RealtimePCR原理及其定量方法

定量PCR技术： 通过对PCR扩增反应中每一 个循环产物荧光信号的实 时检测从而实现对起始模 板定量及定性的分析
2、荧光定量PCR常用的三个概念
扩增曲线、阈值、CT值
plateau phase Liner phase
Exponential phase
Normalised reporter Fluorescence （Rn)
另一种思路
由于PCR反应体系中荧光物质的荧光强度与PCR产物的量成 正比，所以可以用荧光强度来代替PCR产物的量，同时考虑 荧光本底值，则：
Rn= RB+ X0(1+ Ex) Rs
总荧光信号强度=本底信号+分子数量×单位信号强度
Rn：第n个循环时的总信号 RB：本底 RS：单位信号强度 X0：起始DNA数目 Ex：PCR扩增效率
线性关系、扩增效率确认
相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率: -3 到 -3.5 PCR扩增效率（Ex）: 0.9到1.2
扩增效率
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
扩增效率理论值为1，即每增加一个循环PCR产物加倍。
实时荧光定量PCR原理和定量方法 一、荧光定量PCR的原理
在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号累积 实现了实时监测整个PCR进程， 对起始模板进行定量分析的 方法。
三个关键词： 实时，定量，荧光
1、定量与常规PCR的差别
常规PCR技术： 对 PCR 扩 增 反 应 的 终产物进行定量及 定性分析
非理想的PCR反应：
Xn＝X0 ×（1＋Ex）n
n：扩增循环数 X0：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量 Ex：PCR扩增效率
在扩增产物达到荧光阈值时所经历的循环数为Ct个循环，此 时：
XCt＝ X0×（1＋Ex）Ct＝ M
XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设 定以后，它是一个常数，设为M
那么，根据扩增效率Ex与标准曲线斜率的关系，优化的标准
曲线斜率应该为-3.32。
4、荧光定量PCR的化学原理
处于基态的分子经某种波长的入射光照射，吸收电磁辐射后被激 发至激发态，然后通过发光的形式释放出能量，重新跃迁回基态。 所发射的光即为荧光。
荧光定量PCR反应体系
非特异性荧光标记 ➢ DNA结合染料 （SYBR Green） 特异性荧光标记 ➢ 探针 （Taqman、Beacon、FRET、Amplifluor） ➢引物 （Scorption primer、LUX primer）
上式两边同取对数得：
LogM＝Log X0 ×（1＋Ex）Ct
整理得：
LogX0 ＝ －Ct Log（1＋Ex）+ Log M
模板DNA量越多，荧光达 到阈值的循环数越少，即Ct 值越小。
Log模板起始浓度与Ct值 呈线性关系。
Sample
Ck 104
Ck 102
Cycle number
Lg of DNA concentration
Baseline Ct Value
Threshold line
Cycle
（1）扩增曲线(Amplification)
反映PCR循环次数和荧光强度变化的曲线。随着PCR反应的
进行，每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强
度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。
纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
类似的，当循环数n等于Ct值时，可推出：
Ct lg (1+Ex) = -lg X0 + lg (RT-RB) – lg Rs 变形得:
此时，PCR反应处于指数期阶段，所有样品的反应效率 Ex稳定且近似相等；lg(RT -RB)、Rs也都相同，只有Ct值 和-lgX0为变量，且这两个变量之间成线性关系。也就是说， 根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中 所含的模板量。
（1）SYBR Green法
SYBR Green 染料可以与dsDNA小沟区结合并发出绿色荧光。游离 状态下SYBR Green仅发出微弱荧光，与dsDNA结合后荧光强度激增， 其荧光信号强度与dsDNA数量成正比。
热变性 引物退火 延伸反应
融解曲线（melt curve)
在PCR反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得 到温度与荧光值的关系曲线。
Cycle（循环数）
（3）Ct值(Cycle threshold)
PCR过程中，每个反应管内扩增产物的荧光信号达到 设定的阈值时，所经过的扩增循环数。相同模板进行多次 扩增，终点处产物量不恒定，但Ct值极具重现性。
3、荧光定量PCR的数学原理
理想的PCR反应:
Xn＝X0×2n
n：扩增循环数 X0：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
平台期
前15个循环信号作为荧光 本底信号（baseline）
Rn（荧Байду номын сангаас强度）
荧光阈值的缺省设置是 3～15个循环的荧光信号的标 准偏差的10倍
Lg－liner phase
Threshold
手动设置：大于荧光背 景值和阴性对照的荧光最高 值；进入指数期的最初阶段
真正的信号:荧光信号超 过阈值
Baseline
融解温度（melting temperature, Tm值）
双 链DNA解 链 50%的 温度 。 一般而言 ，退火 （ annealing
temperature）温度等于Tm值减5℃。
荧光强 度
T m
温 度
融解曲线原始图
融解曲线的设置是在PCR反应完成后进行的。一般从60℃升 到90℃，得到的融解曲线随着温度的升高，双链DNA的解链， 荧光信号不断降低，且在Tm值下降速度最快。用荧光信号强 度改变的负的一次导数与温度做图，即得到单峰的融解曲线。 峰值代表斜率改变最大值，即为Tm值。
-d-IdI ddT T
TTmm
融解曲线单峰图
线性图
对数图
荧光信号变化与PCR循环数的变化 直观！
荧光信号变化的对数与PCR循环数的变化 确定阈值线！
（2）阈值(Threshold)
在荧光扩增曲线上人为设定的一个值。它可以设定在荧
光信号指数期任意位置上，一般荧光域值设置是基线荧光信 号(一般是PCR 3～15个循环荧光信号）的标准偏差的10倍。