反义寡核苷酸介导的miRNA沉默研究
RNA介导的基因沉默技术研究
RNA介导的基因沉默技术研究基因沉默是基因表达调控的一种机制，它通过阻断基因转录或抑制已经转录的mRNA的翻译来抑制基因表达。
RNA介导的基因沉默技术采用了RNA作为调控基因表达的工具。
这种技术广泛应用于基因功能研究、疾病治疗和农作物改良等领域。
RNA介导基因沉默技术主要分为siRNA、miRNA和shRNA三类。
1. siRNAsiRNA是20-25个核苷酸的双链RNA，它通过与靶基因mRNA特异性杂交，介导RNA诱导靶基因沉默。
这个过程通过小核RNA和RISC( RNA-Induced Silencing Complex)协同完成。
当siRNA与mRNA杂交后，RISC会切断mRNA形成不完整的片段，导致mRNA降解或翻译抑制。
siRNA技术可以实现精准靶向，对于多种疾病治疗具有潜在的应用价值。
但是，siRNA技术的缺点是需要选择合适的RNA靶点，并且siRNA的短寿命和难以穿透细胞膜限制了其广泛应用。
2. miRNAmiRNA是20-24个核苷酸的单链RNA，它通过特异性结合目标mRNA，同时与RISC结合，引导RISC切割目标mRNA分子。
同时，miRNA还可以通过直接结合靶标的5’端和3’端调控mRNA 的效率和速度。
miRNA广泛参与基因表达调控，可以调控20000多种基因的表达。
miRNA的缺点是具有很高的复杂性和不确定性。
miRNA靶基因的预测算法准确性存在差异，miRNA同靶基因的作用机制还需要进一步研究。
3. shRNAshRNA是基于RNA干扰技术的新型分子，可以在基因水平靶向RNA，抑制基因表达。
shRNA是单链RNA，具有RNAi引发靶基因沉默的功能。
其优点是技术简单，稳定性较好，可以长期干扰一个基因，生成稳定的RNAi信号。
但是，shRNA技术的缺点是仍然存在一些安全性问题和非特异性靶向的可能性。
实现精准稳定靶向仍然是一个需要解决的问题。
RNA介导的基因沉默技术具有广泛的研究和应用前景。
miRNA的具体研究方法及研究思路
miRNA的具体研究方法及研究思路lin-4，第一个已知的miRNA，在1993年被发现。
自此，miRNA 的研究就一发不可收拾。
线虫、果蝇等模式生物的研究鉴定出miRNA的许多重要功能，包括发育期间细胞增殖和死亡的协调，抗逆性，脂肪代谢等等。
相对于这些低等的模式生物，哺乳动物的miRNA功能研究可就复杂得多。
在开始的几年，科学家们的首要目标是利用克隆、生物信息学和基因表达等方法编纂出完整的miRNA目录和它的表达方式。
随着这个目标日益接近，研究重心又转移至miRNA功能的阐释。
针对这一目标，涌现出多种技术，有报告基因分析、原位杂交、过表达和沉默、生物信息学预测算法等，它们都有助于miRNA功能的推断。
分析miRNA的表达在鉴定新的miRNA时，通常采用三种方法：正向遗传学、定向克隆和生物信息学分析。
正向遗传学主要运用于果蝇和线虫中，它通过一个突变表型来了解miRNA的功能。
第一个miRNA基因lin-4就是这么鉴定出的。
然而，正向遗传学这么多年来也就鉴定出寥寥几个miRNA。
这是因为miRNA很小，只要突变不影响种子序列，它们就有潜力耐受，因此很难击中。
另外，由于冗余，表型筛选不能识别很多miRNA突变体。
因此正向遗传学不可能成为鉴定miRNA的主力军。
之后，定向克隆技术的出现，让多种细胞系和组织中的miRNA 大规模鉴定得以实现，包括人、小鼠和斑马鱼等。
miRNA的克隆流程大致如下：在变性的聚丙烯酰胺凝胶上分离RNA样品，并回收大小在18-25 nt的片段。
接着，给RNA加上5’和3’接头，并进行RT-PCR，然后将片段克隆到载体上，构建出cDNA文库。
对单个克隆进行测序和分析，以确定小RNA。
目前测序技术的蓬勃发展也大大促进了这种方法。
然而对于某些只在特定细胞类型中表达，或以低水平表达的miRNA来说，鉴定起来还是有难度的。
另外，介于物理性质或转录后修饰，某些miRNA可能难以克隆，这也是一个棘手的问题。
MicroRNA研究概况以及MicroRNA芯片技术简述MicroRNA的研究
MicroRNA 研究概况以及MicroRNA 芯片技术简述一、MicroRNA 的研究概况1.MicroRNAMicroRNA（miRNA , miR）是由约21-25个核苷酸组成的分子，microRNA 通过抑制mRNA 的翻译或者促进其降解而起到负性调控的作用。
最初miRNA 的功能在植物学、癌症、病毒性感染和发育生物学中得到了验证。
但最近的研究发现，患有心脏疾病的小鼠对照正常状态miRNAs 失调，并且在肥大的心脏中也检测到了数种miRNA 的上调或者下调，同时体外实验也证实了它们对心肌细胞形态的影响。
2.MicroRNA 的研究进展miRNA现象的最早报道是在佃80年的Genetics和Cell上。
佃93年在线虫中发现的lin-4 是第一个被确定的miRNA [31]，它的基因产物是21 个核苷酸的RNA 分子并且部分序列互补于lin-14 mRNA的3' UTR区域。
这些互补序列使lin-4间断地与lin-14 mRNA结合。
奇怪的是，lin-4没有明显地改变lin-14 mRNA的量，但是Lin-14蛋白表达却明显降低。
2000年又在线虫中发现了与lin-4相似的miRNA ―― let-7，它们参与线虫发育的时空调节。
miRNA基因首先被RNA聚合酶H转录为较长的初始转录本，该转录本含有数千个核苷酸，称其为pri-miRNA。
在pri-miRNA内，miRNA位于由大约70个核苷酸构成的环柄结构内。
在动物体内，该环柄结构在细胞核内被RNA酶川Drosha和其辅助蛋白Pasha/DGCR8 识别和切割，形成pre-miRNA 。
之后，pre-miRNA 迅速被核质/细胞质转运蛋白Exportin5转运至细胞质，被位于细胞质内的RNA酶川Dicer 进一步切割。
产生一个类似于siRNA 的miRNA ：miRNA* 复合体，随后，该双链体解旋为成熟的miRNA和miRNA*，成熟的miRNA在一种ATP-依赖的沉默复合体（RISC ）中，形成非对称的RISC 复合物。
沉默病毒编码的miRNA——新型抗病毒治疗法研究进展
沉默病毒编码的miRNA——新型抗病毒治疗法研究进展夏银可;潘耀谦;朱广蕊;刘兴友【摘要】miRNA是一类在转录后水平调节基因表达的非编码RNA.病毒编码的miRNA在调控病毒基因自身表达及病毒与宿主相互作用方面起着重要作用,这一类miRNA有助于提高病毒的致病性.因此,通过使用与病毒miRNA互补的单链核苷酸即抗miRNA寡核苷酸(anti-miRNA oligonucleotides,AMOs)来抑制病毒miRNA的表达,从而沉默其功能达到抑制病毒复制的效果,这可能成为一种治疗病毒性感染的新方法.文章描述了研究较深入的病毒miRNA与其功能及AMOs的修饰方式,并讨论了AMOs应用的可能性.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)002【总页数】5页(P35-39)【关键词】病毒miRNA;AMOs;反义寡核苷酸;RNA干扰【作者】夏银可;潘耀谦;朱广蕊;刘兴友【作者单位】河南科技学院,河南新乡 453003;动物病毒防控与药残分析河南省重点学科开放实验室,河南新乡 453003;动物疫病和残留物防控河南省高校工程技术研究中心,河南新乡 453003;河南科技学院,河南新乡 453003;动物病毒防控与药残分析河南省重点学科开放实验室,河南新乡 453003;动物疫病和残留物防控河南省高校工程技术研究中心,河南新乡 453003;河南科技学院,河南新乡 453003;动物疫病和残留物防控河南省高校工程技术研究中心,河南新乡 453003;河南科技学院,河南新乡 453003;动物病毒防控与药残分析河南省重点学科开放实验室,河南新乡453003;动物疫病和残留物防控河南省高校工程技术研究中心,河南新乡 453003【正文语种】中文【中图分类】Q756病毒是人体中常见的寄生物，能够通过创造一个良好的细胞环境来逃避宿主免疫系统的监测，从而允许其复制和生存。
为了实现这个目的，病毒已形成了不同的机制，其中之一就是通过调整宿主细胞对病毒的RNA干扰从而在转录后水平调节宿主细胞和病毒基因的表达。
microRNA沉默技术
microRNAs 沉默技术例证
microRNAs沉默技术例证
实验进程1
·实验动物：小鼠
·沉默分子：antagomir-122
就
是
·提呈系统：胆固醇偶联
我
啦！
·注射方式：尾静脉注射
·靶分子：miR-122（肝脏）
microRNAs沉默技术例证
northern biot分析
③ 夏新，张小敏，宋鹏飞，王爽.反义寡核苷酸介导的 miRNA沉默研究.安徽农业科学.2011.39(24):14545-14547
④ Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350–-355
病（没有图）
microRNAs 沉默技术
microRNAs沉默技术
microRNAs的转录与加工
无效或低 效沉默
高效沉默
microRNAs沉默技术
用单纯的反义寡核苷酸抑制miRNA
效果差！！
分子改造！！
反义寡核苷酸链与miRNA之间 亲和力低！！稳定性差！
1.提高亲和力！ 2.延长细胞内滞留时间！
目录
microRNAs 背景知识介绍
microRNAs的背景知识介绍
mRNA：信使RNA，转录的模板 tRNA ：转运RNA rRNA：核糖体RNA microRNA：微小RNA，起基因调控作用。 hnRNA：不均一核RNA，多为mRNA的前体 snRNA：小核RNA ,对RNA加工方面起作用。 ssRNA:作为病毒的线状单链遗传物质 dsRNA：作为病毒的线状双链遗传物质 siRNA：小干扰RNA Sat-RNA：卫星RNA TR：端粒酶RNA，组成端粒酶的成分之一 核酶RNA：起催化反应的RNA。 。。。。。。
从反义RNA到人工miRNA的植物基因沉默技术革新_张晓辉
2009-05-11 收稿, 2009-06-25 收修改稿 * 国家重点基础研究发展计划( 批准号: 2009C B119000) 和国家自然科学基金( 批准号: 30671417 和 30800756) 资助项目 * * 通信作者, E- mail : zb ye@ mail1 hz au1 edu1 cn
摘要 植物基因沉默技术作为一个重要的遗传操作工具在植物分子生物学研究和遗传改良方面 得到广泛应用. 自 20 世纪 90 年代基因沉默现象发现以来, 多种植物基因沉默技术相继建立, 包 括共抑制、反义 RNA、hpRNA i 和 VIGS 等. 最近, 两种新的 植物基因沉默 技术: 人工 M icroRNA 和人工 tr ans- act ing siRNA 建立起来, 在基因沉默的精确性和高效性等方面有了新突破. 由 于植物体具有多条基因沉默途径, 不同的基因沉默技术具有独特的应用优势. 本文对这些基因沉 默技术进行了系统的介绍和总结, 梳理了不同技术的优缺点和适用范围, 并展望了植物基因沉默 技术进一步发展的方向和应用前景.
基因功能时方便快捷[ 19] . 很多病毒能够编码抑制蛋 白, 抑制宿主的 R N A 干涉机制[ 20] . 要想达到理想 的基因沉默效果, 应该采用抑制能力低的毒株. 由 于 VIGS 不是持久稳定的沉默系统, 对于需要观察 全生育期的基因, VIGS 技术并不太适用.
1. 4 完美与缺陷并存的第 1 代 RNA 沉默技术 由于植物基因 定点突变效率 极低, RN A 沉默
2 microRNA 的发现与人工 microRNA 技术
2. 1 植物 microRNA m icroRNA 是真核生物中广泛存在的一类调节
植物 miRNA 的生物功能与研究方法
植物 miRNA 的生物功能与研究方法伊六喜;苏少锋;刘红葵;斯钦巴特尔∗【摘要】植物 microRNA(miRNA)是近年来发现的一类在植物体内普遍存在的内源非编码小 RNA,与植物基因表达调控相关。
本文综述了植物 miRNA 的特点、miRNA 与植物发育的关系及调控机制、植物 miRNA 研究方法等,对植物生长发育以及抗性的调控机制提供了研究方向,同时对于一些基因家族研究提供了理论基础。
% MicroRNAs (miRNAs) are a kind of endogenous small non-coding RNAs commonly found in plants in recent years, and are involved in gene expression in plants. This paper reviews the characteristics of the plant miRNA, the relationship between miRNA and plant development, as well as regulatory mechanism, and research methods in plants, so as to make a direction to do research on regulatory mechanism of plant growth and development as well as plant resistance, at the same time to provide a theoretical basis for some gene family research.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2013(000)003【总页数】5页(P166-170)【关键词】microRNA;植物;基因调控【作者】伊六喜;苏少锋;刘红葵;斯钦巴特尔∗【作者单位】内蒙古农牧业科学院，呼和浩特 010031;内蒙古农牧业科学院，呼和浩特 010031;内蒙古农牧业科学院，呼和浩特 010031;内蒙古农牧业科学院，呼和浩特 010031【正文语种】中文长期以来,多数研究者认为除了成熟snRNA、tRNA和rRNA外,大部分RNA仅仅在DNA和蛋白质之间起桥梁作用,但随后发现RNA也可能参与真核细胞中基因表达的调控[1]。
miRNA的研究策略与方法
miRNA的研究策略与方法1. miRNA检测与鉴定：研究者可以使用多种方法来检测和鉴定miRNA。
最常用的方法是使用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）来测量miRNA的表达水平。
此外，还可以使用Northern blotting、原位杂交、高通量测序等方法来检测miRNA的存在和表达水平。
2. miRNA功能的研究：为了了解miRNA的功能，研究者可以通过多种方法来探究miRNA与其靶基因之间的相互作用关系。
其中，miRNA靶向预测算法可以帮助确定可能的靶基因。
这些预测结果可以通过实验验证来评估其准确性。
常见的实验方法包括使用Luciferase报告基因系统、RNA结合蛋白共沉淀等技术。
3. miRNA在疾病中的研究：miRNA在人类疾病的发生和发展中起着重要的调控作用。
因此，研究miRNA与疾病之间的关系成为热门研究方向。
研究者可以使用高通量测序等方法，比较健康人群和疾病患者的miRNA表达谱，并通过使用生物信息学工具进行差异分析与生物信息学注释。
此外，还可以构建miRNA与疾病之间的关联网络，以揭示miRNA在疾病发生和发展中的调控网络。
4. miRNA药物的开发：近年来，miRNA药物的开发已成为治疗疾病的新领域。
研究者可以利用高通量筛选技术，如miRNA反义寡核苷酸（antimiRNA）筛选，来寻找具有特定功能的miRNA抑制剂。
此外，还可以使用miRNA模拟物或增强剂来恢复缺乏的miRNA表达水平，并开发具有治疗潜力的miRNA药物。
总之，miRNA的研究策略和方法是多样化的，包括miRNA检测与鉴定、miRNA功能研究、miRNA与疾病的关系研究以及miRNA药物的开发。
通过这些方法，研究者可以进一步了解miRNA在基因调控和疾病发生中的功能和机制，为疾病的治疗提供新的思路和方法。
miRNA过表达或干扰
miRNA过表达或干扰尽管第一个microRNA是在1993年发现的，但直到最近几年，人们才开始了解这种小RNA分子的大作用。
miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。
最近的研究表明它们影响了约三成的基因。
miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。
同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。
然而，miRNA很小，这就增添了研究的难度。
如何从细胞中提取和纯化miRNA？如何上调或下调特定的miRNA？如何验证结果？全靠自己摸索，体会是很深，但时间也花不少。
收集了来自顶尖研究院的专家的实际操作经验，这将让你少走弯路。
Q1：您使用什么方法来上调或下调特定的miRNA？为什么？Galina Gabriely（哈佛大学）对于miRNA的下调，我们使用修饰的反义寡核苷酸，因为它们能产生最特异的抑制。
此外，我们也使用LNA修饰的oligo。
这些oligo与miRNA的高亲和力结合，提供了强的抑制，不过它们偶尔会有脱靶效应。
对于上调，我们使用Ambion 的合成miRNA模拟物。
Peng Jin（埃默里大学）我们使用RNA oligo和载体的方法。
对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA 双链的miRNA，及anti-miRNA来增加或阻断特定miRNA的活性。
这种方法便于操控细胞培养中特定miRNA的活性。
载体方法有着长期改变的优势，能够追踪个别细胞。
我们利用人工的shRNA质粒或Pol II表达载体，来过表达特定的miRNA。
对于miRNA的下调，我们要么表达一个shRNA，它能产生与miRNA前体的茎环结构互补的siRNA，要么使用miRNA海绵（miRNA sponge），它能在特定miRNA的多个目标位点表达报告基因。
Winston Kuo（哈佛大学）目前有两种通用策略：1) 基于载体或病毒的miRNA或miRNA反义链序列的过表达；2) 外源miRNA双链或反义抑制剂的转染。
RNA介导基因沉默技术原理分析
RNA介导基因沉默技术原理分析基因沉默技术是一种能够靶向抑制特定基因表达的研究工具。
其中，RNA介导基因沉默技术是近年来被广泛应用的一种方法。
它利用RNA分子的特性，特异性地破坏或抑制目标基因的转录或翻译过程，从而实现对基因表达的调控。
本文将对RNA介导基因沉默技术的原理进行分析。
RNA介导基因沉默技术主要分为两类：siRNA和miRNA。
siRNA（small interfering RNA）是由双链RNA分子形成的，长度约为20-25个碱基对。
siRNA的合成通常来自外源，可以通过体外转染或体内递送的方式引入到细胞内。
miRNA （microRNA）则是由内源性原料mRNA产生的，经过一系列的加工和修剪后形成成熟的miRNA，并通过RNA诱导靶向基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）介导对目标基因的调控。
RNA介导基因沉默技术的原理可以简单概括为：RNA分子与靶向mRNA结合，通过碱基互补配对形成RNA-RNA复合物，并借助RISC或其他相关蛋白质的介导，引发一系列生物学效应，最终导致目标基因的沉默。
siRNA介导的基因沉默通常是通过切割靶向mRNA来实现的。
siRNA靶向到mRNA上后，siRNA的双链结构被RISC剪切成成熟的单链siRNA，然后互补配对形成siRNA-mRNA复合物。
RISC再次剪切这个复合物，导致被靶向的mRNA分解成小片段，从而阻断了该基因的翻译和表达过程。
这种方式使得siRNA具有高度特异性和高效性，可选择性地沉默单个基因。
miRNA介导的基因沉默则是通过遗传信息的转化实现的。
miRNA与mRNA的配对比较宽松，因此可以与多个目标mRNA结合。
miRNA-RISC复合体识别到互补区域后，通过靶向MRE（miRNA response element）结构，调控相应mRNA的翻译和/或稳定性。
这种调控机制更加复杂和灵活，一个miRNA可以同时调控多个基因，而且同一个基因也可以被多个miRNA调控。
MicroRNA与脂质代谢
MicroRNA与脂质代谢摘要】 MicroRNAs已经成为一种重要的调节脂质代谢的因子。
最近发现的microRNA-33a and b (miR-33a/b)在体内胆固醇和脂肪酸代谢动态平衡中起着很重要的调节作用。
这些microRNA嵌入在固醇响应元件结合蛋白基因（SREBF2 和SREBF1）中，通过抑制参与到胆固醇输出和脂肪酸氧化的基因，比如ABCA1，CROT，CPT1，HADHB和PRKAA1，转录后调节胆固醇和脂肪酸代谢。
miR-33a/b促进细胞内脂质沉积。
在新近的动物实验研究中表明抑制这些小干扰RNA对脂蛋白代谢的调节有很显著的影响，包括增加血浆中高密度脂蛋白（HDL）和减少极低密度脂蛋白（VLDL）中甘油三酯的代谢。
这些新的发现支持了microRNA拮抗剂在治疗血脂异常、动脉粥样硬化和相关代谢疾病中的潜在作用。
【关键词】小RNA 脂肪代谢高密度脂蛋白甘油三酯【中图分类号】R589.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）08-0138-02脂质代谢异常可引起动脉粥样硬化、冠心病、肥胖症等多种与代谢相关的疾病，严重威胁人类健康。
近期研究发现，microRNA参与上述多种病理过程的调控。
本文综述了近些年来microRNA对脂质代谢调控方面的研究进展，并对其在治疗中的潜在作用进行了展望。
1. microRNA的结构与作用机制microRNA是一类大小约18-22个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。
microRNA在真核基因表达调控中有着广泛的作用。
尽管有一部分在所有细胞的各个阶段中均有表达，但是大多数microRNA的表达水平在不同组织、不同发育阶段具有其特异性。
microRNA作用于目的基因的方式与两者的配对程度有关：成熟的microRNA通过Watson-Crick碱基配对识别并结合靶标 mRNA的3’UTR、5’UTR 或编码蛋白外显子区域。
miRNA_的研究策略与方法
miRNA_的研究策略与方法首先，miRNA筛选和鉴定是miRNA研究的重要步骤。
常用的筛选方法包括基于生物信息学的预测和实验验证。
生物信息学预测方法通过分析miRNA序列的保守性和结构特征，在基因组序列中寻找潜在的miRNA靶点。
实验验证的方法包括荧光原位杂交、Northern blot和实时荧光定量PCR 等。
荧光原位杂交可以用来检测miRNA的在组织和细胞中的表达位置，Northern blot可以分析miRNA的大小和表达水平，实时荧光定量PCR可以定量miRNA表达水平。
其次，miRNA功能研究是理解miRNA调控机制的关键。
常用的方法包括靶基因筛选、功能实验和信号通路调控研究等。
靶基因筛选可以通过预测和实验证实miRNA的靶基因，进而了解miRNA的调控效应。
功能实验常用的方法包括miRNA过表达和敲除实验。
miRNA过表达实验可以通过转染miRNA mimics来提高miRNA表达水平，进而研究miRNA在生物体内的功能。
miRNA敲除实验常用的方法包括化学合成抗义寡核苷酸和RNA干扰技术，可以降低miRNA的表达水平，进而研究miRNA在生物体内的功能。
信号通路调控研究可以通过分析miRNA在信号通路中的靶基因，揭示miRNA的调控机制。
最后，miRNA表达调控机制的研究是深入理解miRNA调控功能的重要途径。
常用的研究方法包括转录调控机制研究和转录后调控机制研究等。
转录调控机制研究可以分析miRNA的转录启动子和调控因子，揭示miRNA的转录调控机制。
转录后调控机制研究可以通过分析miRNA的生物合成和降解过程，了解miRNA的转录后调控机制。
总结：miRNA的研究策略和方法涵盖了miRNA筛选和鉴定、功能研究以及表达调控机制的研究等方面。
通过这些方法，可以深入了解miRNA的功能和调控机制，为进一步揭示miRNA在生命现象中的作用提供重要的研究手段。
RNA 沉默技术及其在研究中的应用
RNA 沉默技术及其在研究中的应用RNA 沉默技术（RNA interference, RNAi）是一种通过特定的RNA分子抑制基因表达的技术。
这项技术的重要性在于，它可以用来研究基因的功能。
RNA 沉默技术首先是在线虫中被发现的，随后被证明可以应用于很多生物体。
RNA 沉默技术的基本原理是：RNAi通过RNA酶切割特定的mRNA分子来阻止它们被翻译成蛋白质。
这个过程通常分为两步，首先，RNAi酶切割一个长的RNA分子，或者特定的基因，将它分解成较短的RNA分子，这个过程被称为核酸酶溶解（nuclease digestion）。
然后，RNAi复合物会在完全或部分匹配对应RNA序列的mRNA上识别并与之结合，使mRNA无法被翻译成蛋白质，从而达到了抑制基因表达的目的。
这个过程被称作片段介导的RNA 沉默（siRNA-mediated RNAi）。
RNA 沉默技术在研究中的应用非常广泛。
其中最重要的一个应用就是帮助识别基因的功能。
在研究人员未知基因的功能的时候，他们可以通过RNA 沉默技术来验证这个基因是否是真正的功能基因，而不是一个不重要的垃圾DNA。
在这种情况下，RNAi技术就可以将这个基因在目标细胞中沉默，从而通过比较有基因和无基因实验组的表型来分辨出这个基因的功能。
此外，RNA 沉默技术还可以用于快速测试活性分子以及模拟基因缺失状态。
研究人员可以使用小分子化合物或GMOi（一种基于CRISPR-Cas系统的RNAi替代品）来局部打断基因表达。
这些实验可以在非常短的时间内得出结论，这对于新药开发和生物医学研究尤为重要。
除了在科学研究中的应用之外，RNA 沉默技术还可以用于肿瘤治疗和免疫调节。
肿瘤治疗中，RNAi技术可以有选择性地打断肿瘤细胞的生长和分裂，从而将其切断。
在免疫调节方面，RNAi技术可以通过沉默免疫激活基因来抑制免疫反应，从而治疗过度免疫反应性的疾病。
RNA 沉默技术在科学研究中的应用越来越广泛，尤其是在基因治疗和药物开发上。
miRNA专家谈之三：如何上调或下调miRNA？
摘要： miRNA很小，这就增添了研究的难度。
如何从细胞中提取和纯化miRNA？如何上调或下调特定的miRNA？如何验证结果？全靠自己摸索，体会是很深，但时间也花不少。
生物通收集了来自顶尖研究院的专家的实际操作经验，这将让你少走弯路。
生物通编者按：尽管第一个microRNA是在1993年发现的，但直到最近几年，人们才开始了解这种小RNA分子的大作用。
miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。
最近的研究表明它们影响了约三成的基因。
miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。
同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。
然而，miRNA很小，这就增添了研究的难度。
如何从细胞中提取和纯化miRNA？如何上调或下调特定的miRNA？如何验证结果？全靠自己摸索，体会是很深，但时间也花不少。
生物通收集了来自顶尖研究院的专家的实际操作经验，这将让你少走弯路。
Q1：您使用什么方法来上调或下调特定的miRNA？为什么？Galina Gabriely（哈佛大学）对于miRNA的下调，我们使用修饰的反义寡核苷酸，因为它们能产生最特异的抑制。
此外，我们也使用LNA修饰的oligo。
这些oligo与miRNA的高亲和力结合，提供了强的抑制，不过它们偶尔会有脱靶效应。
对于上调，我们使用Ambion的合成miRNA模拟物。
Peng Jin（埃默里大学）我们使用RNA oligo和载体的方法。
对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA双链的miRNA，及anti-miRNA来增加或阻断特定miRNA的活性。
这种方法便于操控细胞培养中特定miRNA的活性。
载体方法有着长期改变的优势，能够追踪个别细胞。
我们利用人工的shRNA质粒或Pol II表达载体，来过表达特定的miRNA。
对于miRNA的下调，我们要么表达一个shRNA，它能产生与miRNA前体的茎环结构互补的siRNA，要么使用miRNA海绵（miRNA sponge），它能在特定miRNA的多个目标位点表达报告基因。
乳腺癌反义寡核苷酸治疗的研究进展
乳腺癌反义寡核苷酸治疗的研究进展反义寡核苷酸技术(ASODN)作为一种新的分子生物学工具及新型药物受到医疗界越来越多的关注。
许多反义药物作为抗肿瘤药物已进入临床试验，并取得了令人欣喜的效果。
1 反义寡核苷酸的作用机理简介1.1反义寡核苷酸是在体外人工合成的能与体内某RNA或DNA序列互补结合的短序列单链DNA。
它可以作为反义药物与细胞内特异的靶序列互补,从而抑制基因表达。
该技术的作用原理主要通过下列途径发挥作用：（1）ASODN与DNA结合，抑制DNA复制和转录，它通过在DNA结合蛋白的识别点处与DNA双螺旋结合形成三螺旋，阻止基因的转录和复制。
(2) ASODN可影响真核生物mRNA核内加工的步骤，如5’端加帽结构、3’端加polyA及剪接的过程，从而抑制了mRNA的成熟过程。
(3)ASODN与目标mRNA特异性碱基互补结合，阻断RNA加工、成熟，阻止核糖体与起始因子的结合，影响核糖体沿mRNA移动，从而阻止翻译。
1.2天然的ASODN能够很快被在细胞内存有的大量的核酸外切酶和核酸内切酶降解。
因此，ASODN必须要经过修饰才能在体内发挥作用。
研究表明，硫代修饰之后的ASODN稳定，具有良好的水溶性，并容易大批量人工合成来应用于临床的研究。
所以，目前硫代磷酸型的ASODN已应用于各个水平的研究领域中。
1.3反义寡核苷酸在乳腺癌的治疗研究中的应用主要通过抑制乳腺癌细胞生长、增殖、分化诱导凋亡，抑制乳腺癌细胞的转移和侵袭，降低乳腺癌的多药耐药性来实现。
1.4反义基因技术具有明显的优点，由于DNA序列在一般情况下是单拷贝，而mRNA是多拷贝，因此ASODN相比于反义RNA只需少量的ODN与DNA靶序列结合，就可以具有很强的抑制效果。
它治疗乳腺癌特异性高，副作用少，与化疗、放疗和靶向药物结合有协同作用，并已逐步从实验室走向临床。
2 针对主要的进入临床前试验的致乳腺癌基因的反义寡核苷酸的研究理论上认为任何致乳腺癌基因都可以成为ASODN的作用靶点，目前主要以细胞凋亡抑制基因、乳腺癌转移和血管生成基因、生长因子及受体、信号传导通路等作为常用的分子靶点。
反义RNA技术在基因沉默中的应用
反义RNA技术在基因沉默中的应用随着人类对基因的深入研究，我们在基因调控中发现了许多具有重要作用的分子。
反义RNA技术则是其中的一种，它通过干扰基因转录或翻译过程，使基因无法表达或表达受到限制。
在基因学和生物技术领域，反义RNA技术已成为一项重要的研究工具。
反义RNA技术的原理反义RNA技术是利用反义RNA分子对目标RNA分子进行结合和干扰，达到抑制基因表达或限制基因表达的目的。
在生物体内，RNA分子是纳米级别的分子，直接作用在RNA分子上的化合物自然界中非常少。
因此，人们使用合成小分子RNA，如siRNA和miRNA，作为靶向RNA分子的反义RNA分子。
siRNA分子是一种由21-25个核苷酸组成的RNA双链分子，可以在纳秒级别水平上将mRNA分子的特定区域“切断”，有效地抑制基因表达。
miRNA分子是一种由21-23个核苷酸组成的RNA单链分子，它们通过与mRNA分子RNA互补配对，阻止mRNA分子的翻译或影响其稳定性。
反义RNA技术的应用反义RNA技术除了用于研究基因功能外，还用于生物医学领域的基础研究。
通过反义RNA技术，可以研究特定基因的功能、筛选新药物、甚至开发基因治疗方法。
其中，基因治疗是应用反义RNA技术的一项前沿技术。
在生物研究中，反义RNA技术可用于沉默某些与重要疾病相关的基因，针对某些疾病的基因进行沉默，进而减轻或消除疾病的影响。
常用的沉默技术包括siRNA和shRNA（小干扰RNA和短发夹RNA），在这两种技术中，siRNA是使用最多的沉默技术。
siRNA导致的基因沉默是通过对靶向mRNA进行特异性水解的方式来实现的。
siRNA可以很好地沉默基因表达。
全新的RNA干扰技术是利用端粒酶伸展寡核苷酸开发的双链反式RNAs (D-RNAs) 来抵消基因抑制。
反式RNA是一种开启基因表达的新型技术，它在诱导沉默基因时能够有效地删除核酸序列，从而激活一些已被沉默的基因，达到治疗某些疾病的目的。
miRNA海绵―长效抑制miRNA
miRNA海绵―长效抑制miRNA随着研究的深入，已知miRNA的数量与日俱增，目前Sanger miRBase数据库中收录的人miRNA已达721条。
不过，大部分miRNA的功能仍是未知数。
在基因功能研究中，最有效的方法是阻止特定基因的功能，然后了解其后果。
miRNA同样如此。
然而，相比之下，miRNA的功能研究要困难得多。
为什么？首先，miRNA没有蛋白产物，这使得研究复杂化。
其次，miRNA的生物发生有多个步骤。
最初的转录本为pri -miRNA，它在细胞核中加工形成前体pre-miRNA。
这个茎环结构的RNA输出到细胞质，被Dicer酶进一步加工，最终形成了成熟的miRNA。
成熟的miRNA没有poly(A)尾巴，因而检测起来要颇费一番心思。
除了检测，miRNA的功能丧失（loss-of-function）研究也是难题。
标准的RNAi技术行不通。
成熟的miRNA与siRNA不相容，因为它们两者都能进入RISC复合物；pre-miRNA是茎环结构的，siRNA无从下手；pri-miRNA貌似是siRNA最容易靶定的，但一个是细胞核，一个在细胞质，好似牛郎织女，无法见面。
当然，科学家们也不是束手无策。
miRNA不是能与互补的mRNA结合吗？他们就开发出与miRNA互补的寡核苷酸，作为mRNA结合的竞争性抑制剂。
这些抑制剂实现了短期分析，在细胞培养物以及某些动物实验中都获得了成功。
但是，如何实现miRNA的长期抑制？2007年，麻省理工大学的Phillip Sharp及他的同事利用相似的原理，开发出一种长期抑制miRNA基因的高效方法1。
他们称之为miRNA海绵（miRNA sponge），意思是吸满了miRNA，这样它就无法与天然靶点结合。
miRNA海绵是一条mRNA，其3’ 非翻译区（UTR）包含若干个miRNA靶定位点（如下图）。
更重要的是，这些靶定位点在RISC切割位点有一些错配。
这样，抑制剂mRNA就不会被降解，而与RISC稳定结合，让它远离天然的mRNA靶点。
反义寡核苷酸下调miRNA-21表达对人结肠癌模型体内生长的作用
doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2019.18.1435反义寡核苷酸下调miRNA-21表达对人结肠癌模型体内生长的作用刘士明1,2，崔盼盼1,2，丁涛1,2，陈超1,2，郭萌萌1,2，徐林1,2Effects of Antisense Oligonucleotides Against miRNA-21 on Growth of Human Colon Cancer Cells in vivoLIU Shiming 1,2, CUI Panpan 1,2, DING Tao 1,2, CHEN Chao 1,2, GUO Mengmeng 1,2, XU Lin 1,21. Special Key Laboratory of Gene Detection & Therapy of Guizhou Province, Talent Base of Biological Therapy of Guizhou Province, Zunyi 563099, China;2. Department of Immunology, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, ChinaCorresponding Author: XU Lin, E-mail: xulinzhouya@Abstract: Objective To investigate the effect of antisense oligonucleotides(ASOs) against miR-21 expression on the growth of human colon carcinoma cells line HCT116 in vivo . Methods The nude mouse model of human colon carcinoma cell line HCT116 was established. The p-miR-21-ASOs plasmid and p-Cont plasmid (100μg/body) were inoculated subcutaneously into xenograft tumor, and the tumor growth was observed. HE staining was used to observe the morphological changes of tumor; immunofluorescence technique was used to detect tumor core antigen Ki-67 protein expression; the expression levels of mature miR-21, as well as cyclin-dependent kinase 2 (CDK2), CDK3, CDK4 and CDK6 were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. And the levels of p-Akt, p-ERK1/2, total Akt and ERK1/2 protein were analyzed by Western blot. Results Compared with p-Cont group, the tumor cells in the p-miR-21-ASOs group had a slower growth rate, and the tumor quality was significantly decreased (P <0.05); moreover, the expression level of Ki-67 was decreased significantly (P =0.0074); the expression level of miR-21, CDK2,CDK3, CDK4 and CDK6 were significantly decreased (all P <0.05); the relative expression levels of p-Akt and p-ERK were significantly down-regulated (P <0.05). Conclusion The down-regulation of miR-21 expression by ASOs could significantly inhibit the growth of human colon cancer cells in vivo .Key words: miR-21; Eukaryotic expression; Colon cancer; Xenograft model; Gene therapy摘 要：目的 探讨反义寡核苷酸（ASOs ）下调微小RNA-21（miR-21）表达的效果及其对人结肠癌细胞系HCT116裸鼠皮下种植瘤生长的影响。
乳腺癌反义寡核苷酸治疗的研究进展
乳腺癌反义寡核苷酸治疗的研究进展引言乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，目前该疾病的发病率和死亡率不断上升，严重影响着女性的健康和生活质量。
目前，临床治疗乳腺癌的方法主要包括手术、化疗、放疗和内分泌治疗等，但是这些方法存在一定的缺点，如手术容易切除不充分，化疗和放疗会产生很多的副作用，而内分泌治疗则存在耐药性的问题。
因此，需要寻找一种新的治疗方法，提高乳腺癌的治愈率和生存率。
反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides）是一种新型的基因治疗方法，它通过向特定的基因或mRNA（信使RNA）的互补序列靶向结合，并干扰其翻译或剪接，从而实现基因的“沉默”或“敲除”，以达到治疗疾病的目的。
因此，乳腺癌反义寡核苷酸治疗在近年来得到了广泛关注和研究。
本文将从反义寡核苷酸的机制、研究进展和前景等方面进行探讨。
反义寡核苷酸治疗乳腺癌的原理乳腺癌发生和发展的过程中，许多基因和信使RNA的异常表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移密切相关。
反义寡核苷酸则是设计一条针对这些目标RNA的互补序列的寡核苷酸，与其靶向结合，并在结合后干扰其正常的基因表达。
在乳腺癌中，HER2基因的过度表达与肿瘤细胞的增殖和转移有关。
因此，许多研究者将反义寡核苷酸用于抑制HER2基因的表达，以达到治疗乳腺癌的目的。
具体而言，反义寡核苷酸结合HER2基因的mRNA，干扰其正常的翻译过程，从而降低HER2蛋白的表达水平，抑制癌细胞的增殖和转移。
反义寡核苷酸治疗乳腺癌的研究进展随着反义寡核苷酸技术的不断发展，越来越多的反义寡核苷酸被用于临床治疗乳腺癌。
以下将介绍一些具有代表性的研究成果：1. Trastuzumab-DM1的研究Trastuzumab-DM1是一种由抗HER2单克隆抗体Trastuzumab和细胞毒素DM1构成的复合物，可靶向HER2蛋白并诱导乳腺癌细胞凋亡。
研究者通过将Trastuzumab-DM1联合反义寡核苷酸治疗HER2过度表达的乳腺癌，发现这种联合治疗可显著抑制HER2基因的表达并抑制肿瘤细胞的增殖和转移。
从反义RNA到人工miRNA的植物基因沉默技术革新
从反义RNA到人工miRNA的植物基因沉默技术革新张晓辉;邹哲;张余洋;李汉霞;叶志彪【期刊名称】《自然科学进展》【年(卷),期】2009(019)010【摘要】植物基因沉默技术作为一个重要的遗传操作工具在植物分子生物学研究和遗传改良方面得到广泛应用.自20世纪90年代基因沉默现象发现以来,多种植物基因沉默技术相继建立,包括共抑制、反义RNA、hpRNAi和VIGS等.最近,两种新的植物基因沉默技术:人工Micro-RNA和人工trans-acting siRNA建立起来,在基因沉默的精确性和高效性等方面有了新突破.由于植物体具有多条基因沉默途径,不同的基因沉默技术具有独特的应用优势.本文对这些基因沉默技术进行了系统的介绍和总结,梳理了不同技术的优缺点和适用范围,并展望了植物基因沉默技术进一步发展的方向和应用前景.【总页数】9页(P1029-1037)【作者】张晓辉;邹哲;张余洋;李汉霞;叶志彪【作者单位】华中农业大学;华中农业大学;华中农业大学;华中农业大学;华中农业大学【正文语种】中文【中图分类】Q4【相关文献】1.反义寡核苷酸介导的miRNA沉默研究 [J], 夏新;张小敏;宋鹏飞;王爽2.利用人工miRNA技术建立甲胎蛋白稳定沉默肝癌细胞及沉默效果评价 [J], 谢佩雯;张秀娟;黄海;王学军;王升启3.人工miRNA沉默基因的研究 [J], 张献贺;孔稳稳;李勇;李晶4.合成U3snRNA基因上游启动区构建ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因的植物表达载体 [J], 鲍国强;扈廷茂;海燕;李丽莉5.余健秀研究组在miRNA作用机制研究中取得新进展--上海交通大学医学院生物化学与细胞生物学系研究人员揭示蛋白质修饰调控初始miRNA(pri-miRNA)直接介导基因沉默效应的分子机制 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
万方数据
万方数据
万方数据
反义寡核苷酸介导的miRNA沉默研究
作者：夏新， 张小敏， 宋鹏飞， 王爽
作者单位：夏新(重庆大学生物工程学院基因工程研究中心,重庆,400030)， 张小敏(西南医院感染科,重庆,400030)， 宋鹏飞,王爽(深圳华大基因研究院,广东深圳,518083)
刊名：
安徽农业科学
英文刊名：Journal of Anhui Agricultural Sciences
年，卷(期)：2011,39(24)
被引用次数：1次
1.BEREZIKOV E;GURYEV V;van de BELT J Phylngenetic shadowing and computational identification d human microRNA genes[外文期刊] 2005(01)
2.XIE X H;LU J;KULBOKAS E J Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters and 3' UTRs by comparison of several mammals 2005(7031)
3.JOSHUA T M miRiad roles for the miR-17-92 cluster in development and disease[外文期刊] 2008(02)
4.KUHN D E;MARTIN M M;FELDMAN D S Experimental validation of miRNA targets[外文期刊] 2008
5.ESAU C C;MONIA B P Therapeutic potential for microRNAs 2007
6.DAVID P B MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism and function[外文期刊] 2004(02)
7.BOUTLA A;DELIDAKIS C;TABLER M Developmental defects by antisense-mediated inactivation of micro-RNAs 2 and 13 in Drosophila and the identification of putative target genes[外文期刊] 2003
8.HUTVAGNER G;MARTIN J S;CRAIG C M Sequence-spocific inhibition of small RNA function[外文期刊] 2004
9.WEILER J;HUNZIKER J;HALL J Anli-rniRNA oligonucleotides (AMOs):ammunition to target miRNAs implicated in human disease[外文期刊] 2006(6)
10.ESAU C;DAVIS S;MURRAY S F miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting[外文期刊] 2006
11.JAN K;NIKOLAUS R;RAVI B Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs' 2005
12.GRUNWELLER A;HARTMANN R K Locked nucleic acid oligonucleotides:the next generation d antisense agents 2007
13.OROM U A;KAUPPINEN S;LUND A H LNA-modified oligonucleotides mediate specific inhibition of microRNA function 2006
14.ELMEN J;ASLI S;MADS B Antagomism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in th liver 2008
15.ELMEN J;LINDOW M;SCHUTZ S LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates[外文期刊] 2008(7189)
16.GRUNWELLER A;WYSZKO E;BIEBER B Comparison of different antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids,2'-Omethyl RNA,phosphorothioates and small interfering RNA[外文期刊] 2003(12)
17.NASEVICIUS A;EKKER S C Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish[外文期刊] 2000(2)
18.WIGARD P K;ANNE K L;RENE F K Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic Islet development 2007(08)
19.STENVANG J;SILAHTAROGLU A N;LINDOW M The utility of LNA in micro RNA-based cancer diagnostics and therapeutics 2008
20.MARTIN M F;MICHAEL J G miR-122 targeting with LNA/2-O-methyl oligonucleotide mixmers,peptide nucleic acids and PNA-peptide conjugates 2008
21.KLOOSTERMAN W P;PLASTEK R H The diverse functions of microRNAs in animal development and disease[外文期刊] 2006(04)
22.CALIN G A;CROCE C M MicroRNA signatures in human cancers[外文期刊] 2006
23.GRIMM D;KAY M A RNAi and gene therapy:a mutual attraction 2007(01)
24.CHRISTIAN W;SHUANPING S;NARAYANANNAIR K J Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs 2007
25.UPRICHARD S L;BOYD B;ALTHAGE A Clearance of hepatitis B virus from the liver of transgenic mice by short hairpin RNAs 2005
26.MICAELA S;LETIZIA V;KARIN B Lentivirus-mediated arftagomir expression for specific inhibition of miRNA function 2007(22)
27.IRENE M P;CHENG G F;WIELAND S Interferon modulation of cellular microRNAs as an antiviral mechanism 2007
28.RAPER S E;CHIRMULE N;LEE F S Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ormithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gens transfer 2003
29.DAPIC V;BATES P J;TRENT J O Antiproliferative activity of Gquartet-forming oligonucleotides with backbone and sugar modifications[外文期刊] 2002(11)
30.KUTAY H;BAI S;DATTA J Downregutation of miR-122 in the rodent and human hepatocellular carcinomas[外文期刊] 2006(03) 1.龚阳敏.高宏细菌染色体编码的反义RNA调节系统[期刊论文]-安徽农业科学 2011(35)
本文链接：/Periodical_ahnykx201124010.aspx。