α-淀粉酶活性的测定呢
α–淀粉酶活力测定[辅导]
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α–淀粉酶活力测定----目视碘比色法一实验目的1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。
2．掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。
二、实验原理比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。
常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯比尔定律 (A＝kLC)为基础。
酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（active unit）表示。
1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min。
这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。
淀粉（紫蓝色，30分子以上）红色糊精（红棕色，7-30分子）无色糊精（7分子以下）、麦芽糖不显色。
通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以标准糊精（红色糊精）和碘反应的颜色作为终点指示（所给定的淀粉都已转化为糊精的时间）。
碘比色法酶活力规定：在60℃条件下，1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。
三、实验操作1．取试管1支，加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。
2．取锥形瓶一个，加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。
3．将锥形瓶置于60℃水浴中，保温5分钟。
4．在比色盘中加入比色碘液，每穴2滴。
5．在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml，摇匀，开始计时。
6．在反应的前4分钟，每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体，与比色稀碘液混合，而后，每隔30秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合，直至呈色与终点色一致。
四、酶活性计算实验注意事项：（1）测定酶促反应在锥形瓶中进行，标准反应在试管中进行。
（2）比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。
（3）应时间大约在10-15分钟。
可见分光光度法测定α-淀粉酶活力
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化 学 与 生 物 工 程 ２０２０,Vol．３７No．０３ www．
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张雪娇,田欢,刘春叶,等 ．可见分光光度法测定 α
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实验一 α-淀粉酶活力的测定
颜色变化终点要照像，并多媒体型实验结果 单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果 直接写入在实验报告书里。
[实验报告书书写要求]
1. 实验报告书的编写要参考教师提出的写作格式规范。 2. 即：题目、作者（包括同组成员）、单位（班级和组别）、
酶活力单位（g/ml）=(60/T×20×2%×N)÷0.5
60 —酶活定义中反应时间为60min； T —反应时间（min）； 20 —可溶性淀粉的毫升数； 2% —可溶性淀粉浓度； N —酶液稀释倍数； 0.5 —测定时所用的稀酶液量（ml）。
表 1 α-淀粉酶活力测定结果
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[实验结果处理要求]
酶活力单位gml60t202n05实验结果计算实验结果计算重复数反应时间min酶活力gmlmin要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或颜色变化终点要照像并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里
实验一 α-淀粉酶活力的测定
[实验性质] 验证性实验 [实验学时] 2学时 [实验目的] (1) 掌握淀粉酶糖化淀粉的原理；
[实验步骤]
第一步：待测酶液的配制； 第二步：标准色的配制； 第三步：样品的酶解反应； 第四步：计算。
1. 待测酶液的制备
α-淀粉酶
1.000 g
①
50 mL
2. 标准色的配制
150mL
60℃,30 min
250 mL
③可溶性淀粉 2.0g
酶液
2%淀粉液
A液
②
B液
8.0 mL 1.0 mL
3. 样品测定步骤
中文摘要、中文关键词、英文摘要、英文关键词、前言、材 料与方法、结果与讨论、结论、参考文献等顺序。 2. 报告书的篇幅要求2000字以上。 3. 参考文献必须5篇以上，并至少有一篇英文。 4. 提交时间限为每周一 下午3点。先交到课代表，由课代表汇 总之后按时送到任课老师办公室。 5. 领取的报告书要妥善保管，期末考试时作参考。
二、α-淀粉酶活力的测定2010(精)
根据吸光度表C1，查得所测酶液的酶活力
5.1.3 计算酶活力
X=c×n
其中：X—样品的酶活力，单位为u/g c—测试酶液的酶活力，单位为u/g n—样品的稀释倍数
5.3 注意事项
✓ 酶反应时间应准确计算。 ✓ 试剂加入按规定顺序进行。
6.实验报告
✓ 记时器
每组 1台
3.2 器材（每组）
✓ 15ml大试管10支 ✓ 5ml移液管10支 ✓ 1ml移液管5支 ✓ 10ml移液管10支 ✓ 比色皿1套（4个） ✓ 双蒸水1瓶（50ml） ✓ 洗瓶1个 ✓ 玻璃平皿1套 ✓ 50ml小广口瓶（棕色）2个 ✓ 50ml 容量瓶 1个 ✓ 100ml 容量瓶 1个 ✓ 500ml 试剂瓶2个 ✓ 100ml 试剂瓶2个 ✓ 250ml 三角瓶2个 ✓ 200ml烧杯2个 ✓ 500ml烧杯1个 ✓ 记号笔1支、吸耳球、称量纸、药勺、试管架、
生物技术专业系统实验（四）
——酶（蛋白质）工程实验II
二、α-淀粉酶活力的测定
--国家标准GB 8275-2009
1.目的意义 2.实验原理 3.试剂和溶液 4.仪器和器材 5.实验方法 6.实验报告 7.思考题
1.目的意义
➢ 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6糖 苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的 主要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。
➢ 例如，生产葡萄糖需要葡萄糖淀粉酶，但 仅有葡萄糖淀粉酶作用，不能液化淀粉溶 液，葡萄糖的生成速度非常慢。此时，α淀粉酶的使用就成为必要条件。
➢ α-淀粉酶的活性测定，在理论 研究和实际应用中具有重要的 意义。
➢ 通过本实验，学习一种测定α淀粉酶酶活力的方法，巩固并 熟练分光光度计的使用方法。
α-淀粉酶测定的操作规程
α-淀粉酶测定的操作规程1、用途：测定人血清中或尿液中α-淀粉酶的酶活浓度。
2、原理：α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶偶联，水解特异性底物4,6-亚乙基-4-硝基苯酚-α-庚糖，产生对-硝基苯酚，对-硝基苯酚生成速率与α-淀粉酶的活性成正比，在405nm波长下用速率法检测。
3、适用仪器：奥林巴斯AU480型全自动生化分析仪.4、样本要求：4.1、样本种类：新鲜无溶血血清或尿液。
4.2、样本采集：常规静脉采血约2ml，不抗凝。
置普通管中，或采用含有分离胶的真空采血管。
尿液保存时应将pH值调节至7.0。
4.3、样本干扰：对反映吸光度有干扰的样本，包括溶血和浑浊的样本都可能影响检测结果遇上述情况建议重新采集标本。
4.4、样本保存：血清样本2℃—8℃可稳定7天，-20℃可保存一个月，忌反复冻融。
尿液样本2℃—8℃可稳定10天.5、检测方法：5.1、试剂的准备：试剂开瓶即可使用。
5.2、检测步骤：2、动生化分析仪操作步骤：参数设置→试剂装载→校准→质控→样品加载→测定→结果审核→报告。
5.3、校准：用K因素进行试剂空白校准，也可使用Diazyme公司校准品进行校准操作，当试剂更换批号、出现质控漂移、仪器做完保养后及重要零件更换时，须重新校准。
5.4、结果计算：全自动生化分析仪会自动给出检测结果。
3、6、参考范围：(各医院应根据本地区实际情况建立自己的参考范围。
）7、注意事项：7.1、试剂具有一定的酸碱性，避免直接接触皮肤和眼睛，切勿吞咽。
7.2、使用后的器具应按照规定处理，扔入指定的垃圾箱内，不可随处乱扔，防止环境污染和二次使用。
7.3、由于运输过程产生渗液或漏夜的产品，或在运输贮存中没有按照说明书要求进行维护的试剂，不可使用。
7.4、试剂只用于体外诊断。
8、参考文献：中华人民共和国卫生部医政司，全国临床检验操作规程（第三版），东南大学出版社，2006。
王惠萱、李雪梅、王冈，临床检验操作手册，云南科技出版社，2008.陆永绥、李清华、张伟民主编，临床检验自动化仪器分析标准操作规程，浙江大学出版社，2006.。
α-淀粉酶amy检测原理麦芽庚糖苷法
α-淀粉酶amy检测原理麦芽庚糖苷法α-淀粉酶是一种能够分解淀粉为较小的糖分子的酶类。
它是一种广泛存在于生物体中的酶，包括人类、动物和植物。
淀粉是由α-葡聚糖链构成的多糖，而α-淀粉酶能够通过水解反应将淀粉分子切割成糊精（dextrin）和葡萄糖单糖。
麦芽庚糖苷法是一种常用的测定α-淀粉酶活性的方法。
该方法的原理是利用α-淀粉酶将庚糖苷（G7）中的庚糖分子逐个水解成葡萄糖分子，并且测定庚糖苷水解的速率来间接测定α-淀粉酶的活性。
具体的操作步骤如下：首先，准备一定浓度的庚糖苷溶液作为底物。
然后，在一定温度和pH条件下，将α-淀粉酶加入到庚糖苷溶液中，使其开始催化反应。
随着时间的推移，庚糖苷逐渐被水解成葡萄糖，反应体系中葡萄糖的浓度逐渐增加。
最后，通过测定葡萄糖浓度的变化，可以计算出α-淀粉酶的活性。
麦芽庚糖苷法具有以下优点：首先，该方法操作简单，不需要复杂的仪器设备，只需要常见的化学试剂即可。
其次，该方法对α-淀粉酶具有较高的灵敏度和特异性，可以准确地测定α-淀粉酶的活性。
此外，该方法还可以用于测定不同来源的α-淀粉酶的活性差异。
麦芽庚糖苷法在许多领域都有广泛的应用。
首先，在食品工业中，该方法可以用于测定食品中的淀粉含量和淀粉降解的速率，从而评估食品的品质和保存性。
其次，在生物制药工业中，该方法可以用于监测发酵过程中淀粉酶的活性，以确保产品的质量和产量。
此外，该方法还可以用于医学研究中，例如测定血液或尿液中α-淀粉酶的活性，以辅助诊断某些疾病。
α-淀粉酶检测原理麦芽庚糖苷法是一种简单可靠的方法，广泛应用于食品工业、生物制药工业和医学研究等领域。
通过测定庚糖苷的水解速率来间接测定α-淀粉酶的活性，该方法具有操作简单、灵敏度高和特异性强的特点，为相关领域的研究和应用提供了有力的工具。
测定α淀粉酶活性
测定α-淀粉酶活性的两种方法的比较研究发布时间：2009-09-27来源：生物网文章标签：α-淀粉酶酶活性生物论坛2009-2012年中国α-淀粉酶市场调研及投细菌α-淀粉酶产生菌种筛选α-淀粉酶的活性测定及比活计算摘要α－淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标，为此提出了对小麦α－淀粉酶活性的快速测定方法的研究。
α－淀粉酶活性的测定方法有多种，本文仅探讨了常用的3.5－二硝基水杨酸法和凝胶扩散法。
结果表明，两种方法的测定结果差异不显著，而且两者呈显著正相关；从变异系数上看，后者的变异程度较低，其精度较高；从误差来源上看，前者引起误差的因素较后者多；后者较为简便快速，准确度较高，重复性较好，可用于大批量样品的分析。
关键词小麦α－淀粉酶活性 3.5－二硝基水杨酸法凝胶扩散法１材料和方法1.1 材料和试剂①萌芽的小麦取当年小麦种子，按小麦萌发试验培养，２天后用于测验。
②１％淀粉溶液。
③ 0.40ＮＮａＯＨ。
④ＰＨ5.60的柠檬酸缓冲液Ａ．称取柠檬酸20.01ｇ，溶解后稀释至１Ｌ；Ｂ．称取柠檬酸钠29.41ｇ，溶解后稀释至１Ｌ。
取Ａ液13.70ｍｌ与Ｂ液26.30ｍｌ混匀，即为ｐＨ5.60的缓冲液。
⑤3.5－二硝基水杨酸精确称取3.5－二硝基水杨酸１ｇ溶于２０ｍｌ１ＮａＯＨ中，加入５０ｍｌ蒸馏水，再加入３０ｇ酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至１００ｍｌ，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。
⑥麦芽糖标准液称取麦芽糖0.10ｇ溶于少量蒸馏水中，仔细移入100ｍｌ容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。
⑦α－淀粉酶提取缓冲液２０ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸钠（2.7216ｇ／Ｌ） １ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钙（0.11099ｇ／Ｌ） ｐＨ5.5。
⑧５％（Ｖ／Ｖ）碘—碘化钾溶液 1.95ｇＫＩ＋0.65ｇＩ２溶解在100ｍｌ蒸馏水中。
⑨α－淀粉酶36.18ｕ／ｍｇ Ｓｉｇｍａ公司逐级稀释10, 2.50，0.625,0.15625, 0.03906,0.009765ｍｇ／ｍＬ系列标准液。
血清α-淀粉酶活性的测定(迈克)
三、参考值： 参考值：
血清：60~180U苏氏单位 血清：60~180U苏氏单位 尿液：100 1200U苏氏单位 尿液：100 ~ 1200U苏氏单位
四、临床意义： 临床意义：
淀粉酶主要由胰腺和唾液腺分泌，肺、 肝、甲状腺、脂肪等组织亦含有此酶。血 清淀粉酶测定主要用于急性胰腺炎的诊断。 一般于发病后6~12h开始升高，12~24h达 一般于发病后6~12h开始升高，12~24h达 峰值，2~5d恢复正常，因此血清淀粉酶活 峰值，2~5d恢复正常，因此血清淀粉酶活 性显著升高对急性胰腺炎的早期诊断价值 较大。淀粉酶可通过肾小球滤过，尿淀粉 酶于发病后12~24h开始升高，持续时间长， 酶于发病后12~24h开始升高，持续时间长， 下降比血清淀粉酶慢，故胰腺炎后期测尿 淀粉酶更有价值。
2、计算： 计算：
注：淀粉浓度 0.4g/L 样品AMY活力（苏氏单位）= 样品AMY活力（苏氏单位）=
AB AU 0.4 15 100 × × × AB 5 7.5 0.02
AB AU 样品AMY活力（苏氏单位)= 样品AMY活力（苏氏单位)= × 800 AB
注解
①0.4——淀粉浓度 0.4——淀粉浓度 ②5.0—— 1单位定义消耗淀粉mg数 5.0—— 单位定义消耗淀粉mg数 ③15 —— 1单位定义反应时间 ④7.5 —— 酶的实际作用时间 ⑤100—— 1单位定义用血清 100—— ⑥0.02—— 样品取量 0.02——
血清α 淀粉酶（AMS或AMY） 血清α-淀粉酶（AMS或AMY）活性 的测定 Reagent for α- Amylase Test α一、原理 二、测定方法 三、参考值 四、临床意义 五、注意事项 六、方法学评价
一、原理： 原理：ห้องสมุดไป่ตู้
α-淀粉酶活力的测定-实验指导书
实验一α－淀粉酶活力的测定一、实验目的通过本实验，使学生掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理、方法和操作技能。
二、实验原理α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。
三、实验试剂和仪器（一）试剂1. 原碘液称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。
2. 稀碘液吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。
3. 20g／L可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉（以绝干计）2 000g．精确至0.001g，用水调成浆状物．在搅动下缓缓倾入70m L沸水中。
然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100m L。
此溶液需要当天配制。
注：采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的可溶性淀粉。
4. 磷酸缓冲液（pH6.0）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解并定容至1 000mL。
配好后用pH计校正。
（二）仪器1. 分光光度计应符合GB9721的有关规定2. 秒表3. 恒温水浴（60±0.2）℃4. 试管25mm×2000mm四、实验步骤1. 待测酶液的制备称取酶粉l-2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶100mL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7-5.6IU／mL范围内），摇匀。
α-淀粉酶活力的测定
α-淀粉酶活力的测定α-淀粉酶活力的测定姓名___学号___ 一、实验目的:1. 掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理及其实验方法。
二、实验原理: α-淀粉酶- 是一种内切酶- 只能水解α-1, 4糖苷键- 不能水解α-1,6糖苷键- 不能水解α-1,6糖苷键附近的α-1,4糖苷键- 产物为糊精、低聚糖、麦芽糖和少量葡萄糖α-淀粉酶活力测定的方法1(反应底物: 可溶性淀粉2(反应环境: 60?，pH为6.0，常压。
3(产物: 还原性葡萄糖4(活力测定方法:1)测定还原糖产生速度2)测定淀粉遇碘显色力下降的速度3)测底物粘度下降的进度• 还原糖与黄色的 3,5- 二硝基水杨酸显色反应来测定.• 生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比.• 以每克酶在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小.三、试剂与仪器:1、仪器(1)电子天平(2)容量瓶 100mL(3)试管(4)恒温水浴锅(5)紫外可见分光光度计(6)烧杯 250 mL2(试剂(1)1% 可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉(以绝干计)1. 000g(精确至0.001g，用水调成浆状物(在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。
然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。
此溶液需要当天配制。
(2)0.4mol/L 氢氧化钠: 称取 1.6g 氢氧化钠，溶于少量蒸馏水，定容至100 mL.1(3)磷酸缓冲液(pH6.0): 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)45.23g、柠檬酸(C6H8O7?H2O)8.07g，用水溶解并定容至1000mL。
配好后用pH计校正。
(4)3,5- 二硝基水杨酸:精确称取 1g 3,5- 二硝基水杨酸溶于 20mL 1mol/L 氢氧化钠中,加入 50mL 蒸馏水,再加入 30g 酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水稀释至100mL ,盖紧瓶塞,防止CO2进入.(5)麦芽糖标准液(1mg/ml):称取0.100g麦芽糖,溶于少量蒸馏水,定容至100mL .(6)α-淀粉酶:枯草芽孢杆菌生成，最适pH 5.5-7.5,最适温度 50~70? 四、测定步骤:1. 麦芽糖标准曲线的制作:取25ml刻度试管7支,编号.分别加入麦芽糖标准液(lmg/ml) 0, 0.2, 0.6, 1.0,1.4, 1.8,2.0 ml ,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达 2.0ml ,再各加 3 , 5 -二硝基水杨酸试剂2.0m1 ,置沸水浴中加热5min .取出冷却,用蒸馏水稀释至25 m1 .混匀后用分光光度计在520 nm 波长下进行比色,记录吸光度.以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量(mg)为横坐标,绘制标准曲线.2. 待测酶液的制备:称取酶粉0.1g，精确至0.0002g，先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至100mL，摇匀。
实验一α-淀粉酶活力的测定
结果处理与计算
数据处理
根据实验数据，我们计算了酶活力、 反应速率等参数。
图表绘制
我们使用图表展示了实验结果，以便 更直观地分析数据。
结果分析
酶活力比较
通过比较不同浓度酶液的酶活力，我们可以得出酶活力与酶浓度 之间的关系。
反应速率分析
通过分析反应速率，我们可以了解酶促反应的动力学特征。
结论总结
综合以上分析，我们可以得出实验一α-淀粉酶活力测定的结论， 并为其应用提供依据。
用紫外可见分光光度计在540nm波长处测定各管 的吸光度值。
数据记录与处理
01
记录实验数据，计算α-淀粉酶活力。
02
根据实验数据绘制标准曲线和酶 活性曲线。
04
结果分析
数据记录
实验数据
在实验过程中，我们记录了不同浓度 酶液处理后的反应时间、温度、pH值 等数据。
实验误差
在实验过程中，我们尽量减小误差， 如使用精确的测量工具、多次测量取 平均值等。
05
实验总结与讨论
实验总结
01
实验原理
本实验通过测定α-淀粉酶催化淀粉水解生成可溶性糖的速率，从而确定
酶活力的大小。
02 03
实验步骤
准确称取适量淀粉和底物溶液，加入试管中，加入适量酶液，在适宜温 度下恒温水浴一定时间，然后加入碘液和氢氧化钠溶液终止反应，最后 用斐林试剂进行滴定。
实验结果
通过滴定结果计算出α-淀粉酶活力的大小。
DNS溶液
称取3，5-二硝基水杨酸6.3g，溶解于50mL蒸馏水中，加入2mol/L氢氧化钠溶液 16.8mL，再加入20%酒石酸钾钠溶液10mL和2mol/L硫酸溶液20mL，混合均匀后 加热至80℃，不断搅拌，直至溶液呈透明。冷却后用蒸馏水定容至100mL，避光保 存。
α、β-淀粉酶活性测定
α、β-淀粉酶活性测定
一、样品提取
3-5克样品→加0.1M/L 柠檬酸缓冲液(pH5.6)5ml+少量石英砂研磨至匀浆→加5ml 缓冲液清洗研钵→倒入10ml 具塞刻度试管→室温放置15-20min ，不断振荡→3500rpm 离心10min →上清液(酶提取液)备用
二、酶活性测定
α-淀粉酶活性测定 测定管 对照管 1.0ml 酶液 70℃水浴15min 1.0ml 柠檬酸缓冲液 4.0ml 0.4M NaOH 40℃水浴15min 2.0ml 1.0%淀粉，混匀 40℃水浴15min
加4.0ml 0.4M NaOH
各吸2ml 放入20ml 试管
加2ml DNS ，混匀
沸水浴5min
冷却，定容
测OD 520
三、标准曲线的制作
取20ml 的刻度试管6支并编号，分别加入麦芽糖标准液(1mg/ml ，称取0.10g 麦芽糖定容至100ml)0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml ，然后加水使都达到2ml ，再各加入DNS 2.0ml ，置沸水浴中煮沸5min ，冷却后用水稀释至20ml 。
在520nm 处测其消光值。
消光值为纵坐
(α+β)-淀粉酶总量测定
测定管 对照管
0.5ml 酶稀释液
1.5ml 柠檬酸缓冲液
4.0ml 0.4M NaOH
40℃水浴15min
2.0ml 1.0%淀粉，混匀
40℃水浴15min
标，麦芽糖为横坐标作标准曲线。
α-淀粉酶酶活力测定实验(碘比色法)
pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：
0.2mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液： 称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O） 45.3g，柠檬酸（C6H8O7.H2O）7.74g，先 在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定 容至1000ml。
2%可溶淀粉溶液及标准糊精溶液配制
2%可溶淀粉溶液：称取20g可溶淀粉，放入 小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后 在搅拌下注入沸腾的700mL蒸馏水中，继续 煮沸一分钟（透明），冷却后用pH6磷酸氢 二钠-柠檬酸缓冲液定容至1000ml。 标准糊精溶液：取0.06克化学纯糊精悬于少 量水中调匀，然后倾入90毫升正在煮沸腾的 蒸馏水中，冷却后定容至100毫升，滴加数 滴甲苯（现配现用就不用加），冰箱保存。
酶活力测定的定义 （碘比色法——目视）
酶活力定义：在60℃下1小时内将1克淀粉转化为糊 精的酶量称一个酶活力单位（5~10分钟反应完成）。 计算公式：
60 48 N 酶活力单位 20 2% N 0.5 ( / mL) t t
ｔ——为反应达到终点需要的时间（分钟），要求反应时间在5~10内完成
标准终点色溶液
1、第一种标准终点色溶液 取1mL标准糊精液和3mL标准稀碘液混合。 2、第二种标准终点色溶液 A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O） 40.2493g和重铬酸钾（K2CrO7）0.4878g， 用蒸馏水定容至500ml。 B液：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容 至100ml。 同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱 中待用。混合液在15天内使用有效。
相关碘液的配制
碘原液：称取碘11g，碘化钾22g，置于小烧 杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容 量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次， 洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至500ml。 摇均后放于棕色瓶中备用。 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g， 再用蒸馏水定容至500ml。摇均后放于棕色 瓶中备用（时间不易太长？）。 标准比色碘液：取碘原液15毫升，加碘化钾 8克，用蒸馏水定容至500毫升。储藏于棕色 瓶内。
天然产物化学实验之α-淀粉酶的活性测定及比活计算
天然产物化学实验之α-淀粉酶的活性测定及比活计算1实验目的略2 试剂及设备3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)；葡萄糖标准液(10mg/ml)；福林试剂；淀粉溶液(10mg/ml)；磷酸盐缓冲液(pH6.0，0.02mol/L)。
722 型(或721 型)分光光度计；4 000r/min 的离心机；分析天平。
3 原理与方法3.1 Folin-酚试剂测定蛋白含量Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin 试剂)还原，产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。
此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5～100μg 蛋白质。
Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。
此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
3.2 淀粉酶活性测定淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。
淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。
淀粉酶主要包括α-55淀粉酶和β-淀粉酶两种。
α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。
β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。
淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应式如下：3,5-二硝基水杨酸3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色)淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。
用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。
α-淀粉酶活力的测定
α-淀粉酶活力的测定α-淀粉酶活力的测定姓名___学号___ 一、实验目的:1. 掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理及其实验方法。
二、实验原理: α-淀粉酶- 是一种内切酶- 只能水解α-1, 4糖苷键- 不能水解α-1,6糖苷键- 不能水解α-1,6糖苷键附近的α-1,4糖苷键- 产物为糊精、低聚糖、麦芽糖和少量葡萄糖α-淀粉酶活力测定的方法1(反应底物: 可溶性淀粉2(反应环境: 60?，pH为6.0，常压。
3(产物: 还原性葡萄糖4(活力测定方法:1)测定还原糖产生速度2)测定淀粉遇碘显色力下降的速度3)测底物粘度下降的进度• 还原糖与黄色的 3,5- 二硝基水杨酸显色反应来测定.• 生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比.• 以每克酶在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小.三、试剂与仪器:1、仪器(1)电子天平(2)容量瓶 100mL(3)试管(4)恒温水浴锅(5)紫外可见分光光度计(6)烧杯 250 mL2(试剂(1)1% 可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉(以绝干计)1. 000g(精确至0.001g，用水调成浆状物(在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。
然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。
此溶液需要当天配制。
(2)0.4mol/L 氢氧化钠: 称取 1.6g 氢氧化钠，溶于少量蒸馏水，定容至100 mL.1(3)磷酸缓冲液(pH6.0): 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)45.23g、柠檬酸(C6H8O7?H2O)8.07g，用水溶解并定容至1000mL。
配好后用pH计校正。
(4)3,5- 二硝基水杨酸:精确称取 1g 3,5- 二硝基水杨酸溶于 20mL 1mol/L 氢氧化钠中,加入 50mL 蒸馏水,再加入 30g 酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水稀释至100mL ,盖紧瓶塞,防止CO2进入.(5)麦芽糖标准液(1mg/ml):称取0.100g麦芽糖,溶于少量蒸馏水,定容至100mL .(6)α-淀粉酶:枯草芽孢杆菌生成，最适pH 5.5-7.5,最适温度 50~70? 四、测定步骤:1. 麦芽糖标准曲线的制作:取25ml刻度试管7支,编号.分别加入麦芽糖标准液(lmg/ml) 0, 0.2, 0.6, 1.0,1.4, 1.8,2.0 ml ,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达 2.0ml ,再各加 3 , 5 -二硝基水杨酸试剂2.0m1 ,置沸水浴中加热5min .取出冷却,用蒸馏水稀释至25 m1 .混匀后用分光光度计在520 nm 波长下进行比色,记录吸光度.以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量(mg)为横坐标,绘制标准曲线.2. 待测酶液的制备:称取酶粉0.1g，精确至0.0002g，先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至100mL，摇匀。
实验一 α-淀粉酶活力的测定
[考核形式及方法]
1. 考核形式
现场操作、提问、报告书的评价等。
2. 考核点 （1）现场考核看操作的准确性和规范性。
（2）提问的考核点注重分析问题和解决问题的能力。
（3）报告书的考核点主要考察报告书的结构； 实验结果的准确性； 实验的创意性； 参考文献的数量和质量等。
[思考题]
1. 请说出你所选用的α-淀粉酶活力测定性实验 [实验学时] 2学时 [实验目的] (1) 掌握淀粉酶糖化淀粉的原理； (2) 掌握淀粉酶的性质及作用；
(3) 熟练α-淀粉酶活力测定方法。
[实验原理] α-淀粉酶催化淀粉水解生成小分子可溶性糊 精和少量的麦芽糖、葡萄糖，这些产物与碘 反应呈现不同的颜色。通过呈色反应，可了 解底物的降解速率，并以此可反映酶活力。
验原理。 2. 在α-淀粉酶活力测定过程中影响活力的因素有什么？在
实验过程中你采取什么措施防止其影响？
3. 举例说明在实际工作中α-淀粉酶活力测定的必要性。 4. 在实验指导书上介绍的几种α-淀粉酶活力测定方法中为 什么本实验采用Wohlgemuth改良法？它有何种优缺点？
α-淀粉酶制剂的酶学特性及其应用
名称 容量瓶
试剂瓶 移液管
大肚移液 管
规格 50 mL 100 mL 150 mL 250 mL 500 mL 1000 mL 500 mL 0.5 mL 1 mL 2 mL 5 mL 20 mL
数量
1 1 1 2 1 2 2 1 1 2 2
[试剂配制]
(1) 原碘液 称取分析纯结晶碘ll g，分析纯碘化钾22 g。先用少 量蒸馏水使碘化钾完全溶解，再溶解结晶碘，最后用蒸馏水定 容至500 mL，贮于棕色试剂瓶内暗藏。 (2) 稀碘液 取原碘液2 mL，加碘化钾20 g，加蒸馏水溶解定容 至500 mL，贮于棕色试剂瓶内暗藏。 (3) 0.02 mol/L磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲溶液(pH6.0) 称取磷 酸氢二钠45.23 g和柠檬酸8.07 g，用蒸馏水溶解定容至1000 mL，配好后应以酸度计校正pH值为6.0，置试剂瓶冷藏。 (4) 标准终点色溶液 A液：称取分析纯氯化钴12.0732 ｇ和分析纯重铬酸钾0.1463 g， 以蒸馏水溶解定容至150 mL，置250mL试剂瓶暗藏。 B液：称取络黑T 8.0000 mg，以蒸馏水溶解定容至100 mL， 置250 mL试剂瓶暗藏。
α-和β-淀粉酶活性的测定
α-和β-淀粉酶活性的测定α-淀粉酶能将淀粉分子的α-1.4糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精及少量麦芽糖和葡萄糖，使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。
β-淀粉酶是从淀粉的非还原性末段分解2个葡萄糖单位的α-1.4糖苷键生成麦芽糖。
因此可用DNS法测定溶液中还原糖的含量。
1.仪器设备分光光度计、恒温水浴等。
2.操作方法1）粗酶液制备取新鲜植物材料10g，洗净、剪碎，按1：2（w/v）比例加20ml0.1mol/L NaAc缓冲液（含6mmol/L CaCl2，pH5.0）及少量石英砂研磨，一层尼龙布过滤。
滤液在20000r/min离心20min，取上清液用10mmol/L NaAc缓冲液透析。
过夜后用20000r/min离心10min，取上清液定容，备用。
2）绘制β-极限糊精标准曲线称取100mgβ-极限糊精，加少量水调成糊状，倾入10ml沸蒸馏水，不断的搅拌、加热，煮至透明。
流水冷却后定容至10ml，即每毫升含10mgβ-极限糊精。
取25～200μlβ-极限糊精（0.25～2.0mg）加水定容至0.5ml，再加5.0ml0.01%I2-KI溶液于560nm处测定其光密度（OD）值。
以光密度为纵坐标，β-极限糊精含量为横坐标绘制β-极限糊精标准曲线。
3.α-淀粉酶活力测定（植物生理学通讯，1986，4：63）取0.1~0.5ml粗酶液（相当于含0.1～0.2g鲜重），加0.5mlβ-极限糊精，加10mmol/L NaAc缓冲液定容至1.0ml，摇匀后在30℃保温。
隔不同时间取0.1ml反应液加5.0ml0.01%的I2-KI试剂，0.4ml H2O，摇匀后在560nm处测其光密度。
按OD值查标准曲线。
计算单位为：mgβ-极限糊精降解/g（鲜重）·h。
4.β-淀粉酶活力的测定（麦芽糖浆生产工艺，上海市轻工业局科技情报研究所出版1989,171)。
1)酶反应在具塞试管中加5ml2%可溶性淀粉，1ml0.1mol/L NaAc（pH5.0）缓冲液，3.9ml H2O，在37℃预热5min，加0.1ml酶液，保温30min后煮沸10min。
α-淀粉酶活性的测定呢
1.α-淀粉酶抑制剂对PPA 活性的抑制作用
分别取浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的柚皮素溶液0.05mL
（溶于水）与0.2 mL PPA 溶液（0.33 U/mL，溶于pH 6.8 磷酸盐缓
冲液）混匀在37 ℃水浴反应20 min。
对照组溶液则以0.05 mL水与0.2
mL PPA 溶液进行反应。
在反应液中加入1mL 1 %可溶性淀粉溶液，继
续37 ℃水浴10 min 后，加入1.5 mL DNS 显色剂，混匀，置于沸水
浴中5 min。
然后，冷却至室温，定容至25 mL，540 nm 下测定吸光。
空白是1.25ml水加上1.5mlDNS，定容至25ml，在A540nm下测吸光值根
据下式计算柚皮素对PPA 活性的抑制率：抑制率（%）=[（ΔA 对照-
ΔA 样品）/ΔA 对照]×100%注：ΔA 对照=A 对照-A 对照空白，
ΔA 样品=A 样品-A 样品空白
反应液中加入 1.5mL
1 %可溶性淀粉溶液
继续37 ℃水浴10
min 后，加入 1.5
mlDNS 显色剂，混匀，置于沸水浴中5 min。
然后，冷却至室温，定
容至25 mL，540 nm 下测定吸光。
空白是1.25ml水加上1.5mlDNS，
定容至25ml，在A540nm下测吸光值
一、实验步骤：取试管5个，并分别编号，按下表加入药品
再从标准曲线中查出还原糖的含量，以1/V为纵轴，1/S为横轴做直
角坐标。
实验一 α-淀粉酶酶活的测定
α-淀粉酶制剂的外观要求
固体剂型:
白色至黄褐色固体粉末。无霉变、潮解、 结块现象，无异味。易溶于水。 液体剂型: 黄褐色至深褐色液体，无异味，允许有 少量凝聚物。
α-淀粉酶制剂的理化要求
α-淀粉酶制剂的卫生要求
酶活测定原理
α-淀粉酶制剂能将淀粉分子链中的α- 1,4-葡 萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、 少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮 紫色的特性反应逐渐消失，呈现棕红色， 其颜色消失的速度与酶活性有关，据此可 通过反应后的吸光度计算酶活力。
三、实验仪器及试剂
仪器： 分光光度计、恒温水浴锅（控温精度±0. 1℃）、移液管、试管、烧杯、容量瓶、玻 璃棒、秒表。
试剂及溶液
试剂：
碘、碘化钾、 α-淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠檬 酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有限公 司）。
溶液配制： 原碘液：称取11.0 g碘和22.0 g碘化钾，用少量水 使碘完全溶解，定容至500 mL，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液2.00 mL，加20.0 g碘化钾用 水溶解并定容至500 mL，贮存于棕色瓶中。
注:待测中温a-淀粉酶酶液酶活力控制酶浓度在3.4 u/mL~4. 5 u/mL范围内，待测耐高温淀粉酶活力控制酶浓 度在60u/mL~65u/mL范围内。
酶活力测定
吸取10.0 mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液
2.5 mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃(耐高温α-淀粉酶制剂
置于70℃±0. 2℃)恒温水浴中预热8 min；加入0.5 mL稀 释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5 min；
酶活力计算
耐高温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算: X2 = c×n×16.67 式中: X2—样品的酶活力，u/mL或u/g c—测试酶样浓度，u/mL或u/g n—样品的稀释倍数 16.67 — 根据酶活力定义计算的换算系数。 所得结果表示至整数。 允许差： 平行试验相对误差不得超过5%
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1.α-淀粉酶抑制剂对PPA 活性的抑制作用
分别取浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的柚皮素溶液0.05mL
（溶于水）与0.2 mL PPA 溶液（0.33 U/mL，溶于pH 6.8 磷酸盐缓
冲液）混匀在37 ℃水浴反应20 min。
对照组溶液则以0.05 mL水与0.2
mL PPA 溶液进行反应。
在反应液中加入1mL 1 %可溶性淀粉溶液，继
续37 ℃水浴10 min 后，加入1.5 mL DNS 显色剂，混匀，置于沸水
浴中5 min。
然后，冷却至室温，定容至25 mL，540 nm 下测定吸光。
空白是1.25ml水加上1.5mlDNS，定容至25ml，在A540nm下测吸光值根
据下式计算柚皮素对PPA 活性的抑制率：抑制率（%）=[（ΔA 对照-
ΔA 样品）/ΔA 对照]×100%注：ΔA 对照=A 对照-A 对照空白，
ΔA 样品=A 样品-A 样品空白
反应液中加入 1.5mL
1 %可溶性淀粉溶液
继续37 ℃水浴10
min 后，加入 1.5
mlDNS 显色剂，混匀，置于沸水浴中5 min。
然后，冷却至室温，定
容至25 mL，540 nm 下测定吸光。
空白是1.25ml水加上1.5mlDNS，
定容至25ml，在A540nm下测吸光值
一、实验步骤：取试管5个，并分别编号，按下表加入药品
再从标准曲线中查出还原糖的含量，以1/V为纵轴，1/S为横轴做直
角坐标。