离子交换层析
离子交换层析
样品进柱
离子交换层析的基本操作
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数
样品洗脱
恒定洗脱
离子交换层析的基本操作
分子浓度 离子强度
pH值
阶段洗脱
梯度洗脱
弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换树脂：
最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物
离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
离子交换层析
离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本操作
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为 流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混 合物中不同离子进行分离的层析技术。
离子交换介质的基本性质
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换葡聚糖：
离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G） Sephadex的优点如下：
亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核 酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小
10 20 30 40 50 60 70 80 90
生化技术第六章 离子交换层析
3.不同离子型交换剂的选择 原则：选择结合力较小的反离子，有利于提高交 换容量。 强阳性——选H型；强阴性——选OH型； 弱酸性——选Na型；弱碱性——选Cl型。 4.不同基质离子交换剂的选择 疏水性的树脂交联度大，空隙小，大分子很难进 入，且骨架的疏水性不利于蛋白质的稳定。分离 大分子物质时一般用亲水性的基质。
疏水性离子交换剂
疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合
力较小的树脂。常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的
聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合
物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不
同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：
阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱
三、分离原理 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主
要以离子交换方式进行。
假设以R-A+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+
能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式
为：R-A++B+
R-B++A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力， 这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。
+
+
+
+
+
+
+
离子交换层析讲解
三、离子交换剂的种类和性质 1.离子交换剂的基质
• 其中：聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以
苯乙烯和二乙烯苯合成的具大、流速快。但它与 水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变 性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、 核苷酸等。 以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚 糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交 换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子 物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50 为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基 质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
离子交换层析
原理及应用
一、简介
• 1、定义：
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换 剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力 大小的差别而进行分离的一种层析方法
2、发展历程
• 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交
二、基本原理 阴离子交换
• 通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子
强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加， 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上 的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置 换出来，随洗脱液流出。 与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来， 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度 才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与 离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下 来，从而达到分离目的。
X+ Y-↔ A-
二、基本原理
• 从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交 •
离子交换层析的原理和应用
离子交换层析的原理和应用1. 原理概述离子交换层析是一种常用的分离和纯化技术，基于离子交换剂与目标物质之间的相互作用。
其原理是利用交换剂固定在固定相上的活性基团与待分离物质之间的化学吸附和解析度差异来实现目标物质的纯化和富集。
2. 交换剂的选择在离子交换层析中，选择合适的交换剂对分离效果至关重要。
- 强酸型离子交换剂：适用于分离酸性物质。
- 强碱型离子交换剂：适用于分离碱性物质。
- 强酸型离子交换剂与强碱型离子交换剂的混合：适用于分离中性物质。
3. 实验步骤离子交换层析的实验步骤如下： 1. 样品预处理：将待分离物质从样品中提取出来并纯化。
2. 选择合适的离子交换剂：根据目标物质的特性选择合适的离子交换剂。
3. 准备固定相：将离子交换剂固定在合适的固定相上。
4. 填充层析柱：将固定相装填到层析柱中。
5. 样品加载：将样品溶液加载到层析柱上，目标物质与离子交换剂发生相互作用。
6. 洗脱：通过改变溶液条件，如浓度、pH值等，使目标物质与离子交换剂解离，从而洗脱出来。
4. 应用领域离子交换层析广泛应用于以下领域： - 生物制药：用于分离和纯化蛋白质、抗体、核酸等生物大分子。
- 环境监测：用于分离和富集水样中的有机和无机污染物。
- 食品工业：用于食品添加剂、色素、香料等的分离和纯化。
- 化学分析：用于分析样品中的离子和有机物质。
- 生命科学研究：用于研究生物大分子的性质和相互作用。
5. 优点和局限性离子交换层析具有以下优点： - 分离效果好：可以实现高纯度的目标物质。
-操作简单：实验步骤相对简单，易于操作。
- 高选择性：可以通过调整离子交换剂和溶液条件来实现目标物质的选择性分离。
然而，离子交换层析也存在一些局限性： - 样品负荷量有限：由于固定相的固定容量限制，样品负荷量较小。
- 洗脱效果难以调控：洗脱条件的调控比较复杂，对操作者要求较高。
- 耗时较长：由于样品加载和洗脱等步骤的需要，离子交换层析需要较长的时间。
离子交换层析
Ixv_2 JB 980910
16
Troubleshooting
Ixv_2 JB 980910
17
Screening for the optimal ion exchanger
Sample:
Columns:
Start buffer: Elution buffer: Flow rate: Running parameters:
5
Lane 1: Lane 2: LMW markers Lane 3: Starting material Lane 4: Flow through Lane 5: 1st peak
(containing α-amylase) Lane 6: 2nd peak Lane 7: LMW markers
20
Monodisperse media
MiniBeads™ 3 µm micro-purification MonoBeads™ 10 µm polishing SOURCE™ 15 15 µm polishing SOURCE™ 30 30 µm intermediate steps
Ixv_2 JB 980910
EDTA absorbs at 254 nm
RNA/DNA
%B
100
RNA
DNA
50
0
0
2
4
6
8
Time (min)
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27
Elution schemes
• Isocratic • Step gradient • Linear gradient • Adapted
– Not usual（浓缩） – Excellent for capture steps – Standard method – Saves time and improves results
生物分离工程-离子交换层析
可利用普通的凝胶过滤介质偶联特殊的离子交换基制 备．如Pharmacia公司生产的PBEll8和94即为以Sepharose 6B 为载体的阴离子交换剂，前者与Pharmalyte 匹配使用，后 者与Polybuffer96和Polybuffer 74匹配使用。
Pharmacia生产的另一种多缓冲离子交换剂为Mono P，其离于交换基为具有不同pKa值的弱碱性胺基．Mono P可与上述三种多缓冲剂匹配使用，粒径仅10m，用作 高效层析聚焦柱的固定相。
应用：
由于HAP晶体表面结构特别，吸附机理特殊，因此 可用于识别DNA及RNA的单链和双链，分离IEC和HIC难 于分离的蛋白质物系。例如，人肿瘤坏死因子(human tumour necrosis factor,hTNF)中构成蛋白质分子的差异很 小, 利用IEC法、高效RPC法和电泳法只能得到一个洗脱 峰或电泳带，而利用HAP层析可分离得到4个洗脱峰。
再见
层析聚焦的应用
层析聚焦需使用特殊的固定相和流动相，难于应用 在大规模分离纯化过程，主要用于生化实验规模的样品 制备或成分分析．但作为一种蛋白质分离纯化手段，层 析聚焦的纯化效率极高，峰宽可小到0.02 – 0.05pH单位， 可分离等电点差仅0. 02的蛋白质。
平衡液：25mmol／ml乙醇胺—10％甘油(pH9.4) 洗脱液：用10% Polybuffer96(pH6.O)
(2)破坏水化作用的物质
SCN, ClO4 ,和 I 等离子半径较大、电荷密度低的阴
离子可减弱水分子之间相互作用。这类阴离子与上述盐 析作用强的高价阴离子(如 SO42 ，HPO42 等)的作用正好 相(antichaotropic ion)。在离液离子存在下 疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。
离子交换层析法
五、缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定 性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选 用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的 pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物 等电点的pH值。 缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解 度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么 pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。
三、树脂的选择
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）， 它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯 （divinylbenzene）聚合产生的三维网状结 构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂 Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。 具体的，根据交换树脂的性能，树脂可分 为阳离子与阴离子交换树脂：
1. 阳离子交换树脂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－ SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2， 弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 阳离子交换树脂进行的反应 如下：
2. 阴离子交换树脂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ － N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ － NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基 团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如下：
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可 逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适 宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目 的物的位置，并回收目的物。
离子交换层析法
离子交换层析法一、原理离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。
由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。
结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
二、方法与步骤：1.实验试剂与仪器：可溶性蛋白质溶液、TB缓冲液、NaCl溶液、乙醇、去离子水，层析柱、移液器、尼龙纱布、离子交换剂......2.实验步骤（1）装柱：取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子;用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水;取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，用去离子水冲洗填料5个柱体积;（2）柱的平衡与上样：用0.02M TB bufferA缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6;对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合;（3）洗杂蛋白：用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;分别用含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL 的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（4）解离目的蛋白（洗脱）：分别用含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;（5）柱的清洗与保存：用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱，共冲洗30ml;用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml;用过滤去离子水冲洗50ml;用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。
离子交换层析法
离
子
+ OH-
交 换 R-N+（CH3）2 OH- + H2O == R-N+（CH3）2
剂
H·OH-
2．亲水性离子交换剂
磷酸纤维素 CM-纤维素 DEAE-纤维素 CM-交联葡聚糖 DEAE-交联葡聚糖 CM-Sepharose CL-6B
二、离子交换剂性质
颜色与形状 交联度 吸水量或膨胀度 交换容量 稳定性 比重
CA 、CB ＝梯度混合器A瓶、 B瓶的浓度； A1 、B1 ＝A瓶、B瓶的横切面积； V2＝流经层析柱的体积，V1＝梯度洗脱液的总体积。
线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清 白蛋白的图谱
第五节 离子交换拄层析应用
一、去离子水的制备 二、制备、纯化生命物质 二、测定蛋白质的等电点
一价离子：Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+ 二价离子：Mg2+＜Ca2+＜Sr2+＜Ba2+ 一价阴离子：F-＜Cl-＜Br-＜I不同价阳离子：Na+＜Ca2+＜Al3+＜Ti4+
磺酸基树脂和季胺基树脂 对各种离子的相对选择系数
阳离子树脂
反离子 相对选择系数
H+
1.0
Na+
1.5
NH4+
1.95
2、缓冲液离子组成的选择
①缓冲液离子的pK值要接近所用的pH， ②采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，
如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐 ③采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，
如：Tris ④缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、
溶解度。
3、缓冲液离子强度的选择
①起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换 剂结合，一般小于0.1mol/L。
离子交换层析
液。平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分 离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子 交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交 换剂的结合有较大的差别。
一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。尽量使
杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下可以 使杂质与离子交换剂牢固地结合，而样品与离子交换剂结合 不稳定，也可以达到分离的目的。
离子交换层析的基本操作
（1） 层析柱
离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，
离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和 柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。装 柱时要均匀平整，不能有气泡。
装柱用于平衡离子交换柱的缓冲
■ 胶体的组成与外型：
Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.24
Cellulose Sephcel Monobead
Pharmacia (1980) Separation News: 5
离子交换剂的选择、处理和保存
Buffer: 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0
mg / mL gel
Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.64
影响交换容量的因素很多，主要可分为两个方面。
换剂上的样品组份洗脱下来。
柱效
通过柱子分离得到窄而对称的洗脱峰的能力（分辨率）
装柱的质量
树脂颗粒的大小
正确的洗脱条件
离子交换层析
离子交换层析离子交换层析，是一种常用的分离纯化技术，通过固定相上的离子交换剂与溶液中的离子发生置换反应，实现对目标离子的选择性分离。
它广泛应用于水处理、制药、生物技术、食品工业等领域，发挥着重要的作用。
在离子交换层析中，离子交换剂是关键的分离介质。
一般来说，离子交换剂是具有离子可交换功能的均质材料。
根据介质的性质，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，用于分离以阳离子或阴离子形式存在的目标物质。
离子交换剂的选择应考虑到分离的目标离子的性质和阳离子或阴离子交换剂的特性。
离子交换层析的工作原理是离子在固定相和液相之间的交换作用。
通过溶液中的离子与固定相上的离子交换剂发生反应，固定相上的离子交换剂也可释放出根离子或酸离子以与液相中的离子发生反应。
在离子交换的过程中，目标离子与固定相上的离子交换剂发生选择性的吸附与解吸，实现了目标离子的分离纯化。
离子交换层析的工艺流程通常包括前处理、进料、洗脱和再生等步骤。
前处理是为了使进料溶液与离子交换剂更好地接触，可以采用调整pH值、滤除杂质等方法。
进料环节是将目标离子溶液与离子交换剂接触，使离子发生交换反应。
洗脱是将目标离子被吸附在固定相上的离子交换剂从固定相上解吸出来，采用调整pH值、改变浓度等方法。
再生是将已经吸附的离子交换剂通过一定的操作条件重新得到可再使用的形式。
离子交换层析具有许多优点。
首先，层析介质的选择性强，可以实现高效的纯化分离。
其次，离子交换层析可以在常温下进行，避免了高温条件下目标物质的失活。
再次，操作简单，易于控制，适合大规模工业生产。
此外，离子交换层析还可以实现连续操作，提高生产效率。
总结起来，离子交换层析是一种重要的分离纯化技术，广泛应用于水处理、制药、生物技术、食品工业等领域。
通过选择合适的离子交换剂和优化工艺条件，可以实现对目标离子的高效分离纯化，为各个领域的生产提供了有力的支持。
离子交换层析ionexchangechromatography
强碱 含季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2 阴离子互换树脂对化学试剂及热都不如阳离 子互换树脂稳定。
2.离子互换纤维素
▪ 阴离子互换纤维素 —如:DEAE-纤维素 pH8.6下列分离中性或酸性物质,具二乙 胺乙基
▪ 阳离子互换纤维素—如:CM-纤维素 一 般pH>4条件下使用,具有羧甲基
2、检测：从第2管起每搜集管中加入2ml茚三 酮显色液，充分混合，沸水浴15分钟，自 来水冷却，观察氨基酸与茚三酮旳显色反 应，若生成紫色化合物，则阐明搜集到氨 基酸。
Separation of amino acids on a cation exchange column
Different types of ion exchange resins (a) Cation exchanger (b) Anion exchanger.
O OH
O
－CO2
R CH COOH +
NH2
O R
N CH2
－2H2O
O R
N CHCOOH
O O
H
R H2O
N CH
RCHO +
O O
H NH2
O OO
H N
O
O
OH OH
O
O O
H N
O O
O
O
紫色物质，用于α－氨基酸旳比色测定和纸层析显色
▪
Asp
His
▪ pH4.2
▪ pH >10
[器材]
原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样 品一致。防止使样品变性
(三)洗脱剂 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活 泼旳离子或基团
离子交换层析
离子交换层析在各方面的应用离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。
在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。
【2】2009年方希修，王冬梅等人应用平板式膜超滤技术与DEAE高子交换层析法对卵黄免疫球蛋白(IgY)进行分高纯化，经DEAE离子交换层析得到高纯度的IgY。
【4】2010年马江涛、陈昕等人使用Bio—Rad的DiaSTAT糖化血红蛋白检测系统(LPLC)和Biosystem.S.A的微柱离子交换层析法分别测定糖化血红蛋白，并进行精密度、网收率、干扰闪素及相关性的比较分析,证明了离子交换层析法测定糖化血红蛋白的方法适合临床常规应用。
【5】2010年蒋超，张或等人用超滤、阳离子交换层析方法从热钙法处理过的干酪乳清中分离纯化乳铁蛋白，其纯度达93.6%。
近年来，随着合成技术的发展和生产的需要，人工合成的刚性材料被陆续开发出来，这也是未来离子交换介质发展的一个趋势。
1.层析分离纯化家兔血清PONl条件的优化代恒、赵敏等人报道，Paraoxonase(PONl)是--个钙离子依赖的酯酶，它可以水解包括有机磷类，芳香酯类在内的多种化合物。
作为一种生物酶，PONl 可以在普通的生物环境下将有机磷类毒剂迅速水解，使之分解为无毒或低毒的化合物。
存在于血清中的PONl，可达到在有机磷毒物到达它的生物受体之前将其清除的目的。
在本研究中，使用Cibacron Blue F3GA琼脂糖的假亲和层析得到初步分离富含PONl的Cibacron流分，选定DEAE Sepharose Fast Flow为离子交换层析介质，通过AKTA purifier全自动层析仪，在PH值分别为7．0，7．5，8．0，8．5，9．0，9．5条件下对Cibacron流分进行离子交换层析。
05第五章__离子交换层析
5．稳定性
• 离子交换剂都具有理化稳定性。 • 特别是树脂类离子交换剂，在浓度较高的酸或碱溶液 中进行短期处理后，其性质仍无改变。 • 而亲水性离子交换剂的理化稳定性，一般与其基质的 稳定性相近，即在水、盐、碱、弱酸和有机溶剂等溶 液中是稳定的。 • 而且经交联引进离子基团之后，稳定性还会有所提高。
(2)阴离子交换剂
• 阴离子交换剂是在树脂中分别引入 季胺[-N(CH3) 3]、叔胺[-N(CH3) 2]、 仲胺[-NHCH3]、伯胺[-NH2]基团后构成的。 • 当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性 离子交换剂， • 当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。
• 它们与溶液中的离子进行交换时，反应式为：
根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为三种： • 强酸型 带磺酸基团的树脂，可简写为 R-SO3H，R代表树脂 • 中强酸型 带磷酸基团和亚磷酸基团的树脂，前者可简写为RPO3H2，后者可简写为 R-POH2 • 弱酸型 带羧基的和酚基的树脂，前者可简写为R-COOH，后 者可简写为R-苯环-OH
• 离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水 化作用形成的)的结合力是： • 与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成 反比。 • 所以，离子价数越高，结合力越大。 • 在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合
离子半径越小，结合力亦越大。
• 因此在稀溶液中离子发生水化时，各种阴离子和阳离 子结合力大小的排列次序如下： • 一价离子：Li+<Na+<K+<Rb+<Cs+ (对阳离子交换剂)
离子交换层析操作方法
离子交换层析操作方法离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，例如蛋白质、核酸等。
其原理是利用固定在固相上的离子交换剂与样品中的离子之间发生物理吸附和解离平衡，通过调节其溶剂系统、pH值、盐浓度等条件，使样品中的不同离子以不同的速率从固相上解离下来，从而实现分离目标分子的目的。
离子交换层析操作可以分为以下几个步骤：1. 样品处理：样品的处理对于离子交换层析的成功与否至关重要。
通常情况下，样品需要经过蛋白质提取等步骤，获得纯净的样品溶液。
如果样品中含有较高浓度的盐类等杂质，可以通过浓缩、洗涤等方法去除。
2. 选择合适的离子交换剂：离子交换剂的选择是根据样品中所含离子的性质来决定的。
对于阴离子，通常选择带有正电荷的阳离子交换剂（如硫酸树脂、乙二胺树脂等）；对于阳离子，通常选择带有负电荷的阴离子交换剂（如盐酸树脂、硝酸树脂等）。
3. 准备离子交换柱：选择合适的柱子尺寸和填充物，通常为高分子量亲水性凝胶。
将填充物装入离子交换柱中，并保持均匀填充。
4. 培养条件：根据样品特性和目的，设置适当的培养条件。
其中包括pH值、溶剂系统和盐浓度。
这些条件的选择需要根据样品的性质（酸碱性，亲水性等）和需要分离的目标纯化物的性质来确定。
5. 样品加载：将经过处理的样品加入离子交换柱，采用适当的流速保持平衡。
溶剂的选择和流速的控制主要是为了交换离子的速率与静电吸附的速率之间达到适当的平衡。
6. 洗脱：通过改变培养条件或溶剂梯度洗脱目标分离物和杂质。
通常使用梯度洗脱的方式，即梯度调整溶剂中的离子浓度，以促进目标物质逐步从离子交换剂上脱附。
7. 浓缩和储存：将洗脱得到的目标分离物浓缩并储存。
离子交换层析操作常见的问题及解决方案：1. 样品中存在杂质：可以通过前处理步骤（如超滤、浓缩等）进行预处理，去除杂质，以保证在交换剂上发生特异性吸附。
2. 分离效果不佳：可以通过改变溶剂系统、pH值或盐浓度等因素来优化分离条件，选取合适的条件以提高分离效果。
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• 3.离子交换剂的性质. 3.离子交换剂的性质. 离子交换剂的性质 • 避免缓冲离子与交换剂上的离子发生交换, 避免缓冲离子与交换剂上的离子发生交换, • 引起pH变化,降低交换容量. 引起pH变化,降低交换容量. pH变化 • 4.缓冲液必须不影响被分离物质的测定. 4.缓冲液必须不影响被分离物质的测定. 缓冲液必须不影响被分离物质的测定
• 2.按其载体分类 按其载体分类 • (1)离子交换树脂 离子交换树脂: 离子交换树脂 • 主要有聚苯乙烯型树脂和聚酚型树脂. 主要有聚苯乙烯型树脂和聚酚型树脂 • 聚苯乙烯树脂由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成一网状 结构. 结构
• 交联剂 二乙烯苯 交联剂:二乙烯苯 • 二乙烯苯 • 交联度 交联度= ———————— ×100% • 苯乙烯+二乙烯苯 苯乙烯 二乙烯苯 • 苯乙烯和二乙烯苯混合成不同的比例就可获得不同交 联度的树脂. 联度的树脂 • 二乙烯苯相对于苯乙烯的量越大 获得的树脂交联度就 二乙烯苯相对于苯乙烯的量越大,获得的树脂交联度就 越大. 越大 • 交联度大的树脂结构紧密、孔隙小 大分子量的离子就 交联度大的树脂结构紧密、孔隙小,大分子量的离子就 不能进入树脂颗粒内发生离子交换. 不能进入树脂颗粒内发生离子交换 • 交联度的范围从 ～16% 交联度的范围从1%～
• 即溶液中的离子与离子交换剂上的功能基团交换反应 即溶液中的离子与离子交换剂上的功能基团交换反应 离子与离子交换剂上的功能基团 的过程. 的过程
离子交换过程示意： 离子交换过程示意： 起始 吸附 解吸 x+ : 起始缓冲离子 y+ ：待分离离子 z+ ：待分离离子
完成
•
带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来 带电荷量多 带电荷量少 亲和力小的先被洗脱下来;带电荷量多 亲和力小的先被洗脱下来 带电荷量多, 亲和力大的后被洗脱下来. 亲和力大的后被洗脱下来
• b.交换容量 交换容量: 交换容量 • 指树脂能进行交换的能力,主要决定于树 脂网状 指树脂能进行交换的能力 主要决定于树 含的碱性或酸性基团的数目. 结构内所 含的碱性或酸性基团的数目 以mmol/ml 表之. 或 mmol/g 表之 •
• (2)纤维素离子交换剂 纤维素离子交换剂: 纤维素离子交换剂 • 在纤维素分子结构上连接一定的离子交换基团 就成为离子交换纤维素. 就成为离子交换纤维素 • (3)离子交换凝胶 — 分离大分子物质 离子交换凝胶 • 如: 葡聚糖离子交换剂、琼脂糖离子交换剂、聚丙烯 葡聚糖离子交换剂、琼脂糖离子交换剂、 酰胺离子交换剂. 酰胺离子交换剂 •
• 一.离子交换剂 离子交换剂: 离子交换剂
• 在惰性载体上引入(以共价结合的方式 带有电荷的 在惰性载体上引入 以共价结合的方式)带有电荷的 以共价结合的方式 活性基团. 活性基团
• 1.按其带电荷的功能基团分类 按其带电荷的功能基团分类 • (1)阳离子交换剂 阳离子交换剂: 阳离子交换剂 • 载体上带有负电荷的功能基团,能结合溶液中的正电 载体上带有负电荷的功能基团 能结合溶液中的正电 负电荷的功能基团 荷. • (2)阴离子交换剂 阴离子交换剂: 阴离子交换剂 • 载体上带有正电荷的功能基团,能结合溶液中的负电 正电荷的功能基团 载体上带有正电荷的功能基团 能结合溶液中的负电 荷.
• 二.原理 原理
•
离子交换层析是以离子交换剂 离子交换剂(具有离子交换性能 离子交换层析是以离子交换剂 具有离子交换性能 的物质)作为固定相,利用它与流动相(洗脱剂 中的离子 的物质 作为固定相 利用它与流动相 洗脱剂)中的离子 作为固定相 利用它与流动相 洗脱剂 中的 能进行可逆交换的性质,来分离离子型化合物的一种方 可逆交换的性质 能进行可逆交换的性质 来分离离子型化合物的一种方 法.
• 阳离子交换树脂 Dowex 50为固定相，由于天冬氨酸 阳离子 为固定相， 为固定相 柠檬酸钠缓冲液中带负电荷不与树脂结合 带负电荷不与树脂结合， 在 pH 4.2 柠檬酸钠缓冲液中带负电荷不与树脂结合， 首先被洗脱出来。赖氨酸带正电荷， 首先被洗脱出来。赖氨酸带正电荷，与树脂紧密降低 赖氨酸与树脂的亲和力而将赖氨酸从树脂中洗脱出来。 赖氨酸与树脂的亲和力而将赖氨酸从树脂中洗脱出来。 • 氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物。 氨基酸可与茚三酮反应生成有色化合物。因此可将 收集到的水溶液与茚三酮试剂反应， 收集到的水溶液与茚三酮试剂反应，观察其是否生成 蓝紫色化合物而判断洗脱情况，并可通过比色定量. 蓝紫色化合物而判断洗脱情况，并可通过比色定量.
• (二)试剂 • 1.离子交换树脂 Dowex 50 型 1.离子交换树脂 • Dowex 50 为强酸型阳离子交换树脂. 颗粒直径 为强酸型阳离子交换树脂 297µm，以带负电荷的磺酸基团（— SO3H）为功能基 磺酸基团 ，以带负电荷的磺酸基 的影响。 团，它的解离不受外界溶液 pH 的影响。磺酸基团能 够与带正电荷的阳离子发生可逆的离子交换反应。 够与带正电荷的阳离子发生可逆的离子交换反应。
• 离子交换树脂指标 交联度、交换容量 离子交换树脂指标: 交联度、 • a.交联度 交联度: 交联度 • 交联剂所占的百分比称为交联度.范围从 交联剂所占的百分比称为交联度 范围从 1%～ 16%. 交联度小 分子结 构较疏松 孔径大 交联度小,分子结 构较疏松,孔径大 ～ 量较大的离子性物质.交联度 适用于 分离分子 量较大的离子性物质 交联度 大,孔径 小适用分离分子量小的物质 孔径 小适用分离分子量小的物质. • 目数：离子交换树脂的颗粒直径大小 目数： Dowex 50 为20-50目 目 20 840µm µ 50 297µm µ 100 149µm µ 代表二乙烯苯的百分含量） （代表二乙烯苯的百分含量）
• (二)缓冲液的选择 二 缓冲液的选择 缓冲液的选择:
• • 原则: 原则 不能发生化学反应,避免使样品发生 变性. 不能发生化学反应 避免使样品发生 变性
• 考虑因素: 考虑因素: • 1.被分离物质的稳定性. 1.被分离物质的稳定性 被分离物质的稳定性. • 蛋白质的大分子物质在层析时不发生变性. 蛋白质的大分子物质在层析时不发生变性. • 2.在此缓冲溶液的pH条件下,被分离物质所带的 2.在此缓冲溶液的pH条件下 在此缓冲溶液的pH条件下, • 电荷性质与交换剂上的平衡离子相等. 电荷性质与交换剂上的平衡离子相等.
• 树脂所含的交换基团性质分为两类 树脂所含的交换基团性质分为两类: • a.阳离子交换树脂 阳离子交换树脂: 阳离子交换树脂 • 能与溶液中阳离子交换,树脂带负电荷. 树脂带负电荷 能与溶液中阳离子交换 树脂带负电荷 • b.阴离子交换树脂 阴离子交换树脂: 阴离子交换树脂 • 能与溶液中阴离子交换,树脂带正电荷. 能与溶液中阴离子交换 树脂带正电荷 树脂带正电荷 • 根据阳离子和阴离子交换树脂中功能基团的酸碱解离 程度分为强、弱两种: 程度分为强、弱两种 • (a)强酸型阳离子交换树脂 强酸型阳离子交换树脂: 强酸型阳离子交换树脂 • 主要以磺酸基( 为功能基团,它的解离不受外 主要以磺酸基 R-SO3) 为功能基团 它的解离不受外 界溶液的影响. 界溶液的影响
• 2.洗脱液 2.洗脱液 • （1） pH 4.2 柠檬酸钠缓冲液 • 天冬氨酸 pI 2.97 ＜ pH 4.2 柠檬酸钠缓冲 液带负电荷。 液带负电荷。 • 赖氨酸 pI 9.74 ＞ pH 4.2 柠檬酸钠缓冲液 带正电荷。
• (2)0.1 mol/L NaOH
离子交换层析分离氨基酸及其测定
• (一)原理
• 氨基酸是两性电解质，各有一定的等电点（pI）。 氨基酸是两性电解质，各有一定的等电点（pI）。 在溶液 pH 小于其 pI 值时均带正电荷，反之则带负 值时均带正电荷， 电荷。本实验所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液， 电荷。本实验所用样品为天冬氨酸和赖氨酸的混合液， 分别属于酸性氨基酸（ 2.97）和碱性氨基酸（ 分别属于酸性氨基酸（ pI 2.97）和碱性氨基酸（ pI 9.74）。 ）。在 4.2柠檬酸钠缓冲液中 天冬氨酸、 柠檬酸钠缓冲液中， 9.74）。在pH 4.2柠檬酸钠缓冲液中，天冬氨酸、赖 氨酸各带有负电荷和正电荷。 氨酸各带有负电荷和正电荷。以强酸型
• 三.操作注意点 操作注意点: 操作注意点
• 1.离子交换剂的选择 离子交换剂的选择: 离子交换剂的选择 • 选择原则:根据被分离物质的性质选择 — 同一性质离 选择原则 根据被分离物质的性质选择 子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力差异 子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力差异 的型号的交换剂. 大的型号的交换剂
离子交换层析
• 概述： 概述： • 用于生物大分子物质如酶、蛋白质、多肽、核酸、 用于生物大分子物质如酶、蛋白质、多肽、核酸、 寡核苷酸、病毒、噬菌体、多糖的分离和纯化。 寡核苷酸、病毒、噬菌体、多糖的分离和纯化。 • • • 特点：⑴具有开放性支持骨架 特点： ⑵具亲水性 ⑶多孔性
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离子交换层析是以离子交换剂为固定相， 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定 的含离子的溶液为流动相， 的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分 差异， 离的各种离子结合力的差异 离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子 进行分离的层析技术。 进行分离的层析技术。
• ( c )强碱型阴离子交换树脂 强碱型阴离子交换树脂: 强碱型阴离子交换树脂 • 功能基团含三甲胺的称为强碱 I 型,含二甲基乙醇胺 含二甲基乙醇胺 称为强碱 II 型. • pH条件都不受限制 条件都不受限制. 条件都不受限制 • 典型交换方程式 典型交换方程式: • RN(CH3)3 + NaOH →RN(CH3)3OH +NaCl • (d)弱碱型阴离子交换树脂 弱碱型阴离子交换树脂 • 以伯胺基( -NH )、仲胺基(＝NH )、叔胺基 、仲胺基 ＝ 以伯胺基 、叔胺基(≡N )或吡 或吡 啶基为功能基团,交换能力随溶液的 条件而变化, 交换能力随溶液的pH条件而变化 啶基为功能基团 交换能力随溶液的 条件而变化 pH 越低交换能力越强. 越低交换能力越强 • 典型交换方程式 典型交换方程式: • RNH3OH + HCl →RNH3Cl + H2O