杂交瘤细胞培养及其注意事项

杂交瘤细胞培养及其注意事项

单克隆抗体的应用是一项迅速发展的技术。本文阐述了单克隆抗体制备前杂交瘤细胞的培养条件和应用，包括细胞的培养、培养基的选择，融合时期的选择，从而指导和优化实验室中杂交瘤的培养，促进融合细胞的融合率和后继单克隆抗体筛选实验的顺利进行。

标签：杂交瘤；细胞培养；单克隆抗体

随着杂交瘤细胞株不断的建立和生产单克隆抗体的日益广泛应用，杂交瘤细胞的培养和优化不断得到改善，但是国内实验室设备和条件有限，多数的单克隆抗体的筛选还是应用基础的免疫抗原包被，结合Elisa方法联合有限稀释法来筛选单克隆抗体。为了获得特异性较强的杂交瘤细胞株，融合前后细胞的培养以及杂交瘤的培养和储存，仍是基础实验室中必须注意和重视的技术。

1杂交瘤的起源和生产

1.1杂交瘤所用的骨髓瘤细胞系1966年Petingel等在体外培养小鼠浆细胞成功。Milstein等1972年由P3中用20μg 8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）筛选出缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的新细胞系，称之为P3-X63-Ag8。由于X63本身分泌IgG1，形成的杂交瘤除分泌B细胞的特异性抗体外，同时分泌X63产生的抗体，因其抗体不纯，现多改用不分泌型骨髓瘤细胞系。国内现已引进NS-1，SP2/0，FO，X63-Ag8-653等小鼠骨髓瘤细胞系。最常使用的是SP2/0及NS-1[1]。

1.2人骨髓瘤细胞系为产生稳定的人免疫球蛋白的杂交瘤，需要人的缺某种酶的骨髓瘤细胞系。国外已筛选了一些人骨髓瘤细胞，但融合率不高，还没有推广使用。目前人一人杂交瘤技术仍存在着杂交瘤在不同培养基中的生长速度问题。细胞生长缓慢，抗体分泌力弱及效价较低，且难于克隆化等困难[2]，限制了人骨髓瘤细胞的应用。

1.3淋巴细胞和骨髓瘤细胞的关系B淋巴细胞容易与浆细胞瘤融合，而T细胞则需要同胸腺淋巴肉瘤融合（Kohler，et al. 1977；Schwaber，1977）。脾脏是大量T或B细胞的来源，与小鼠骨髓瘤细胞融合时，最常用的是小鼠的脾细胞。按照Burnet的细胞系选择学说，一个B淋巴细胞只能产生一种抗体，其”后代”也只能产生此种抗体，因为抗体是由DNA上的基因所决定，基因是可以遗传的。在正常情况下，小鼠脾中含有能产生各种不同抗体的B细胞，一只纯种小鼠体内可有（1～5）×107种不同的抗体，即有（1～5）×107种不同的B细胞。为了提高获得某种杂交瘤的机会，就需要设法增加小鼠体内分泌该种抗体的B细胞的数量。最常用的方法是用特定抗原多次免疫小鼠，使之产生特异性抗体。通过将免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合，然后经过多次筛选，从而得到特异性的杂交瘤细胞。这样所获得的特异性的杂交瘤细胞在既具有脾细胞分泌抗体的能力的同时，又具有小鼠骨髓瘤细胞永生的特性，从而可以无限制地提供

结构与性质完全相同的单克隆抗体[3]。

1.4生产人用鼠源的单抗的生产方法分为体内法和体外法2种。体内法即腹水法，腹水中抗体浓度高，可达2～10mg/ml。我国对体内法生产的人用鼠源单克隆抗体的质检项目繁多，要求严格，打腹水的BALB/c小鼠必须达到SPF （Specific Pathogen Free无特定病原体级实验动物级）的要求，其饲养，繁殖和生产腹水以及纯化抗体的厂房也必须符合GMP（Good Manufacturing Practice良好的生产质量管理规范），限制了体内法在人用鼠源单抗生产领域的应用；单抗的体外生产方法是通过杂交瘤细胞的体外培养法，它的特点是生产的产品纯度高，避免了鼠类病毒的污染，质检项目方面有很大的简化，可推广用于大规模工业生产，是人用鼠源单抗生产方式的主要发展方向[4]。

2融合细胞实验，杂交瘤细胞培养和保存注意事项

2.1单克隆抗体制备时SP2/0细胞复苏和融合时间融合前SP2/0需要提前1w 复苏，因为在融合前可以发生细胞反复传代导致细胞生长活性下降，或是因为细胞活力的问题或是污染问题而被迫推迟细胞融合时间，所以融合前小鼠的加强时间一定要是在细胞传代后，确认细胞没有问题再进行小鼠的加强免疫。通常小鼠加强免疫后第4d（包括免疫的当天），进行细胞融合，可以取得更高的融合率。不分泌抗体的特异性B淋巴母细胞是B细胞与骨髓瘤细胞进行融合的最适时期。最后一次免疫2～4d后，脾内特异性B细胞大量增殖时进行融合，可得较多的杂交瘤。

笔者进行观察后，发现骨髓瘤細胞在复苏后培养第2代的时候可以进入细胞的旺盛生长期，在这个时期进行细胞的融合可以提高杂交瘤细胞的融合率，注意进行融合前一天必须进行一次细胞的换液。

2.2关于培养液的配置杂交瘤细胞的培养液采用的是10～20%胎牛血清添加至DME或RPMI-1640中作为基础的培养液。因为血清之间质量差异甚大，影响试验结果稳定性，常需多次筛选，在筛选稳定后，应采用统一批次的血清和培养液进行细胞融合，从而避免血清和培养液的问题导致的试验结果不稳定。笔者曾碰到过因为更换培养液而导致融合细胞后杂交瘤细胞大量死亡的事故。实验过程中此类问题应该尽量避免。

2.3关于培养动物细胞在体外增殖的方式可以分为两种：一种是在培养液中自由悬浮生长的悬浮细胞；另外一种是贴附在固相基质表面生长的贴壁细胞（ADC，Anchoragedepen-dentcen）。杂交瘤细胞系是由骨髓瘤细胞与免疫动物的脾细胞融合形成的，不是一种严格的ADC细胞。不同的细胞系，细胞之间的贴壁依赖性有较大差异[5]。杂交瘤细胞是半悬浮细胞，更换培养液时只需要每次更换反应器中培养液体积的3/4即可，保持剩余培养液中的细胞作为种子，可以维持反复培养，减少杂交瘤细胞因受到培养环境变化带来的生理影响，保证细胞活性，同时扩大培养的时候也可将漂浮的部分细胞继续单独培养。

2.4关于传代扩大培养时避免用1ml的加样枪吹吸细胞，这样可以避免细胞

由于强烈的吹打导致细胞的破碎和碎裂。尽量采取无损伤1.5ml的玻璃吸管吹打和传代，可以减少细胞在传代时导致的机械性损伤。2.5关于饲养层细胞饲养层细胞（小鼠腹腔渗出细胞）的加入有助于促进杂交瘤的生长并可以增加杂交瘤的产量。饲养细胞可以是成纤维细胞，胸腺或脾脏淋巴细胞，但常用的是从同系健康小鼠腹腔中收集的腹腔渗出细胞，主要是巨噬细胞。

2.6关于冻存温度细胞冻存的过程要经历液体溶液的固化和水分子通过细胞膜的渗透过程，冻存细胞的溶液一旦形成冰晶，高渗透压的环境会导致细胞内外环境的改变，会增加防冻剂对细胞毒性造成细胞的损伤。这是由于细胞内形成冰晶促使电解质浓度升高引起细胞脱水而使细胞失活。当冻存的降温速率过快或复温速度过慢，都会使细胞内形成冰晶，导致细胞的损伤和死亡。通常温度越低，酶活力也越低，细胞新陈代谢也随着降低，保存时间相对延长。

传统的细胞冻存有程序性的降温液氮冻存法和非程序性的降温液氮冻存法。程序性降温液氮冻存法需要购置专用仪器，优点是温度控制较好，对细胞损伤小，有条件的实验室应考虑首选该法；缺点是操作步骤复杂费时，再加上成本昂贵，普及困难。

本实验室，采用的是在添加10%比例的DMSO保护剂后，将细胞悬挂于液氮罐和液氮之间，距离液氮平面大于15cm，2～3h后放入液氮冻存或隔夜放入液氮冻存，都可以保证良好的细胞冻存效果；杂交瘤细胞和sp2/0细胞冻存液里的血清浓度保持在20%的比例。冻存时选择培养处于对数生长期的细胞，在收集细胞前一天换新鲜培养液，第二天收集细胞冻存[6]。冻存液中血清含量不应低于20%，最高可用90%的血清和10%的二甲亚砜混合的冻存液。血清浓度越高，冻存效果越好[7]。

3结论

尽管杂交瘤细胞大量培养和单克隆抗体制备的研究方面已经取得很大进展，但由于设备条件和技术的限制，国内各实验室大部分仍然是以少量培养和制备为主，还存在着很多优化和改善的空间，以增加后期实验单克隆抗体制备的成功率，从而使单克隆抗体的制备得到更广泛的应用。

参考文献：

[1]方福德.现代医学实验技巧全书[M].下册.北京大学医学出版社，1999：06.

[2]James K and Bell GT[J]. J Immunol Methods，1987，100：5.

[3]董志偉，王琰.抗体工程[M].第二版.北京大学出版，2002：54.

[4]王祥斌，孔健.体外培养杂交瘤细胞生产人用鼠源单克隆抗体[J].中国生物制品学杂志，2002，15（5）：315.