细胞培养工作流程样本

细胞培养工作流程

一、Vero细胞复苏流程

1、准备

1.1工作地点检查:

检查台面、地面是否洁净, 确认无不相关物品。

1.2设施检查:

确认空调、传递窗工作状态完好。

1.3层流罩准备:

开启层流罩, 观察其运行是否正常, 用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。

1.4操作工具和试剂检查:

检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密, 是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物, 瓶表面是否有裂纹, 瓶塞是否松动, 溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。复苏、换液用液体: MEM液、新生牛血清、 3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、 7.5%NaHCO3溶液。

1.5复苏用水准备:

( 1) 融化种子用溶液: 按1L/1支种子准备39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。

( 2) 百级内消毒种子用水: 1L/1支种子准备36.5±1℃含

0.1%新洁尔灭溶液。

1.6操作人员进入层流罩:

穿一层无菌连体服并戴无菌手套, 静止5分钟后方可操作。

1.7溶液使用前处理:

辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面, 旋转1周, 操作人员将翻塞翻开, 再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。

2、配液

配方

辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上, 操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中, 每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧, 在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧, 充分混匀待用。

辅助人员打开混匀后的复苏液, 放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶( T175) 盖打开, 倾斜或直立放置酒精灯附近, 将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中( 加量: 0.3～0.4 ml/cm2) , 拧紧瓶盖并放在恒温室待用。

3、种子支领

依据种子库管理规定进行支领, 依据生产指令按数量支领。本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整, 后续操作各项用量按比例调整。

4、种子速溶

种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时, 在液氮罐颈部停留几秒, 核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。核对无误后, 迅速全部浸入39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液( 1000ml /支种子) , 顺时针不停摇动直至融化, 将每次的速融

时间控制在1分钟内。然后用75%的酒精消毒容器外表面, 放置在传递窗内风淋2分钟。同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。迅速传递并浸入百级内36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液中, 百级内操作人员取出擦干。

5、移种

操作人员左手拿冻存管, 右手打开, 用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出, 缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中, 拧紧瓶盖。6、培养

辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。24小时内( 细胞贴壁80%) 进行换液。

7、清场

将废液倒入下水道, 废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间, 层流罩内用75%酒精消毒, 再用纯水清洁整个房间。

8、复苏后观察

第二天观察培养液颜色( PH) 是否正常, 在显微镜下观察细胞形态数量。

9、换液

换液前准备与复苏前相同。观察培养液颜色是否正常, 有无漏

液, 看细胞是否生长良好。用消毒剂擦拭表面后放入层流罩, 操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。

辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面, 操作人员将翻塞翻开, 再用火焰消毒瓶口及瓶塞。操作人员右手拿住培养瓶底部, 左手拧开瓶盖, 轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。辅助人员打开装生长液的瓶口, 并将其在火焰外焰旋转1圈后, 放置盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近, 将生长液用吸管吸取或直接倒入其中( 加量: 0.3～0.4 ml/cm2) 。拧紧瓶口, 平放到恒温室培养。最后按规定清场

二、细胞传代流程

1、准备

1.1工作地点检查:

检查台面、地面是否洁净, 确认无不相关物品。

1.2设施检查:

确认空调、蠕动泵工作状态完好。

1.3层流罩准备:

开启层流罩, 观察其运行是否正常, 用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。

1.4操作工具和试剂检查:

检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密, 是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物, 瓶表面是否有裂纹, 瓶塞是否松动, 溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。

细胞传代用液体: MEM液, 新生牛血清、 3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、 7.5%NaHCO3溶液、 0.01MPBS溶液、细胞消化液( 含0.25%的胰蛋白酶溶液) 。

2、传代1操作

2.1配液

配方