反胶束体系中的酶催化反应

反胶束体系中的酶催化反应1曾家豫，唐功，周兴辉，高亚娟西北师范大学生命科学学院，兰州（730070）E-mail: sdeztg@摘要：反胶束是新的酶催化反应的介质工程，酶在反胶束体系中的性质与在水溶液中相比有较大区别。

本文综述了含酶反胶束体系的制备、反胶束体系中影响酶催化化学反应的因素，以及在反胶束体系中酶的活性及动力学特性，介绍了反胶束体系下酶催化反应的优点及应用，并展望了其发展前景。

关键词：反胶束，酶催化反应，介质工程传统的酶学实验都是在生物体外的水溶液介质中进行的，而酶起作用却发生在生物体特定的微环境中。

介质工程(medium engineering)反胶束为生物催化过程提供理想的溶剂体系，能保持或提高生物催化剂的活性和稳定性。

自1974年Wells[1]发现磷酸酯酶A2在卵磷脂/乙醚/水反胶束体系中具有卵磷脂水解活性以来，国外有二十多个实验室50 多种酶在反胶束中的酶学性质进行了广泛而深入的研究[2、3、4]，由此促进了一个新的研究领域-----胶束酶学(micellar enzymology) 的兴起。

分散在有机相中的含酶水滴作为微型反应器(microreactor) 的概念已普遍为人们所接受。

胶束酶学研究的权威Martinek[5]预言：反胶束体系有可能成为生物转化的通用介质。

酶催化的介质工程的研究经历了从水→有机溶剂→反胶束(reversemicelles)的过程。

在水/有机溶剂两相体系和微水有机溶剂单相体系中，仅有少数酶能够保持催化活性。

由于反胶束体系能够较好地模拟酶的天然环境，因而在反胶束体系中, 大多数酶能够保持催化活性和稳定性，甚至表现出“超活性”(superactivity)[6、7]。

本文综述了酶催化反应在介质工程反胶束体系中的研究。

1 反胶束体系研究1.1 反胶束体系概述反胶束是表面活性剂分子在非极性溶剂中自发形成的纳米级的油包水胶体分散系，反胶束体系中，表面活性剂分子在界面上定向排列，碳氢链伸向有机相，极性头或荷电头部及抗衡离子则向内排列，形成极性核[8]。

在反胶束体系内部，水可溶解到极性核中形成一个纳米级“水池”（Water pool）[9]，该“水池”可增溶水和酶等极性物质。

水含量Wo（Wo为反胶束体系中水和表面活性剂S的物质的量之比即Wo=[H2O]/[S]）它影响反胶束的大小、结构和酶活性。

反胶束内部独特“水池”的存在使得其内部环境接近于细胞内环境。

这样，包埋于反胶束中的酶不仅避免了与周围有机溶剂直接接触而可能导致的失活，而且为高度分散的反胶束提供了巨大的相界面，使得通过反胶束内外间的传质阻力变的很小。

1.2 反胶束体系的制备反胶束体系具有三种溶解环境：连续有机相、胶束界面、胶束水池。

有机溶剂参与的酶反应常应用于该体系，酶增溶于反胶束体系的方法主要有：（1）注入法这是将含有酶的缓冲液注入到表面活性剂有机溶剂中，然后搅拌至形成透明溶液即反胶束酶体系，这是一种常用的方法，该方法可很好的控制反胶束的水含量（Wo）。

1本课题得到基金项目：甘肃省教育厅科研项目（0601-28，0501B-16）的资助。

（2）液体萃取法这是酶从主体水溶液中转移到含有表面活性剂反胶束溶液中而形成反胶束酶体系的另一种方法，一般情况下，该方法制得反胶束酶的浓度较高。

（3）固体萃取法它是将反胶束溶液和固体酶直接混合搅拌，使酶进入反胶束体系的一种方法。

该方法使酶失活严重，一般很少使用。

1.3 反胶束体系中酶催化的影响因素（1）反胶束体系中水含量（Wo）对酶催化活性的影响反胶束水池中的水不同于溶液中的水，包括自由水和结合水。

文献研究表明每一种酶都有一个最适Wo值，酶活力与Wo的关系一般符合钟罩形曲线[10]。

当Wo很小时，大部分的酶分子不能增溶于反胶束内核，而直接暴露于有机溶剂中失活；在Wo相对较低时，酶的活力也相对较低，可能是由于不能满足酶分子周围需要的一层必须水，而影响了酶活化构象的形成；当Wo较大时，酶活力随Wo增加而下降，可能是由于反胶束内部水含量的增加，引起酶流动性的增大，导致酶活化构象的破坏，同时Wo太大时，底物浓度下降，也使酶活力降低的因素之一。

（2）反胶束体系中pH值对酶催化行为的影响酶催化反应对微环境中的pH值非常敏感，最佳pH值的选择与酶的种类、反应的类型有关。

大多数酶在反胶束体系中的活性随pH值的变化呈“钟罩形”曲线关系[11、12]，即有一最佳pH值，此时酶表观活性最大，这与水溶液中情况类似。

例如在AOT/异辛烷反胶束体系中，脂肪酶（PCL）催化三油酸甘油酯的水解时[13]，使用pH值范围（4.0-9.0）不同的缓冲液（乙酸盐pH=4.0-4.5，磷酸盐pH=6.0-8.0和Tris-HCL pH=8.0-9.0），测得酶活力与也呈钟罩形曲线。

在pH=8.0时，酶的活力最大，此值与PCL在水溶液中的活力基本一致。

（3）温度对酶在反胶束体系中催化活性的影响在反胶束体系中温度对于酶催化反应的影响与有机介质体系中的规律一样[14]，即在一定温度范围内反应速率随温度的升高而加快。

但当温度升高到一定限度时，酶催化反应速率不仅不再加快反而随温度的升高而下降。

在一定条件下，每一种酶在某一温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度。

不过，有一点应注意的是温度与反胶束体系的相行为有关。

高温和高离子浓度将导致电泳，从而导致电导率的变化进而导致反胶束中双连续相的形成。

1.4 反胶束酶体系活性反胶束中, 酶活性与Wo的关系有四种情况(图1)[15]：（1）饱和型酶为了达到最大活性，要求胶束中有自由水(free water)存在, 较高的Wo对酶活无影响；（2）钟罩型对应于酶的最高活性, 有一个最佳含水量, 此时胶束中水池的直径与酶的尺寸相当；（3）渐减型酶活性随Wo增大逐渐降低, 低Wo下酶活性较高；（4）超活性效应型 某些酶在反胶束中的Kcat比在水中大得多，即所谓超活性效应。

Martinek[16]认为在水中, 酶结构的波动(fluctuation) 扰动了催化构象。

而在反胶束中, 表面活性剂壳层的刚性缓冲了这种波动, 使酶分子的刚性增加, 从而使酶表现出超活性。

1.5 反胶束酶体系动力学特性目前关于反胶束体系中酶促反应的动力学模型主要有扩散模型和非扩散模型。

扩散模型中以Verhaert 等[17]提出的理论最为完整。

他们认为，由于底物浓度远大于酶浓度，底物与酶促反应产物均存在着不含酶分子与含有酶分子的反胶束微粒间的传送的问题，即扩散问题，这是维持酶催化反应所必需的，而且扩散步骤是限速步骤。

因此, 该模型的核心是研究扩散步骤是如何影响酶催化反应的。

如果假定酶分子是位于反胶束微粒中央,反应发生在酶分子表面, 且酶分子、底物与反应产物分子及反胶束微粒均被视为刚性分子,利用该模型, 可求得底物与反应产物的扩散常数。

近几年，非扩散模型更为流行。

研究表明，反胶束体系处于不停的运动状态，反胶束微粒之间的碰撞频率为每秒109～1011次，而且反胶束微粒中的增溶物在频繁地进行着交换，亲水性底物分子的交换速率为每秒106～108 mol[18]，即每1000～10000次碰撞能引起一次增溶物的交换，对于亲油性底物分子，交换速率还要大得多。

已远大于酶催化反应速率，因此，在非扩散模型中，认为扩散问题不是影响酶催化反应速率的主要因素，有时可以忽略。

非扩散模型可对反胶束体系中酶催化反应的一些特殊现象，例如超活性，kcat的钟罩型曲线等作出合理解释[19]。

2 反胶束体系下酶催化反应的优点反胶束介质由于其独特的结构，同时融合了水相和有机介质的优势，因此在酶催化反应中作为微反应器得到了广泛的应用。

概括起来，反胶束作为酶催化反应的介质具有以下优点：（1）反胶束内部独特“水池”的存在使得其内部环境可能比水溶液更接近于天然细胞内环境，酶能够比较容易溶入微小的水环境中，能较长时间保持活性，甚至表现出“超活力”。

（2）良好的物理化学性质。

反胶束是热力学稳定、光学透明且化学性质稳定的体系，大多数应用于水溶液的结构光谱学研究手段均可使用于反胶束体系，如吸附色谱、荧光色谱、核磁共振等。

（3）稳定的微环境。

当表面活性剂、水及有机溶剂三相比例不变时，每个反胶束微乳液微粒的大小、组成、结构相似，而且在宏观上可视为不变，因而能保持反胶束“水池”的稳定性。

（4）反胶束有非常高的界面积/体积比，远高于有机溶剂/水两相体系，使底物和产物的相转移变的极为有利。

（5）增加了非极性底物的溶解度，有利于高浓度底物的连续生物转化，产物很容易从低沸点溶剂中分离出来，并且有可能选择适当的废水介质体系来控制酶反应的底物专一性、立体专一性和基团专一性。

（6）酶的催化反应机理与水溶液中的近似，米氏动力学基本适用。

（7）产物回收可通过相变调节来实现，降低分离能耗。

（8）减少有水引起的副反应。

3 反胶束体系下酶催化反应的应用近30年来, 胶束酶学主要侧重于基础研究, 现已开始从基础研究过渡到应用研究。

反胶束体系下的酶催化反应的应用主要包括以下几个方面：3.1 脂肪酶催化的反应利用脂肪酶的区域选择性和立体选择性可以合成精细化学品和拆分手性药物。

如在AOT 反胶束中, Candida rugosa 脂肪酶催化合成在食品、化妆品中具有多种用途的多羟基羧酸酯[20]。

Psencillin Simp lissimum 脂肪酶催化酯化拆分外消旋薄荷醇。

在最优条件下(-)-薄荷醇的酯化速度比(+)-异构体快6～8倍, 产率为75% [21]。

Candida cylindracea 脂肪酶(CCL) 拆分非甾体抗炎药萘普生[22]和布洛芬[23]的对映选择性高于水/异辛烷两相体系。

Zamarro等[24]报道了采用AOT反胶束体系从小麦麦秆水解培养基中分离纤维素分解酶, 得到了很好的效果。

3.2 肽和氨基酸的合成反胶束作为酶催化合成肽介质的一个显著优点是能够溶解非极性和极性底物。

Serralbeiro[25]在TTAB/戊烷/辛醇反胶束体系中, 以α-糜蛋白酶作为催化剂成功地合成了二肽AcPheleuNH2，并设计了一个膜反应器用于产物分离。

Eggers[26]以Brij/A liguat336/环己醇为反胶束体系, 吲哚和丝氨酸为底物, 色氨酸酶为催化剂, 在膜反应器中合成了色氨酸。

Gill[27]等人选取了一些满足丝氨酸酶、色氨酸酶、金属蛋白酶等酶特异性要求的底物进行实验，结果发现枯草杆菌蛋白酶（Subilisin）、α-胰凝乳蛋白酶（α-Chymotrypsin）、嗜热菌蛋白酶（Thermolysin）、链霉蛋白酶E（Pronase E）、蛋白激酶K（Proteinase K）、木瓜蛋白酶（Papain）都可催化模型二肽的合成，总的产率相近；Bjorup[28]等用α-胰凝乳蛋白酶催化Ala-NH2和Acety-Phe-Oet 的合成；Kuhl、Halling[29、30]等用嗜热菌蛋白酶催化合成Leu-NH2和Z-Phe/Z-Gln。