞质膜脂双层外叶的磷脂酰丝氨 酸(phosphatidylserine)分子。
生化学概念：
是一个主动的由基因控制的、自主的、 有序的细胞死亡。所以也常常被称为细 胞编程死亡（programmed cell death, PCD）。
细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命 的过程，所以也常常被称为细胞编程死亡 （programmed cell death, PCD）。凋亡细胞将 被吞噬细胞吞噬。
The caspase cascade involved in apoptosis A. Procaspase activation by proteolytic cleavage. B. Caspase cascade
执行者caspase在程序性细胞死亡中的作用
Caspase 如何杀死细胞？
执行者
启动者
ICE家族成员 A：3类caspase：蓝色参与炎症反应，红色为执行者，绿色为启动 者；B：caspase-3的结构模型；C：caspase-3的活化过程
caspase 超家族成员及其相应底物
名称及其别名 caspase-1（ICE） caspase-2（Nedd-2/ICH1） caspase-3（apopain/CPP32/Yama） caspase-4（Tx/ICH2/ICE rel-II） caspase-5（ICE rel-III/TY） caspase-6（Mch2）
最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因是 ICE (Interleukin-1-converting enzyme) ，即：白介素-1 β转换酶基因，因该酶能将白介素前体切割为活性 分子，故名。在人类细胞中已发现11个 ICE 同源物，分为2个亚族： ---ICE 亚族：参与炎症反应，如caspase-1, and caspase-11 ---CED-3 家族，参与细胞凋亡，又分为两类： ★启动者（initiator）：如 caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪 接而激活，然后引起 caspase 级联反应，如 caspase-8 可依次激活 caspase-3、6、7。 ★执行者（executioner或effector）：如caspase-3、6、7，它们 可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催 化或自剪接的方式激活；
（2）、Caspase 活化
Caspase-8自剪切活化，激活 Caspase-3，Caspase-7成为凋亡的执行者。 Caspase-3 激活 Caspase-6。 Caspase 可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。 Caspase 还可降解CAD的调节蛋白，释放出CAD，CAD进入细胞核降 解 DNA。 –CAD 为caspase-activated Dnase（脱氧核苷酸酶），存在于胞质中。
2、细胞凋亡（apoptosis）生物学意义
（1）、维持多细胞生物个体发育的正常进行 （2）、自稳平衡的保持 （3）、抵御外界各种因素的干扰 （清除变异的 细胞和被感染的细胞）
（二）、细胞凋亡的形态学和生物化学特征
1、细胞凋亡与坏死(necrosis) 质膜完整性 炎症反应 凋亡小体
Apoptosis & Necrosis
◆Bcl-2是一种原癌基因，是 ced-9 在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋 亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2名称来源于B细胞淋巴瘤/白血 病-2(B-cell lymphoma/Leukemia-2，bcl-2)。 ◆ bcl-2 蛋白，是膜的整合蛋白，主要存在于线粒体外膜、核膜及部分内质 网中。
caspase-7（ICE-LAP3/Mch3/CMH-1）
底物 Pro-ILβ ； pro-caspase 3，7 PARP ； SREBP ； DFF ； DNA-PK
Lamin A ； keratin 18 PARP ； pro-caspase 6 ； DFF
caspase-8（FLICE/MACH/Mch5） caspase-9（ICE-LAP6/Mch6） caspase-10（Mch4/FLICE2） caspase-11（ICH3） PARP