C0508 磷酸钙法细胞转染试剂盒说明书
碧云天C0528 Lipo6000TM转染试剂
Lipo6000TM转染试剂产品简介：Lipo6000TM转染试剂(Lipo6000TM Transfection Reagent)是一种非常高效的新型转染试剂，达到了国际最主流转染试剂的转染效果。
适用于把质粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸、以及核酸蛋白复合物或带负电荷的蛋白转染到真核细胞中，也可以用于活体动物的核酸转染以用于基因治疗。
Lipo6000TM转染试剂对于常见的哺乳动物细胞具有非常高的转染效率、重复性好、操作简单、无明显的细胞毒性，并且对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用。
Lipo6000TM转染试剂的使用方法和常用的Lipofectamine®2000Reagent完全一致。
并且经过对HEK293T、Hela、NIH3T3、HEK293FT、CHO等细胞的测试，转染效率也和Lipofectamine® 2000 Reagent相当甚至略高。
Lipo6000TM转染试剂不仅适用于质粒、siRNA等单一成分的细胞转染，也适合多个质粒或者质粒与siRNA等的组合转染。
Lipo6000TM转染试剂转染过表达质粒后，通常24-48小时后达到较高的蛋白表达水平，并且很多情况下蛋白表达量在转染后48小时显著高于转染后24小时；转染siRNA通常3-5天后对于目的基因的下调水平会比较理想。
Lipo6000TM转染试剂转染细胞时，基本不受细胞培养液中的血清和抗生素的影响，即可以在血清和抗生素存在的情况下进行细胞转染。
但为了取得最佳的转染效果，推荐转染时使用不含抗生素的含血清的细胞培养液。
Lipo6000TM转染试剂的转染效果可以通过转染表达EGFP等荧光蛋白的质粒进行快速鉴定。
Lipo6000TM转染试剂与Lipofectamine® 2000Reagent转染效果比较请参考图1-6。
图1. Lipo6000TM转染试剂与Lipofectamine® 2000Reagent转染效率的比较。
一种用磷酸钙法高效转染HEK293T细胞方法的建立_陈晓
5 %CO2 下培养 48h 后染色 。 洗去染液 , 光学显微镜下 观察蓝染细胞 , 同上述方法计算转染效率 。
2 结果
2 .1 lacZ-pShutt le 质粒的转染及 X-gal 染色 阴性对 照没有蓝染细 胞 , 而 lacZ-pShut tle 质粒用
磷酸钙法转染细胞有明显的蓝染细胞 , 并且是全细胞 蓝染(图 1)。
(1 .中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室 , 山东省海洋药物重点实验室 , 海洋药物与食品研究所 , 山东 青岛 266003 ;2 .青岛大学医学部 附属医院呼吸内科 , 山东 青岛 266003)
摘 要 : 利用磷酸钙转染法将 lacZ-pShuttle 质粒导入 HEK 293T 细胞中 , 实验证明 , pH 值 、DNA 纯度 、转 染后培养时间和甘 油休克时 间是影响转染效率的重要因 素 。 转染 后培养 6h 进行 甘油 休克 效果最 佳 , 比培 养 0h 直 接进行 休克 转染效 率升 高 584 .4 %;甘油休克时间为 4.5min 时转染效果最佳 , 比不用甘油休克转染效率升高 130 .8 %。 通过对 影响转染 的几个条件 进 行优化 , 建立了 1 种可以高效转染 HEK 293T 细胞的方法 , 且简便易行 。 关键词 : 磷酸钙转染 ;甘油休克 ;X-g al 染色 中图法分类号 : Q 813.4 文献标识码 : A 文章编号 : 1672-5174(2005)05-807-05
图 1 转染后染色 细胞 Fig .1 Dying cells after transfectio n
2 .2 pH 值和质粒纯度对转染率的影响 HBSP 缓冲 液的 pH 值 在 6 .70 和 7 .10 时 转 染
H EK 293T 细胞的效果不好 , 细胞成活率低 , 有大颗粒 状物体存在(图 2 A , B);pH 值在 6 .96 时转染效果好 ,
上海杰美基因医药 GENMED QuikFusin 非脂质体细胞转染试剂盒产品说明书
GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS10028 v.A GENMED QuikFusin非脂质体细胞转染试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED QuikFusin非脂质体细胞转染试剂是一种旨在通过高效低毒的非脂质体的脂质型介导载体，不用清除血清，能与目标DNA形成复合物，而转染进细胞的权威而经典的技术方法。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种片段包括大片断DNA（12 kb以上）、寡聚核苷酸等的转染，可以转入进700多种类型的贴壁和悬浮培养细胞系（株）。
可以被用于稳定转染或暂态转染。
产品严格无菌，即到即用，无核酶污染，配比优化，操作简捷，性能稳定，转染效率明显。
技术背景QuikFusin为转染效率更高、细胞毒性更低的新型非脂质体的脂质型介导载体，经包装在任何条件下形成高效转染复合物。
无需更换培养基，穿膜效率高，转染速度快。
对细胞的负面影响最低。
产品内容GENMED转染液（Reagent A） 毫升GENMED介导液（Reagent B） 微升产品说明书 1份保存方式保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于脱离细胞1.5毫升离心管：用于转染操作的容器完全细胞培养液（GMS12052）：用于细胞转染后恢复使用的培养基实验步骤转染实验开始前，移取微升GENMED转染液（Reagent A）到无菌的1.5毫升离心管，然后加入微升GENMED介导液（Reagent B），用200微升枪头轻轻上下抽吸混匀，成为GENMED转染工作液。
然后进行下列操作。
1．准备一个25cm2细胞培养瓶的细胞（106细胞）2．在转染前一天，用胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液脱离细胞一次3．次日，准备1个无菌的1.5毫升离心管4．加入5微升用户需转染的DNA（9微克）5．用1毫升枪头移取微升含有GENMED转染液（Reagent A）和GENMED介导液（Reagent B）的转染工作液6．一滴一滴缓慢加入到DNA管中7．室温下孵育15分钟8．用1毫升枪头移取所有内容物9．直接加入到含有70％细胞铺满率的25cm2细胞培养瓶（内有5毫升细胞培养液，无需更换）10．轻轻摇动细胞培养瓶，使其分布均匀11．放进37℃细胞培养箱，孵育3小时12．小心抽掉含有转染液的细胞培养液13．加入5毫升用户自备的完全细胞培养液14．放进37℃细胞培养箱，孵育过夜15．如果稳态表达，小心抽掉培养液，加入用户自备的筛选培养液16．如果暂态表达，可以收集细胞后保存或即刻进行后续实验注意事项1．本产品为10次操作2．整个操作须无菌操作3．本产品转染106细胞4．本产品可以转染各种类型的细胞株5．本产品提供的成分配比优化6．DNA用量可以使用7至9微克7．转染期间不受血清影响8．建议转染时间不要超过3小时，否则可能造成细胞G1期停顿9．建议使用操作说明的进行转染。
EndoFectin-CHO 转染试剂 说明书
EndoFectin™-CHO 转染试剂■ 产品概述：EndoFectin™ CHO 转染试剂是一种具有专利的阳离子聚合物试剂，它能与核酸形成复合物，并使该复合物进入哺乳动物细胞。
EndoFectin™ CHO 转染试剂专为转染CHO 细胞，并构建稳定的细胞系而设计。
即使在有血清存在的情况下，它仍然能高效的将核酸导入细胞。
GeneCopoeia 公司提供的 EndoFectin™ CHO 转染试剂有如下优点：• 优越的转染效率• 重组蛋白的高表达水平• 与含血清的培养基相兼容• 低细胞毒性• 易于操作■ 成分及储存条件：• 每管含有经过滤除菌的EndoFectin™ CHO 转染试剂• EndoFectin™ CHO 转染试剂 可于常温下运输。
4-8℃密闭保存。
该试剂在4-8℃的条件下，可保持稳定至少12个月。
■ 质量控制：每批EndoFectin™ CHO 均经过转染测试。
我们将eGFP 表达质粒(GeneCopoeia Catalog No. EX-EGFP-Lv01)用EndoFectin™ CHO 转染试剂转入subconfluent HEK-293 细胞。
转染16小时后，超过95%的细胞表达eGFP 。
■ 实验开始前的注意事项：质粒的质量：请务必使用高质量转染级无内毒素的质粒。
通过260nm 光吸收测定DNA 浓度，260nm/280nm 比值确定DNA 纯度（比值应该在1.8~2.0的范围之内）。
如有可能，请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。
细胞的条件：使用适当保存和经常传代的健康细胞。
确保培养基没有被细菌，真菌或支原体污染。
如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。
■ 瞬时转染方法：1. 接种细胞1转染前一天，用胰酶消化细胞并计数。
调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，总体积如表1所示。
每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到70~80%。
2. 准备DNA/EndoFectin™复合物GeneCopoeia Inc.19520 Amaranth DriveGermantown, Maryland 20874USATel: 301-515-6982; 1-866-360-9531Fax: 301-515-6983Web: GeneCopoeiaTMExpressway to Discovery用于转染核酸到哺乳动物细胞产品套装编号： Z0103储存条件：4℃－8℃保存 产品编号Z01030A Z01030BZ01030C （A*5）包装规格1mL 0.5mL 5 mL地址:广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D 区8楼，510663客服电话*************电子信箱:********************网址:该产品仅限于实验科学研究用，若有任何单位或个人将该产品用于临床诊断、治疗等其他国家专门规定的特殊用途，本公司概不承担任何责任。
钙测试预装试剂盒说明书
Millipore- 1.00858页码 1 的 9The life science business of Merck operates as MilliporeSigma in the US化学品安全技术说明书按照GB/T 16483、GB/T 17519编制版本6.2修订日期18.09.2022打印日期18.09.2022最初编制日期19.07.2017SDS 编号Millipore - 1.00858产品编号Millipore - 1.00858钙测试预装试剂盒第1部分：化学品及企业标识1.1 产品标识产品名称: 钙测试预装试剂盒Calcium Cell Test Method: photometric 10 -250 mg/l Ca14 - 350 mg/l CaO25 - 624 mg/l CaCO₃ Spectroquant®产品编号: 1.00858产品编号: 100858品牌: Millipore1.2 安全技术说明书提供者的详情制造商或供应商名称: Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.509 Renqing RoadZhangjiang High Tech East Park, PudongSHANGHAI201201 SHANGHAICHINA西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司上海市浦东新区仁庆路509号10幢邮政编码：201201默克股份两合公司64271 达姆施塔特德国Millipore - 1.00858 页码 2 的 9The life science business of Merck operates as MilliporeSigma in the USPhone:+49(0)6151 72-2440电话号码 : +86 21 6141-5566 传真: +86 21 6141-55671.3 应急咨询电话紧急联系电话: +86 532 838890901.4 物质或混合物的推荐用途和限制用途已确认的各用途 : 分析用试剂这是此产品概括的物质安全资料表(SDS),如需第16项中所列的每一成分完整的物质安全资料表(SDS),请浏览我们的网站.第2部分：危险性概述2.1 GHS 危险性类别易燃液体 (类别 3), H226 金属腐蚀物 (类别 1), H290严重眼睛损伤/眼睛刺激性 (类别 2A ), H319 生殖毒性 (类别 1B ), H360本部分提及的健康说明（H-)全文请见第16部分。
各种转染试剂中文说明
FuGENE6（Roche）转染步骤:转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。
将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。
将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。
使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。
1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100ul。
2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。
3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。
4.室温孵育20分钟。
5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。
6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。
7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。
Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。
细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0ugDNA，轻轻混匀。
3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。
Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。
NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。
4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。
室温放置20分钟。
5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。
加入2ml无血清配养基。
磷酸钙共沉淀法
磷酸钙共沉淀法通过核酸和磷酸钙以共沉淀物颗粒形式出现时，形成磷酸钙-dna沉淀物，使之黏附到培养细胞表面，利于细胞吞入、摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞。
而进入细胞的dna仅有1％～5％可进入细胞核内，其中仅有不到1％的dna可以与细胞dna整合，在细胞中进行稳定表达。
影响磷酸钙转染法转染效率的主要因素是沉淀中dna的量，沉淀停留在细胞上的时间长短，以及是否用甘油或二甲基亚砜(dmso）冲击，及冲击时间的长短。
总的来说，磷酸钙转染中要用较高浓度的dna(1～50ng)。
用磷酸钙介导的转染中，沉淀中dna的总浓度对于dna的摄取效率有极大的影响。
对于某些细胞系，当在l0cm平皿中加入的dna多于10～15 ug时，就会导致细胞过多死亡以及很少的dna摄入。
但对于其他细胞类型，如原代细胞，沉淀中需要有高浓度的dna，才能使dna进入细胞。
dna一磷酸钙沉淀在细胞上停留的最适时间随细胞类型不同而有所差别。
此外甘油或二甲基亚砜冲击可极大地提高某些细胞类型的转染效率。
本节主要介绍两种磷酸钙转染方法：【材料】1.2 x hepes缓冲盐溶液（hebs)280mmol/l nacl,10mmol/l kci,l.5mmo1/l na2 hpo4·2h20,12mmol/l葡萄糖、50mmol/l hepes。
将1.63g nacl,0.074gkc1,0.027g na2hpo4·2h20,0.2g葡萄糖，1.19g hepes溶解于90ml双蒸水，用0.5mmo1/l nahc03调ph为7.1，然后用蒸馏水定容l00ml。
检测转化效率，用0.22 um的硝酸纤维素膜过滤除菌，分装，-20℃保存。
2. 2 x bes缓冲液（bbs) 50mmol/l n,n-双（2-羟乙基）2-氨基乙磺酸（bes),280mmo1/l nacl,l.5mmo1/l na2hpo4(ph 6.95）。
EndoFectinTM-Max 转染试剂用户手册说明书
EndoFectin TM -Max 转染试剂高效转染核酸到哺乳动物细胞产品编号：EF003 / EF004 / EF003T 包装规格：1 mL / 3 mL / 100 μL储存条件：4℃~8℃密闭保存，可保持稳定至少12个月，常温运输。
产品概述EndoFectin TM -Max 转染试剂是以脂质体转染为原理的转染试剂，它能与核酸形成复合物，并使该复合物进入哺乳动物细胞。
EndoFectin TM -Max 转染试剂广泛适用于常见细胞系，如HEK-293、HEK293T 、CHO-K1、Hep G2、Hela 、MCF-7、NIH/3T3和A549等。
即使在有血清存在的情况下，该试剂仍能高效将核酸导入细胞。
GeneCopoeia 公司提供的EndoFectin TM -Max 转染试剂具有如下优点： y 转染效率更优良 y 细胞毒性低y 适用于多种细胞系的转染操作，操作简便y 与含血清的培养基相兼容，转染前不需去除细胞培养液或血清，转染后不需清洗细胞质量控制每批次EndoFectin TM -Max 转染试剂均经过转染测试。
将eGFP 表达质粒（GeneCopoeia Cat.No. EX-EGFP-M02）用EndoFectin TM -Max 转染试剂转入亚融合状态的HEK-293细胞，转染24小时后，超过95%的细胞表达eGFP 。
注意事项使用高质量的质粒：请务必使用高质量的转染级无内毒素质粒。
可通过260 nm 光吸收测定DNA 浓度，并以260 nm / 280 nm 比值确定DNA 纯度（比值应在1.8~2.0的范围内）。
如有可能，请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。
保证细胞状态：请使用适当保存和经常传代的健康细胞，并确保培养基无细菌、真菌或支原体污染。
如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。
实验材料y EndoFectin TM -Max 转染试剂、含目的基因的DNA 质粒y 无蛋白细胞培养液（如Opti-MEM I TM ，来自Life Technologies . 货号：31985-088） y 培养至70~80%汇合度的目的细胞条件摸索在进行正式转染前，推荐以EndoFectin TM -Max 转染试剂摸索目的细胞的最佳转染条件。
各种转染试剂中文说明
FuGENE6（Roche）转染步骤:转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。
将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。
将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。
使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。
1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100ul。
2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。
3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。
4.室温孵育20分钟。
5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。
6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。
7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。
Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。
细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0ugDNA，轻轻混匀。
3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。
Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。
NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。
4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。
室温放置20分钟。
5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。
加入2ml无血清配养基。
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P11）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P16)2.病毒载体及包装质粒病毒载体：DNA组构建及中量提取；包装质粒：商品化产品（Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf （P12）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P17)）或DNA中量提取（目前唯一使用来源）；3.细胞转染方法一：Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P12）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P17)；方法二：按照Lipofectamine?LTX&PlusReagent进行，简要中文说明如下：a.转染前24小时，把4–5x106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%；b.293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基；c.用之前充分混匀PLUSReagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNAPlasmidDNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUSReagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube1，温和混匀，室温孵育5分钟；d.充分混匀MixLipofectamineLTX，在EP管中加入45ul的MixLipofectamineLTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube2，温和混匀；e.将Tube1的溶液加到Tube2中，温和混匀，室温孵育5分钟；Tube1(PlasmidDNA) Tube2(LTX)15ugDNAMIX(pLVX-shRNAPlasmidDNA：455μl Opti-MEMpMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)15μl PLUSReagent 45μl MixLipofectamineLTX Upto500μl Opti-MEM 500μlTotalVolume500μlTotalVolumef.将1ml转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。
转染试剂使用说明书
2. 3).
配制转染工作液： （ 6 孔板或 35 mm 平皿， 2 ml 培养液） 取 5~8μ g DNA （起始用量 5μ g） ，加入稀释液中至总体积为 100μ l，轻轻混匀，室 温放置。
4).
先将 GenFectin TM 涡旋振荡混匀。取 GenFectinTM 1~4μl（起始用量 2μl,） ，加入稀 释液中至总体积为 100μl，轻轻混匀，室温放置 5 分钟。
5).
将稀释的 GenFectinTM 逐滴加入稀释的 DNA 溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作 液在室温放置 15 分钟。
6).
将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入 2 ml 培养液中，轻轻混匀培养液，置 37℃，5% CO 2 培养。
3. 细胞后续处理： 7). 24~48 小时后，观察或收取细胞。
-4-
8).
稳定转染时，于转染后 24~48 小时消化细胞分至 3~5 个培养皿中，加适当浓度的 相应抗生素（如 G418）筛选。
建议的起始转染条件 : 培养容器
96 孔板 24 孔板 6 孔板 35mm 培养皿 60mm 培养皿
转染前一天 接种细胞数
1-1.510 个 0.5-1 10 个 2-4 10 个 2-4 10 个 4-6 105 个
5 5 5 4
转染时 培养液体积
0.1 ml 0.5 ml 2 ml 2 ml 4 ml
DNA 用量 与稀释后体积
0.25 μg 1.25 μg 5 μg 5 μg 10 μg 5 μl 25 μl 100 μl 100 μl 200 μl
GenFectin 量 与稀释后体积
0.1 μl 0.5 μl 2 μl 2 μl 4 μl 5 μl 25 μl 100 μl 100 μl 200 μl
磷酸钙转染
3 沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地粘附和进入细胞。
5 Invitrogen Corporation 阳离子脂质体转染指南,2003,(1)
6 颜子颖等译 精编分子生物学实验指南 北京:科学技术出版社,1998,274-328
7 晶美实验新知 晶美生物工程有限公司
8 李华等 基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较,中国实验动物学杂志,2000,10,(2):65-68
3 Invitrogen Corporation Calcium Phosphate Transfection Kit Cat. no. K2780-01
4 Invitrogen Corporation Calcium Phosphate Transfection System Cat. no. 18306-019
xiaoxiangyuyu：我用磷酸钙方法将质粒转染L02、HepG2、3T3、COS 细胞，用免疫组化方法鉴定转染结果，只有第一次作出的为阳性结果，后面均为阴性，想请教大家如何提高磷酸钙法的转染效率，转染歨鄹要注意些什么
丁香园网友gordon83认为：
我觉得做钙转有几点要注意：一是细胞的生长状态，好的培养状态对提高转染效率有很多的左右，我做293T时一般是用接种15~20小时细胞，这时细胞密度为70%左右；二是可以用氯喹处理细胞，这样能提高转染效率，三磷酸钙的颗粒，尽量做的最小，我一般是先把DNA 水和氯化钙先加EP管混匀后，将EP管放在Vortex上将转速调到500rpm，然后逐滴加入HBS.加完后迅速均匀加入到dish中，过7~11小时换液.
细胞角蛋白(广谱)抗体试剂(免疫组织化学)说明书
1. 供专业人员使用。 2. 该产品中含有叠氮钠 (NaN3)，纯品具有高度的化学毒性。产品中叠氮钠的浓度虽然不能被认定为危险
性浓度，但是叠氮钠可以与铅、铜发生化学反应，形成具有爆炸性危险的叠氮化金属物质。处理时需 要用大量清水冲洗，防止管道中形成金属叠氮化物质。 3. 与所有生物来源的产品相同，必须遵循相关操作步骤。 4. 穿戴合适的个人防护装置，避免皮肤和眼睛接触。 5. 请按照当地、地区以及国家的相关法规，处理未使用的溶液。
【主要组成成份】
1． 提供的试剂 即用型单克隆小鼠抗体以液体形式提供，缓冲液中含有稳定蛋白和0.015 mol/L NaN3。 克隆：AE1/AE3 同型：IgG1，kappa 2．免疫原 人体表皮细胞愈伤组织 (1)。 3．特异性 AE1/AE3 包括两种单克隆抗体，采用人愈伤组织细胞角蛋白免疫小鼠的方法得到 (2)。研究显示， AE1/AE3 能够识别大部分人细胞角蛋白，因此可以作为 IHC 中单层和复层上皮来源的判定工具 (1,2,4)。 抗体 AE1 能够与大部分亚组 A 细胞角蛋白的抗原决定簇发生反应，包括 Moll 分型(4) 中的 10、13、14、 15、16 和 19（分子量分别为 56.5、54'、50、50'、48 和 40 kDa），但是不包括编号为 12、17 和 18（分 子量分别为 55、47 和 45 kDa）的细胞角蛋白(4)。抗体 AE3 能够与亚组 B 细胞角蛋白的抗原决定簇发生 反应，包括编号为 1 和 2、3、4、5、6、7 和 8（分子量分别为 65、67、64、59、58、56、54 和 52 kDa） 的细胞角蛋白(5)。
5. Eichner R, Bonitz P, Sun T-T. Classification of epidermal keratins according to their immunoreactivity, isoelectric point and mode of expression. J Cell Biol 1984; 98:1388
C0520 Lipotap脂质体转染试剂
Lipotap脂质体转染试剂产品编号产品名称包装C0520 Lipotap脂质体转染试剂 0.6ml产品简介：Lipotap脂质体转染试剂(Lipotap Liposomal Transfection Reagent)是一种适合于把质粒或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸，以及核酸蛋白复合物或带负电荷的蛋白转染到培养的真核细胞中的高效阳离子脂质体转染试剂。
Lipotap还可以进行活体动物的细胞转染，用于基因治疗等。
为了实现在真核细胞中高效转染的目的，磷酸钙沉淀法、脂质体、阳离子聚合物、病毒、显微注射、电转等许多方法被发展起来。
但这些方法存在一个或多个缺点，包括有细胞毒性、重复性差、操作烦琐、转染效率相对较低或价格非常昂贵等。
碧云天独立研发的Lipotap脂质体转染试剂，尽量避免了上述缺点，实现了无明显细胞毒性、重复性好、操作简单、转染效率较高，并且价格非常优惠。
用Lipotap转染细胞后，对于大多数细胞，72小时内不更换培养液无明显细胞毒性。
Lipotap转染试剂是一种经过精心优化配制的阳离子脂质体。
Lipotap不仅适用于常规的质粒转染，也适用于siRNA转染。
和其它一些阳离子脂质体不同的是，使用Lipotap转染时血清的存在不影响转染效率，这样可以减小去除血清对细胞的损伤。
Lipotap对于贴壁细胞和悬浮细胞均适用，并且可以用于稳定表达细胞株的筛选。
Lipotap的转染效率可以通过转染表达EGFP或其它荧光蛋白的质粒进行快速鉴定。
关于不同的细胞转染试剂的主要特点和差异方面的比较，以及如何选择适当的细胞转染试剂，可参考碧云天的相关网页：/transfection.htm。
对于六孔板而言，一个包装的本转染试剂可以转染40个孔。
包装清单：产品编号产品名称包装C0520Lipotap脂质体转染试剂0.6ml－说明书 1 份保存条件：4℃保存，一年有效。
注意事项：使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率。
植物钙调磷酸酶CaN试剂盒使用说明书
植物钙调磷酸酶（CaN）试剂盒使用说明书目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中钙调磷酸酶（CaN）含量。
实验原理：植物钙调磷酸酶试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物钙调磷酸酶（CaN）水平。
用纯化的植物钙调磷酸酶（CaN）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入钙调磷酸酶（CaN）抗原，再与HRP标记的钙调磷酸酶（CaN）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的钙调磷酸酶（CaN）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物钙调磷酸酶（CaN）抗原浓度。
试剂盒内容及其配制：自备材料：1. 蒸馏水。
2. 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3. 振荡器及磁力搅拌器等。
样品收集、处理及保存方法：1、血清……操作过程中避免任何细胞刺激。
使用不含热原和内毒素的试管。
收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。
2、血浆……EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。
1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、细胞上清液……1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、组织匀浆……将组织加入适量生理盐水捣碎。
1000×g离心10分钟，取上清液。
5、保存……如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。
尽可能的不要使用溶血或高血脂血。
如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。
不要在37℃或更高的温度加热解冻。
应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
植物钙调磷酸酶试剂盒操作注意事项：● 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。
稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
● 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
磷酸钙-DNA共沉淀法的原理和步骤
磷酸钙-DNA共沉淀法的原理和步骤文章转自英格恩生物技术博客！前些时间有微友在平台上咨询细胞转染的事项，并对一篇博客文章《为什么磷酸钙转染并不稳定？为什么磷酸钙转染并不经济？》比较感兴趣。
在这里，对这位微友的疑惑进行更加全方位的了解，在此将磷酸钙转染的原理和步骤和大家分享，以供交流讨论。
核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形式出现时，可使 DNA 附在细胞表面，这有利于细胞吞入摄取核酸，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA，仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA 整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术可以用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。
该方法往往被用于贴壁细胞的转染。
1.试剂的配制(1)2×HBS 1.63 g NaCl ； 1.19g Hepes； 0.023 g Na2 PO4·2H2 O；加水至100 ml pH 7.1 过滤，4℃保存(2)2mmol/L CaCl2过滤除菌(3)TE：0.1mmol/L EDTA，1mmol/L Tris-HCL PH 8.0(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2 O至10mL过滤除菌4℃保存。
(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～ 800mg/L注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。
1.操作步骤(1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE 中，40mg/L。
(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。
如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104 /cm2 ,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。
Roche HP 转染试剂说明书
0910.06479774001ቢ
The recommended starting concentration is a 3:1. For most cell types, these X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent to DNA ratios provide excellent transfection efficiency. Further optimization may increase transfection efficiency in your particular application. In addition to varying the ratio, other parameters may also be evaluated, such as the amount of transfection complex added. For additional optimization guidelines, see Section 3, Troubleshooting and visit . Plasmid DNA • For best results, accurately determine the plasmid DNA concentration using 260-nm absorption; estimates of DNA by measuring gel band density are not recommended. Determine DNA purity using a 260 nm/280 nm ratio (the optimal ratio is 1.8). • Prepare the plasmid DNA solution using sterile TE (Tris/EDTA) buffer or sterile water at a concentration of 0.1 to 2.0 µg/µl. • Use high quality DNA preparation kits to obtain endotoxin-free DNA. Cell Culture Conditions • Minimize intra- and inter-experimental variance in transfection efficiency using cells that are regularly passaged, proliferating well in a log-growth phase, and plated at a consistent density. • For best results, accurately quantify cell concentration using a hematocytometer or automated system. • Cells must be healthy and free of Mycoplasma. • Cells should have a low passage number to achieve best results. Other Media Additives In some cell types, antimicrobial agents (e.g., antibiotics and fungicides) commonly included in cell-culture media may adversely affect the transfection efficiency of X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent. If possible, exclude additives in initial experiments. Once high-efficiency conditions have been established, these components can be added back while monitoring transfection results. Cell growth and/or transfection efficiency may be affected by variations in serum quality and medium formulations. Verification of Vector Function Optimize transfection conditions using a known positive-control reporter gene construct before transfecting cells with a new vector construct: • Determine transfection efficiency using a reporter gene assay, such as -Gal*, Luciferase*, or SEAP*. • Sequence flanking vector insert regions to verify the integrity of your new construct. 2.2 Transfection Procedure Adherent Cells: Plate cells approximately 24 hours before transfection making sure cells are at the optimal concentration in the appropriate cell culture vessel. Suspension Cells: Plate freshly passaged cells at optimal concentration.
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磷酸钙法细胞转染试剂盒
产品名称 磷酸钙法细胞转染试剂盒
包装 >200次
产品简介：
¾ 碧云天生产的磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)，在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上 进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性。用磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。
¾ HEK293或HEK293T细胞，即通常所谓的293细胞，是最适合磷酸钙法转染的细胞之一，优化条件后转染效率可以高达 90%以上；通常很容易达到40-50%左右的转染效率。大多数常见的细胞例如Hela细胞、CHO细胞等也都适合磷酸钙法转 染，但效率比293细胞要略低一些。
¾ 本试剂盒不仅适合于大多数贴壁细胞的转染，也适用于一些悬浮细胞的转染。 ¾ 本试剂盒提供的试剂都经无菌处理，可以直接使用。 ¾ 关于不同的细胞转染试剂的主要特点和差异方面的比较，以及如何选择适当的细胞转染试剂，可参考碧云天的相关网
2. 对于悬浮细胞： a) 离心收集悬浮细胞，用PBS洗涤一次。 b) 按照上面的步骤c)和d)制备DNA-氯化钙-BBS混合物。 c) 每106个细胞的沉淀，用100微升DNA-氯化钙-BBS混合物重新悬浮，室温放置20分钟。 d) 在一个6孔板孔内加入2毫升完全培养液，然后加入来自上一步的细胞-DNA-氯化钙-BBS混合物，混匀。
e) 在含5%二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养。 f) 根据实验要求和磷酸钙对于不同细胞的毒性不同，在4-16小时后离心收集细胞，用PBS洗一次，然后用2毫升完全培
养液重新悬浮细胞，继续培养。 g) 通常在转染约24小时后就可以检测到转染基因的表达。
使用本产品的文献：
1. Deng HP, Zhuang R, Jia W, Zhang Y, Zhang Y, Hu Y, Zhang XH, Jin BQ. Construction and expression of human CD226 extracellular domain 1 and domain 2 gene eukaryotic expression vectors and identif ication of the fusion proteins. Immunological journal. Sep 2007;Vol.23 No.5.
2. Shi JF, Li A, Rao GZ, Li Q. Con struct ion of the recombined adeno-a ssoc ia ted v ira l vector of hBM P-7 and transfection of dental pulp cells. Shaanxi Journal of Medicine.2008 Jan;Vol.37 No.1.
使ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ说明：
1. 对于贴壁细胞： a) 将细胞培养于培养皿或培养板内，通常在铺板后1-2天内长到70-80％满为宜。后续说明都按6孔板内一个孔进行说 明，如果有更多个孔或大小不相同的培养器皿，请自行换算。 b) 在转染前30-60分钟，吸去细胞培养液，加入新鲜的不含抗生素的完全培养液2毫升。注意：转染时最好使用新鲜配 制且pH值经过精心调校的培养液；转染用的培养液可以在配制后分装冻存，使用时再解冻。 c) 取2-6微克待转染的质粒DNA (质粒总体积不宜超过20微升)，加入到100微升氯化钙溶液中，混匀。 d) 把DNA-氯化钙溶液加入到100微升BBS溶液中，混匀，室温孵育10-20分钟。此时不会产生可见的沉淀。 e) 把DNA-氯化钙-BBS混合物均匀滴加到整个6孔板内。在含5%二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养。 f) 根据实验要求和磷酸钙对于不同细胞的毒性不同，在4-16小时后轻轻晃动培养板数次以充分悬浮一些磷酸钙沉淀， 吸去含磷酸钙沉淀的培养液，加入2毫升新鲜的完全培养液，继续培养。 g) 通常在转染约24小时后就可以检测到转染基因的表达。
旋。 ¾ 在用磷酸钙法转染细胞时应使用浓度不高于5%的二氧化碳，二氧化碳的最佳浓度为3%左右。 ¾ BBS溶液的pH值直接关系到转染效率，尽量避免把BBS溶液长时间暴露在空气中，以免被空气中的二氧化碳酸化。 ¾ 转染时由于质粒不同、细胞不同，最佳的质粒用量需自行摸索。 ¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
页：/transfection.htm。 ¾ 本试剂盒足够转染不少于200个细胞样品。
包装清单：
产品编号 C0508-1 C0508-2
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产品名称 BBS溶液 氯化钙溶液 说明书
包装 20ml 20ml 1份
保存条件：
-20℃保存，一年有效。
注意事项：
¾ 转染时，把DNA-氯化钙溶液加入到BBS溶液中，不要把BBS溶液加入到DNA-氯化钙溶液中。 ¾ 高纯度的质粒是获得高转染效率的必要条件，要确保A260/A280大于1.8，并且电泳检测抽提到的质粒90％以上都是超螺