菌种保藏及种子扩大培养
二章节菌种与种子扩大培养精品资料
现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组 分、计算机数值分析。
（6）毒性试验
自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将 其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有 关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆 菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食 用，均需通过两年以上的毒性试验。
中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。
5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）；
中圈医学科学院抗生素研究所，北京和四川抗生素工业研究所，成都：新 抗生素菌种。
华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种 6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）； 农业部兽医药品监察所，北京。
（二）菌种的衰退与复壮
（3） IAM （Institute of Applied Microbiology）， University of Tokyo，Japan。
日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。
（4） IFO （Institute for Fermentation）， Osaka， Japan。
发酵研究所，日本大阪。
在我国为了推动菌种保臧事业的发展，1970午7月在国家 科委和中国科学院主持下，召开了第一次全国菌种保藏工作 会议，在会上成立了中国微生物菌种保减管理委员会 （CCCMS）委托中国科学院负责担负全国菌种保臧管理业务， 下设六个菌种保藏管理中心。
l）普通微生物菌种保臧管理中心（CCGMC）；
中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌，细菌。
实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
简述种子扩大培养的一般步骤
简述种子扩大培养的一般步骤
种子扩大培养是一种常用的微生物培养方法，用于从初始培养物中扩大微生物数量，以便进行后续实验或工业应用。
一般而言，种子扩大培养的步骤包括以下几个方面：
1. 培养基准备，选择适当的培养基，根据目标微生物的需求添加合适的营养物质和pH调节剂。
培养基的配制需要严格按照配方和操作规程进行，以确保培养基的质量和一致性。
2. 种子接种，从初始培养物中选择合适的菌株或菌落，通过无菌技术将种子接种到含有适当培养基的培养容器中。
接种时需要注意保持无菌操作，避免外界的污染。
3. 培养条件调控，根据目标微生物的生长特性和要求，调节培养条件，包括温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等。
这些条件的调节可以促进微生物的生长和代谢活性，从而实现种子的扩大。
4. 培养过程监测，在培养过程中，需要定期监测微生物的生长情况，可以通过测量生物量、菌落形态观察、代谢产物测定等方法进行。
监测结果可以帮助调整培养条件，以达到最佳的生长效果。
5. 收获和处理，当微生物达到预定的生长状态时，可以进行收获。
收获方法根据具体情况而定，可以选择简单的离心沉淀、滤液
或离子交换等方法。
收获后的种子可以进行后续的实验或工业应用。
6. 清洁和消毒，在种子扩大培养结束后，要进行培养容器和设
备的清洁和消毒工作，以防止微生物的交叉污染和感染。
总结起来，种子扩大培养的一般步骤包括培养基准备、种子接种、培养条件调控、培养过程监测、收获和处理，以及清洁和消毒。
这些步骤的严格执行可以确保种子扩大培养的成功，并提供足够的
微生物种子用于后续实验或工业应用。
氨基酸菌种扩大培养及菌种保藏技术.ppt
种子扩大培养的目的与要求
3. 二级种子(种子罐)
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5% 培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%-10%）， 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小， 因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较 精细。
种子制备的术概要
3、起始接种物的传代问题
细菌 保藏斜面 → 活化斜面
产孢子 保藏 → 母斜面 → 子斜面
目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
种子制备的技术概要
三、生产车间阶段 1、培养物的选择原则
氨基酸菌种扩大培养及菌种保藏技术
种子的扩大培养
❖教学目标
▪ 1) 了解种子扩大培养的概念与目的，掌握对发酵种 子的要求；
▪ 2) 了解种子扩大培养的工艺技术概要； ▪ 3) 掌握接种量、种龄、发酵级数的概念； ▪ 4)掌握菌种保藏的各种方法。
种子的扩大培养
种子扩大培养的目的与要求 种子制备实例 种子制备的技术概要
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
种子扩大培养的目的与要求
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml，32℃培 养12小时。
在发酵产品的放大中，发酵级数的确定是非常重 要的一个方面。
种子制备的技术概要
发酵级数的确定举例：采用三级发酵的谷氨酸发酵工艺
生产菌种的扩大培养与保藏简介
生产菌种的扩大培养与保藏简介1. 引言生产菌种的扩大培养与保藏是微生物工程中不可或缺的重要环节。
在微生物工业中，菌种数量的扩大和保藏对于生产规模的控制和后续的实验操作至关重要。
本文将介绍生产菌种的扩大培养和保藏的基本原理、方法和注意事项。
2. 菌种的扩大培养菌种的扩大培养是将初始的菌株培养至足够数量供生产使用的过程。
以下是菌种的扩大培养的基本步骤：2.1 选择培养基根据菌株的特性和要求，选择适当的培养基进行扩大培养。
常见的培养基包括富含营养物的培养基和特殊功能的培养基。
2.2 菌种的预培养在扩大培养前，先进行菌种的预培养。
从保存的菌种中挑取适量的菌落或菌点接种到预培养培养基中，进行为期数小时的预培养。
2.3 液体扩大培养将预培养的菌种转移到液体培养基中，并进行液体扩大培养。
根据需要的菌种数量，选择适当的容器和培养条件进行扩大培养。
2.4 固体扩大培养液体培养经过一定周期后，可以将菌种转移到固体培养基中进行固体扩大培养。
固体培养可以有助于菌落的生长和分离。
2.5 菌种的检测和纯化在扩大培养结束后，需要对菌种进行检测和纯化。
常用的方法包括菌落PCR、生化测试和纯化子代的分离。
3. 菌种的保藏菌种的保藏是为了长期保存和储备菌种，保证其稳定性的一系列措施。
以下是常见的菌种保藏方法：3.1 冷冻保存法将菌种在适当的保存液中制备冻存物，并存放在低温冰箱或液氮罐中。
常用的保存液包括甘露醇、甘油等。
3.2 干燥保存法将菌种在无菌条件下培养至晚期生长期，用无菌纱布吸干培养基上的菌落，将菌落贴附在无菌纸上，然后将纸张放置在干燥剂中保存。
3.3 冷冻干燥法通过冷冻和干燥的交替操作，将菌种制备为干燥粉末，再用密封容器保存。
冷冻干燥法在菌种保存期间能保持菌种的高度稳定。
3.4 液氮冷冻保存法将菌种悬浮液或培养物直接置于液氮罐中，利用极低温度保存菌种。
这种方法能够保留菌种的生物学特性，并保证菌种长期保存。
4. 注意事项在进行生产菌种的扩大培养和保藏时，需要注意以下事项：•严格遵守无菌操作规范，防止污染和交叉感染。
第七章 生产菌种的扩大培养与保藏
第一节 种子扩大培养的概述
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管 中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一 定数量和质量的纯种过程。
发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：
（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅 速生长，迟缓期短； （2）生理状况稳定,个体与群体都要满足同一生长 要求； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； （4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力。
（1）表面培养
表面培养是一种好氧静臵培养方法 针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和 固态表面培养。
相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，
越易促进氧气由气液(气固)界面向培养基内传
递，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。
这种培养方法菌的生长速度与培养基深度有关，单 位体积的表面积越大，生长速度也越快。
（3）液体深层培养
用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌 桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部 通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散
使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。
特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不 同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子 浓度等条件，选择最佳培养条件。
第二节
种子的制备过程
种子制备的过程大致可分为两个阶段： （1）实验室种子制备阶段 （2）生产车间种子制备阶段
一、实验室种子的制备
（一）孢子的制备 1. 细菌芽孢的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富 的配方。培养温度一般为37℃。不产芽孢的细菌培 养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养时间为 5~10天。
第三章 菌种保藏复壮扩大培养
• （5）其他保藏方法
• 冷冻法：分低温冷冻（－20 ℃）与 超低温冷冻（－196 ℃）两种。适 用于细菌、真菌、病毒等的保藏 • 液态真空干燥法：菌体在恒温液态 条件下进行真空干燥。适用于包括 细菌、病毒，特别适用于冷冻干燥 保藏效果不佳的菌种。 • 琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产 孢子细菌的保藏
（2）矿物油保藏法
将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的 液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后放于 冰箱中保存。 适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种
（3）砂土管保藏法
利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微 生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两 步。 适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏 感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以 及酵母不适用。
• 2、种龄与接种量 • 3、斜面冷藏时间 • 4、温度：温度直接影响生长和酶的合合成酶的最适pH。 培养基pH值在发酵时要受菌体代谢的影响。
• 调节方法（使之保持适当的pH值）有三种 方法： 用酸碱溶液中和法；使用缓冲溶液法； 使用生理缓冲剂；
3、新诱变因子及诱变技术
• （1）低能离子束诱变： 离子注入是20世纪80年代兴起的一种表面处理技术。这种 相互作用过程大致分为能量沉积、动量传递、离子注入和电荷 交换等四个原初反应过程，在10－19－10－13s中间时发生。 荷能离子注入除具有Y射线能量沉积引起机体损伤的特征外， 还具有动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、 重排或基因的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合 反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造 成的损伤。离子注入通常采用N+、H+、Ar＋。离子注入生物 学效应显示出一些不同于辐射生物学的特征，相当于物理和化 学诱变两者相结合的复合诱变效应 • （2）激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变
生产菌种的选育培养—菌种的扩大培养及保藏
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
生物工业菌种与种子的扩大培养
II. 划线分离法
斜线法 曲线法 方格法 放射法 四格法
产品鉴定及筛选
从两个角度出发：产物角度、形态角度 I. 从产物角度出发
也就是在培养时以产物的形成来有目的的设计 培养基。 例：醛肟水解酶的筛选
在培养基中加入0.05%的Z-PAOx，每隔2-3天移去 一半培养物，补充新鲜培养基，不断分析样品。
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育
4. 诱变育种 正突变 对生产有利的突变称为正突变。
突变方向 负突变 造成菌株衰退及生产质量下降 的突变称为负突变。
菌株发生正突变的概率低。 诱变育种的关键： ①以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细
胞悬浮液，使个别存活的个体中DNA碱基变异频 率大幅提高；
(b) 预处理：1g土样溶于99ml去离子水中，振荡均匀， 过滤，得菌悬液
(c) 增殖培养： 经80℃，30分钟预处理
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 自然选育过程： (d) 分离纯化：固体分离培养基采用CMC为唯一碳源
，pH 10.5条件下涂布培养3-4天 (e)鉴定筛选：选择有凹陷圈的菌落，而且越大越
诱变
2. 诱变机理 这种变化包括：DNA链的断裂，DNA分子内和分子 间的交联形成嘧啶二聚体。
诱变
3. 诱变仪器 265nm的紫外光，对应于功率为15W的紫外灯
4. 诱变操作 (1) 将10ml菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液 层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器；
(2) 使用15W的紫外灯管，照射距离为30cm左右， 照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株 需处理10min左右。
4第四章-种子的扩大培养
① 生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延 滞期短；
② 菌体的生理特性及生产能力稳定；
③ 菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量的要求；
④无杂菌污染。
生产种子的制备与培养条件因生产品种和菌种不 同而异。eg:细菌、酵母菌、放线菌和霉菌，它们 的生长速度、产孢子能力、营养要求、培养温度、 需氧量等方面各不相同，因此应根据菌种的生理 特征选择合适的培养条件。
{3} 霉菌类 (☆☆☆重点此处课本讲的较为 粗略，补充章节加以详细说明，可选。）
母斜面上的菌落要分散，以便于挑选理想 的菌落。挑单菌落种子斜面时，要挑取菌 落中央部位的孢子。斜面制备大米孢子时， 孢子悬液的浓度要适当，接种完毕后，把 大米等固体培养基与孢子悬液混合均匀， 待孢子生长成熟后，在真空下将水分含量 抽至10%下，密封后置于4℃冰箱中 备用。
{2} 放线菌类 灭菌后的琼脂培养基在放凉且未凝固时摆成斜面，
如有不溶解的原材料，应轻轻摇匀，但不要产生 气泡。待斜面凝固后置于28~37℃培养2~3d，经 检查无杂菌和无冷凝水后备用。根据放线菌种类 的不同，取适量沙土管菌种或母斜面上的菌落 划线接种 到琼脂斜面培养基上，调整到合适的 温度，经过5~7d培养，待孢子成熟后方可使用。 注意点：第一次从沙土管或者冻干管中接出的菌 种往往生长缓慢，菌落稀少。这是因为菌种长期 在低温下保存，尚未完全从休眠中恢复，同时有 一些菌种死亡所致，可选用第一次长好的斜面上 （成为子斜面），经过培养后，斜面上的菌落数 量多，孢子丰满，孢母的扩大培养
第四节 液体种子制备
定义：液体种子的制备是将固体培养基上 培养好的孢子或菌体转入到液体培养基中 培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。
注意：种子制备所使用的培养基和工艺条 件，要有利于孢子发芽和菌丝的繁殖。
生物工业菌种与种子的扩大培养
第四章生物工业菌种与种子的扩大培养第一节工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏一、微生物菌种的衰退⒈ 菌种衰退的原因菌种衰退的原因有两个方面：一是菌种保藏不妥；二是菌种生长的条件要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。
此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征等情况。
菌种连续传代是菌种发生衰退的直接原因。
由于连续传代使菌种经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营养和环境等培养条件都是在不断地变化，与处于休眠状态的菌种相比，细胞的自发突变率要高得多。
因此，菌株经过连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象就逐渐显露出来。
⒉ 菌种性能的改变⑴ 菌种遗传特性的改变从菌种遗传机理这一微观角度来看，菌种遗传特性的改变主要有如下三个原因。
① 异核现象导致微生物群体发生变异。
② 自发突变导致菌种遗传特性改变。
③ 突变所产生的变种或杂交重组所形成的杂种往往不稳定，容易发生回复突变或产生分离子，以致在菌种这一群体中形成具有不同基因型（亦称遗传型）的个体。
⑵ 菌种生理状况的改变⒊ 防止菌种衰退的措施⑴ 菌种的分离⑵ 菌种的复壮狭义的复壮指的是菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。
而广义的复壮应该是一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种的生产性能逐步提高，所以，这实际上是一种利用自发突变(正突变)从生产中不断进行选种的工作。
⑶ 提供良好的环境条件⑷ 用优良的保藏方法⑸ 定期纯化菌种二、菌种的复壮⑴ 纯种分离⑵ 通过寄主体进行复壮⑶ 淘汰已衰退的个体三、菌种的保藏⒈ 菌种保藏的原理⒉ 菌种保藏方法⑴ 斜面低温保藏法⑵ 液体石蜡封存保藏法⑶ 固体曲保藏法⑷ 砂土管保藏法⑸ 冷冻干燥法⑹ 液氮超低温保藏法⒊ 菌种保藏的注意事项⑴ 菌种在保藏前所处的状态⑵ 菌种保藏所用的基质⑶ 操作过程对细胞结构的损害第二节工业微生物菌种的选育一、自然选育自然选育包括从自然界分离获得菌株和根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。
第四章 种子的扩大培养
一、影响种子质量的因素及控制
针对以上影响因素，提出如下的解决措施：
（1）培养基所用原料要经过发酵试验合格才 可使用。 （2）严格控制灭菌后培养基的质量。 （3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放 置一定时间。 （4）共生产用的孢子培养基要用比较单一的 氮源，作为选种或分离用的培养基则采用 较复杂的有机氮源。
2、培养条件
（3）产物生成量
（4）酶活力：种子液中某种酶的活力，与目的 产物的产量有一定的关联。
第二节 种子培养的条件
一、影响种子质量的因素及控制 生产过程中影响种子质量的因素通常
有：孢子的质量、培养基、培养条件、
种龄、接种量。
一、影响种子质量的因素及控制
1、培养基
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现 象，其主要原因是：原材料质量波动。 此外，地区不同、季节变化和水源污染， 均可造成水质波动，影响种子质量。 菌种在不同固体培养基上可呈现多种不同 代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的 菌落类型也越多，不利于稳定生产。
生产中主要对以下几方面进行稳定检查：
（1）细胞或菌体的外部特征：对于单细胞，要 求菌体健壮、菌形一致、均匀整齐；对于霉 菌、放线菌，要求菌丝粗壮、对某些染料着 色力强、生长旺盛、俊熙分枝情况和内含物 情况好。 （2）生化指标：主要包括种子液的糖、氮、磷 的含量和 pH 变化与正常的基质消耗曲线相近。
3、种子扩大培养的目的
（1）接种量的需要 （2）菌种的驯化
（3）缩短发酵时间、保证生产水平Βιβλιοθήκη 二、发酵生产中对种子的要求
发酵生产过程中的种子必须满足以下条件：
（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐 后能迅速生长，迟缓期短； （2）生理性状稳定； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的 要求； （4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力。
第二章 种子扩大培养
2 固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深 层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特 有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种 至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽 因不同菌种而异，但其原则为采用易被 菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸 盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足 够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
1.摇瓶种子制备
一、种子扩大培养流程图
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养）
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
（一）实验室种子的制备
两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程
用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。 母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异， 子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子 罐．此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工 艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成 为发酵生产的一个方向。 摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此 方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间
一++菌种与种子扩大培养
2、种龄与接种量：
种龄以对数期为宜； 接种量宜适当大； 接种量大的优缺点： 优点：缩短发酵周期； 减少染菌机会； 提高设备利用率 缺点：种子培养费时； 增加级数； 代谢废物多
3.培养条件
①温度：温度直接影响生长和酶的合成； 种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种 子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的 温度，目的在于使菌种逐渐适应。 许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度 往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生 菌的最适合生长温度为：30℃，而产物合成温度 为32-34℃ ②pH值：对微生物有明显的影响。 1）扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值。 2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.5— —1.0个单位
三、影响种子质量的主要因素
1.培养基 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。 选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方 便等。 对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基不 相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低 而且是用微生物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基， 要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利 于菌体的增殖。例如：HASS（高温淀粉酶） 三角瓶用碳源：葡萄糖+乳糖 3m3种子罐：液化淀粉
第二节
种子扩大培养
一、种子扩大培养的任务
1.任务：每次发酵罐的投料，要提供相当数量代谢旺盛 的种子。根据菌种生长速度快慢来决定扩大培养的级数； 2、三级发酵（50吨发酵罐）： 斜面—一级摇床—二级种子罐—三级种子罐—发酵罐
二、工业微生物的培养类型
⑴静置培养法（厌气性发酵）；少，如酒精发酵 ⑵通气培养法（好气性发酵）；主要，如抗生素等
划线培养后的细菌菌落
酿酒酵母
霉菌孢子
生产菌种的扩大培养与保藏
生产菌种的扩大培养与保藏目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。
如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。
要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。
其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。
如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能力的大小；及对营养、温度、需氧等条件的要求均有所不同。
因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。
这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。
种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；（2）生理形状稳定；（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；（4）无杂菌污染；（5）保持稳定的生产能力。
第一节种子的制备过程在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段：（1）实验室种子制备阶段（2）生产车间种子制备阶段一、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式：对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。
（一）孢子的制备1，细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。
培养温度一般为37℃。
细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。
2，霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。
培养的温度一般为25~28℃。
培养时间一般为4~14天。
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2. 菌种性能的改变
(1) 菌种的外在特征改变
异核现象导致微生物群体发 生变异
自发突变导致菌种遗传性 能改变
回复突变 降低(衰；2退代) 菌谢菌株能种的力特降的点低生：；个发理体酵状或周况群期体延改特长变征；发抗生不变良化环；境生能产力能降力低。
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3 . 防止菌种衰退的措施
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Байду номын сангаас
一、 种子扩大培养阶段
A： 实验室种子的制备： e.g 产黄青霉菌(P.chrysogonum)
原始菌种
斜面试管
250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 ~28°C ，4~14天
成熟
（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 °C冰箱保存）
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e.g. （ Glutamic acid-producer ）
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复壮的措施
• 通过分离达到复壮 在琼脂平板划线、涂布或与琼脂培养基混 合培养再分离，达到—菌落纯 采用单细胞或单孢子分离法达到—细胞纯
• 通过寄主体达到复壮 将菌株接种到寄主细胞进行繁殖达到复壮 。
•202淘0/5/2汰8 已衰退的个体达到复壮
三、菌种保藏（strain preservation）
保藏应注意的问题：
菌体状态：休眠体
基质：营养贫乏
操作过程：不应对细胞造成伤害
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国内外菌种保藏机构
• 中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM ）
1979年成立，下设6个菌种保藏管理中心 CCGMC 普通微生物菌种保藏管理中心 ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 CVCC 2020/5/28 兽医微生物菌种保藏管理中心
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3 种子扩大培养
目的：为发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。 原因：发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发 酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩 短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机 会。 种子扩大培养的任务，不但要得到纯 而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、接 种数量足够的培养物。
• 国外菌种保藏机构 • 美国典型菌种保藏中心ATCC • 美国农业研究菌种保藏中心
NRRL • 英国的国家典型菌种保藏所
NCTC • 德国微生物菌种保藏中心 DSMZ
……
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美国ATCC采用的两种保藏方法
• 即保藏期一般达5~15年的冷冻干燥保藏法 保藏期一般达20年以上的液氮保藏法
用沸水处理几分钟，再用平板进行分离， 从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。
如果遇到某些菌株即使进行单细胞分 离，仍不能达到复壮的效果，则可改变培 养条件，达到复壮的目的。
如AT3.942栖土曲霉(Aspergillus terricola)的产孢子能力下降，可适当提高
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防止衰退的措施
5-10 L卡氏罐(15 °C-20 °C ，3-5天）
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B：生产车间种子制备 种子罐的作用：使
有限数量的孢子发芽、 生长、并繁殖成大量的 菌丝体，满足发酵罐的 需要。（菌体生长和产 物形成）。
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种子罐级数的确定
• 种子罐级数是指制备种子逐级扩培 的次数。 依据：菌种生长特性 孢子发芽及菌体繁殖的速度 所用的种发子酵罐(罐se的ed容ing积ta。nk)的级数
固体试管斜面（32 °C ，18~24小时） 小三角瓶培养（摇床）
谷 氨 酸 生 产 菌
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大三角瓶培养（摇床）
• e.g. yeast：
原始菌种（出发菌种）
10mL 麦汁试管 （25 °-27 °C ，3天）
250mL 三角瓶培养（25°C， 2天）
1000mL 三角瓶培养（25°C， 2天）
氧和缺乏营养物质的，即可达到降低其代谢活动，延长其保
。 存202期0/5/的28 目的
保存方法：
应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要 考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保存方法，以便长 期保藏。
酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封保藏法。 霉菌：沙土管保藏法。 细菌和放线菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。 放线菌可 用沙土或冷冻保藏法保藏。
• 菌种的分离 • 菌种的复壮 • 提供良好的环境
条件
• 使用优良的保存 方法
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二、菌种的复壮
• 菌种的复壮 狭义的复壮和广义的复壮 • 狭义的复壮 指菌种已经发生衰退后，再
通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的 群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢 复改菌种原有典型性状的一种措施。 • 广义的复壮 指的是一种积极的措施，即 在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识 地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使 菌种的生产性能逐步提高。
如果菌种已经发生退化，产量下降，则要进 行分离复壮。
菌种的分离: 因为在菌种发生衰退 的同时，并不是所有的菌体都衰退，其中
未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的
，具有更强生命力。
•
因此，对于已衰退的菌株采用单细胞
菌株分离的措施，即用稀释平板法或用平
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如对芽孢杆菌(Bacillus)，可先将菌液
产物的品种 生产规模 工艺条件
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种子罐级数越少越好：
简化生产工艺和控制
减少接种带来的染菌机会
讲菌种的保藏与种子扩大培养
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衰退 复壮 保藏 种子扩大培养
一、菌种衰退
• 1.衰退的原因 • (1) 菌种保藏不妥; • (2) 菌种生长的要求没有得到满足，或
是遇到不利的条 件，或是失去某些需要 的条件； • (3) 经诱变获得的新菌株发生回复突变 ，从而丧失新的特征的情况。 • (4) 连续传代。
基本原理： 根据菌种的生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的
代谢活动处于不活波状态。 要求： 维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来
优良的生产性能。 保藏时首先选择优良纯菌种，最好是它们的休眠体如孢
子（ spore）、芽孢 (gemma)等； 要创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺