双萤光素酶报告基因的应用-常见载体及案例简介

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双萤光素酶报告基因的应用,常见载体及案例简介双萤光素酶报告基因检测(Dual-Luciferase Reporter Assay)通常以萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)为报告基因,以海肾萤光素酶(Renilla luciferase)为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势,广泛用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。

Firefly luciferase(简称F-Luc)以萤光素(luciferin)为底物,在Mg2+、ATP和氧分子存在条件下,催化luciferin氧化成oxyluciferin,在此过程中发出最强波长在560nm 左右的生物萤光(bioluminescence)。F-Luc表达框的上游启动子区域插不同功能序列,可以通过转录起始条件造成其报告萤光的变化。在F-Luc的3’UTR区域插入待验证的靶序列,通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低,可以反映是否存在靶向互作。

Renilla luciferase(简称R-Luc)以腔肠素(coelenterazine)为底物,在氧分子存在的条件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide,此过程中发出最强波长在465nm 左右的生物萤光。R-Luc通常由固定组成型启动子驱动,在报告系统中作为校正input误差的内参信号。

生物萤光产生反应式

一、应用方向

1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体,再共转入该microRNA,如果萤光素酶活性下降,则提示为其靶序列。

2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域,检测萤光素活性。

3. 启动子结构分析。将启动子区域序列(通常2k左右)进行分段截短,或对特定位点进行突变,再分别构建入luciferase报告载体,检测其启动子活性。

4. 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性,可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。

5. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列(通常为启动子区域)插入报告基因载体,同时在实验细胞中共转过表达该转录因子,可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。

6. 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体,在不同上游信号条件下,萤光素酶活性代表了通路的下游响应。例如,在GPCR研究中,将cAMP response element(CRE)载入报告基因载体,构建稳定表达细胞株后,可以用于分析GPCR的激活与抑制剂筛选。又如,将HIF1α的响应原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株,可以用于低氧相关通路的研究。

二、常用萤光素酶报告基因载体

pGL3-Basic

pRL-TK

pmirGLO

三、经典案例

案例一

题目:Long non-coding RNA linc00673 regulatednon-small cell lung cancer proliferation,migration, invasion and epithelialmesenchymal transition by spongingmiR-150-5p

期刊:Molecular Cancer

小结:验证linc00673具有miR-150-5p的靶向结合位点。将linc00673包括预测结合位点的序列克隆到pmirGLO- linc00673-WT,同时构建靶位点突变的pmirGLO- linc00673-MUT,分别共转miR-150-5p mimics及NC mimics,结果显示miR-150-5p转染组的相对荧光值降低,提示存在靶向结合。

图:RNA与质粒共转染293T,24h后双萤光素酶检测

案例二

题目:SOX9 indirectly regulates CEACAM1 expression and immuneresistance in melanoma cells

期刊:Oncotarget

小结:验证SOX9对于CEACAM1的转录调控作用。分别使用了两种黑色素瘤细胞526mel和624mel,对CEACAM1的启动子区域分别选择了600bp-200bp的截短片段,共转染过表达SOX9,显示SOX9能够抑制CEACAM1启动子的转录。

图:截短的pCEACAM1进行双萤光素酶检测

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