(色谱分析)凝胶电泳

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凝胶干燥器
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凝胶成像系统
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SDS－PAGE测定蛋白质 相对分子质量
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实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
剥胶与固定
染色与脱色
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实验过程流程图
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考马斯亮蓝染色法
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蛋白质组学和双向电泳技术
一、蛋白质组学产生背景 1. 20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。随 着人类基因组全序列测定，生命科学跨入了后基因组时代。 2. 因mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平。 3. 蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运 定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获 知。蛋白质构象更难于只靠DNA序列来解释。 4. 蛋白质才能动态反映生物系统所处的状态。 20世纪90年代中期，国际上萌发了蛋白质组学。
稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种 蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋
白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一 个很窄的蛋白区带
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+
pH 3
+
pH 3
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+
pH 3
+
pH 3
pH 7.5 pH 7.5 pH 7.5 pH 7.5
–
pH 10
–
pH 10
–
465nm
棕红色
在酸性酸条性溶件液下中，蛋白质与考 马斯亮兰R-250结合形成蓝 色复合物（595nm处最大吸 收与峰蛋）白质，疏蓝水色区结的合深浅与蛋白 质浓度成正比关系
蓝色
595nm
考马斯亮蓝G-250染料
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银染法 原理：银染时蛋白条带上的AgNO3被还原成
金属Ag，沉积在蛋白条带上而显色 显色方法分为化学显色和光显色 灵敏度达2 ng/条带
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电泳过程中分子迁移的规律，小分子在前，大分子滞 后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
混合样品
大分子
电泳方向
电泳 带孔胶
小分子
按分子
不2021/1同/13 分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图
大小分19离
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SDS-PAGE分类
SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连 续
相对迁移率
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6种蛋白质混合物的电泳结果图
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琼脂糖凝胶电泳
➢ 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依
靠无反应活性的稳定的介质—琼脂糖凝胶 和缓冲液，根据核酸分子大小不同、构型 或形状的差异，以及所带电荷的不同，可 以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此 分开。
成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个 SDS分子。
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当蛋白质的分子量在15000～200000之间时 ，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分 子量的对数呈线性关系，符合下列方程：
lgMrlgKbmK1bm
常数 斜率
迁移率
通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量。
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- - --- - -
------
-
--
---
- -- -- - - --
-
--
-
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基本原理
SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的
氢键和疏水作用，去多肽折叠。
巯基乙醇或DTT是还原剂，能打开二硫
键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。 此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合
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在电场中以一定的迁移率从负极移向正极
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天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石 花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。
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没通电时的变化
所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶 液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷 为零。
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引入电场时的变化
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电泳结束后的变化
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等点聚焦电泳的应用
1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽
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结果分析
相对迁移率的计算
相对迁移率mR =蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)
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标准蛋白在SDS-凝胶上的示意图
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标准曲线的绘制
以每条Marker带的相对迁移率为横坐标， 相应分
子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。
分 子 量
持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳
( polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
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丙烯酰胺
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N,N’-甲叉双丙烯酰胺
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凝胶的化学结构
由丙烯酰胺单体聚合成长链，长链之间用N,N-甲叉双丙 烯酰胺交联成多孔状结构。
孔的大小可以用双丙烯酰胺的浓度来调节。 浓度增大，网状结构的空隙（孔径）减小。
不同的蛋白质分子，由于其侧链可解离 基团的种类和数量、分子质量、空间三 维结构都有所不同，所以：
• 等电点（pI）不同，同一pH条件，所带 电荷种类、数量不同
• 大小、形状不同
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迁移率
蛋白质分子在电场中的泳动速度常常用迁移 率来表示
定义：蛋白质分子在单位电场强度下的泳动
速度
m=
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蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P
COOH
NH3+ P
COO-
NH2 P
COO-
pH＜pI
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pH＝pI
pH＞ pI
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等电聚焦电泳（IEF）
原理
利用不同蛋白质的等电点的不同而使其在 pH梯度中相互分离的一种电泳技术
等电聚焦过程中，蛋白质分子在一个连续而
称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-
methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，
N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetramethyl
ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵
(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核 黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用 下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支
度越快
蛋白质分子的大小和形状 分子质量越小、形状越接近球形，在电
场中迁移速度越快
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SDS-PAGE
1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶 中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质 亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子 量的大小,电荷因素可以忽视。
凝胶浓度 /T%
分子量范围 /kDa
5
30~200
10
15~100
15
10~50
20
2~15
C=5%
凝胶浓度 /T%
分子量范围 /kDa
5
60~700
10
22~280
15
10~200
20
5~150
C：Bis占两者的百分含量（交联度） T：Acr和Bis在凝胶中的总浓度
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PAGE分离蛋白质的依据
2-DE使得分离分辨率大大提高，获得的信息也明 显增多，是目前电泳技术中分辨率最高、信息获得 最多的技术，常用于分析复杂样品及绘制蛋白质组 图谱，是蛋白质组学研究的核心技术
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二维电泳基本操作流程
① 样品准备 ② 等电聚焦（IEF, 第一维） ③ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE,第二维) ④ 染色 ⑤ 图像分析 ⑥ 质谱分析 ⑦ 数据库分析，鉴定蛋白
—VE =
__Q___ 6πrη
V=迁移速度； E=电场强度； η=介质粘度
➢ 在同一介质中电泳，m只与蛋白分子自身大 小和形状（r）、所带电荷数量（Q）相关
➢ 利用蛋白质混合物中各蛋白的迁移率不同
（蛋白性质差异造成），而达到分离的效果
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6种蛋白质混合物的电泳结果图
切取蛋白条带或蛋白点 蛋白混合物
酶解
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多肽混合物 MS/MS 数据库比对
质谱鉴定
蛋白质1 蛋白质2 蛋白质3 。。。
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蛋白质分离首选技术：
双向凝胶电泳技术
目前唯一能分离上千种蛋白的技术
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人肾脏细胞
细胞系K562
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小鼠肝细胞
双向电泳（2-dimension Electrophoresis，2-DE） 是样品经第一向电泳后，再在垂直方向上进行第二 向其他类型电泳的电泳方式。目前的双向电泳一般 是 ： 第 一 向 为 等 电 聚 焦 （ IEF ） ， 第 二 向 为 SDSPAGE
带2021/清1/13 晰度及分辨率均较前者佳。
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聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的是平板电泳仪。装置见下图
连续(a)与不连续(b)平板凝胶电泳示意图
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电泳仪
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垂直板式电泳槽
转移电泳槽
平板式电泳槽
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双向电泳槽
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垂直柱式电泳槽（盘状电泳槽）
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CH=CH2
CH CH2 ( CH CH2 )n
形
C=O
C=O
C NH2
成
NH
O
NH
O
凝 胶
CH2
催化剂
+ 2nCH2=CH C NH2
CH2
的
NHNHO源自反C=OC=O
C NH2
应
CH=CH2
式
CH CH2 ( CH CH2 )n
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聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分子量的关系
C=2.6%
pH 10
–
pH 10
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pH梯度的形成
载体两性电解质是一系列不同分 子的两性电解质的混合物,在通电后， 它们各自迁移到适当位置形成一个 连续的pH梯度。
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Ampholyte化学结构式
Pharmalyte化学结构式
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常用的两种载体两性电解质
相对迁移率
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未知蛋白质样品分子量的测算
计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标 准曲线上找到对应的纵坐标，即可得该样 品的分子量。
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等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEF
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等电聚焦
等电聚焦（IEF) ：利用一种特殊的缓冲液（两性电 解质）在聚丙烯酰胺凝胶上制造一个pH梯度，电泳时， 蛋白迁移到其等电点就不带电荷而停止电泳，通过该 方法分离蛋白的方法。
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影响蛋白质电泳速度的外在因素
溶液pH 决定蛋白质所带电荷的电性和电量
溶液的离子强度
越低，迁移越快；一般应 在0.01~0.2 mol/L之间
电场强度 电渗现象 电泳支持介质 温度
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影响蛋白质电泳速度的内在因素
蛋白质分子所带电荷的电性和电量 电性决定电泳方向；电量越大，迁移速
(色谱分析)凝胶电泳
电泳
带电粒子在电场 力作用下向着所 带电荷相反的方 向泳动的现象叫 电泳。
凝胶电泳
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电泳的用途？ 2
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE）
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原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简
系统和不连续系统两大类：
连续系统：由电极缓冲液和分离胶组成。电泳体系
中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作
用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组
成。缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均
不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效
应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条
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Human Proteome Organization,HUPO
蛋白质组：阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式， 其内容包括鉴定蛋白质的存在方式（修饰形式），研究其结 构、功能、定量和相互作用等
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蛋白质组研究策略
组织、细胞等
蛋白质分离
双向凝胶电泳分离 色谱分离
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染色
•考染法 •银染法 •荧光染料法 •放射自显影
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凝胶的图像处理分析和典型流程
凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立
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相 对 分 子 量 对 数