原生质体融合技术概述 优质课件
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植物原生质体融合技术
要点二
细胞大规模培养
通过改进细胞培养技术，可以实现植物原生质体融合后细 胞的规模化培养，为快速繁殖和生产转基因植物提供有效 手段。
生物反应器与细胞工厂的优化
生物反应器设计
针对植物原生质体融合过程，可以设计和优 化生物反应器，实现融合过程的自动化和连 续化，提高融合效率和细胞质量。
细胞工厂构建
通过优化生物反应器中的培养条件和工艺参 数，可以构建高效细胞工厂，实现植物原生
技术应用领域
新品种培育
通过原生质体融合技术，可实现不同品种间 优良性状的整合，快速培育出新品种。
基因功能研究
通过原生质体融合技术，可研究植物细胞中 基因的表达和功能。
抗性改良
利用该技术改良植物的抗逆性，如抗旱、抗 病、抗虫等。
细胞器与细胞生物学研究
该技术可用于研究细胞器的结构和功能，以 及细胞分裂、分化的过程。
原生质体的诱导融合
电融合法
利用电场作用诱导原生质体融合，通 常在特定的电融合装置中进行，需要 在特定的电场强度和脉冲时间下进行 操作。
化学融合法
利用化学物质如聚乙二醇（PEG）等 诱导原生质体融合，通过调节PEG浓 度、pH值等参数来控制融合过程。
融合后细胞的筛选与培养
筛选
通过特定的筛选方法如荧光染色、抗性筛选等，从融合后的细胞群体中筛选出 具有优良性状的细胞。
植物原生质体融合技术
目录
CONTENTS
• 植物原生质体融合技术概述 • 植物原生质体融合技术的基本原理 • 植物原生质体融合技术的应用 • 植物原生质体融合技术的挑战与前景 • 案例研究 • 技术展望
01
CHAPTER
植物原生质体融合技术概述
定义与特点
原生质体融合技术的研究进展_PPT幻灯片
• 宋赵依等（2011）以非致病性尖镰孢F047和对西瓜枯萎菌 有抑制作用的植物内生放线菌SG2、生长较快并对尖孢镰 孢萎蔫专化型有抑制作用的重寄生链霉菌PR进行跨界原生 质体融合，经筛选获得的融合子生长速率和对多菌灵抗药 性均优于F047菌株。
三、原生质体融合的应用
• 在污水工程菌构建上的应用
• 许燕滨等（2005）采用原生质体融合技术，将两株具有含氯 有机化合物降解特性的菌假单胞菌T—l和诺卡氏菌RB-1融合 构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌，应用于造纸漂 白废水，融合菌去除CODCr和TCL的能力比混合菌分别提高 了72.05％和190％。
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育抗生素高产菌株
• 张琪等（2009）以红霉素高产茵HE-08-6及低产优组分茵 HA-08-20为出发菌株，其原生质体经紫外诱变后在适宜条 件下进行融合，得到了既保留了亲本HE-08-6的高产性状， 又保留了亲本HA-08-20的组分优良特性，而且具有较好的 传代稳定性优良融合菌株。
体融合的步骤和方法
三
微生物原生质体融合的应用
四
前景及展望
一、概述
• 原生质体：细胞内由原生质组成 的各种结构统称为原生质体，包 括细胞膜、细胞质(包括各种细胞 器、细胞骨架系统及胞基质)和细 胞核等部分,原生质体是由原生质 特化而来。
• 植物细胞即细胞壁内的原生质部 分；动物细胞就是原生质体。
• 吴萍等（2012）以刺糖多孢菌CB11（Saccharopolyspora spinosa CB11）与红霉素高产菌株红色糖多孢菌E2为亲本进 行种间原生质体融合，得到了遗传稳定性良好的高产融合
子S．spinosa X9，其多杀菌素产量可达290 mL，比亲本S．
三、原生质体融合的应用
• 在污水工程菌构建上的应用
• 许燕滨等（2005）采用原生质体融合技术，将两株具有含氯 有机化合物降解特性的菌假单胞菌T—l和诺卡氏菌RB-1融合 构建成一株高效降解含氯有机化合物工程菌，应用于造纸漂 白废水，融合菌去除CODCr和TCL的能力比混合菌分别提高 了72.05％和190％。
三、微生物原生质体融合的应用
• 选育抗生素高产菌株
• 张琪等（2009）以红霉素高产茵HE-08-6及低产优组分茵 HA-08-20为出发菌株，其原生质体经紫外诱变后在适宜条 件下进行融合，得到了既保留了亲本HE-08-6的高产性状， 又保留了亲本HA-08-20的组分优良特性，而且具有较好的 传代稳定性优良融合菌株。
体融合的步骤和方法
三
微生物原生质体融合的应用
四
前景及展望
一、概述
• 原生质体：细胞内由原生质组成 的各种结构统称为原生质体，包 括细胞膜、细胞质(包括各种细胞 器、细胞骨架系统及胞基质)和细 胞核等部分,原生质体是由原生质 特化而来。
• 植物细胞即细胞壁内的原生质部 分；动物细胞就是原生质体。
• 吴萍等（2012）以刺糖多孢菌CB11（Saccharopolyspora spinosa CB11）与红霉素高产菌株红色糖多孢菌E2为亲本进 行种间原生质体融合，得到了遗传稳定性良好的高产融合
子S．spinosa X9，其多杀菌素产量可达290 mL，比亲本S．
《原生质体融合育种》课件
原生质体融合育种
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原生质体制备与融合 • 原生质体融合育种技术应用 • 原生质体融合育种的优势与挑战 • 案例分析
01
引言
定义与特点
定义
原生质体融合育种是一种通过将不同植物的原生质体进行融合， 以创造具有优良性状的新品种的育种方法。
特点
能够打破物种间的遗传限制，实现种间遗传物质的重组和转移， 加速新品种的培育。
酶活性的提高
通过原生质体融合技术， 将酶活性提高的基因导入 微生物中，提高微生物产 酶的效率和活性。
04
原生质体融合育种的优势与挑战
优势
高遗传改造潜力
高效基因导入
原生质体融合能够打破物种间的生殖隔离 ，实现基因在不同物种间的转移，从而创 造出具有优良性状的新品种。
通过原生质体融合，可以将多个优良性状 集中到一个新品种中，实现高效基因导入 。
抗病性改良
将抗病基因导入动物细胞中， 提高动物的抗病能力，减少疾 病的发生。
在微生物育种中的应用
01
02
03
高产菌株的选育
通过原生质体融合技术， 将高产菌株进行杂交育种 ，获得具有优良性状的高 产菌株。
抗菌抗药性改良
将抗菌或抗药基因导入微 生物中，提高微生物的抗 菌或抗药性，用于医药、 农业等领域。
遗传稳定性差
由于原生质体融合打破了物种的遗传 稳定性，因此新品种的遗传稳定性较 差，容易发生变异。
法规限制
原生质体融合涉及到伦理和法规问题 ，需要进行严格的伦理审查和法规限 制。
未来发展方向
提高技术水平
未来需要不断提高原生质体融合 的技术水平，提高融合效率和遗 传稳定性。
拓展应用领域
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原生质体制备与融合 • 原生质体融合育种技术应用 • 原生质体融合育种的优势与挑战 • 案例分析
01
引言
定义与特点
定义
原生质体融合育种是一种通过将不同植物的原生质体进行融合， 以创造具有优良性状的新品种的育种方法。
特点
能够打破物种间的遗传限制，实现种间遗传物质的重组和转移， 加速新品种的培育。
酶活性的提高
通过原生质体融合技术， 将酶活性提高的基因导入 微生物中，提高微生物产 酶的效率和活性。
04
原生质体融合育种的优势与挑战
优势
高遗传改造潜力
高效基因导入
原生质体融合能够打破物种间的生殖隔离 ，实现基因在不同物种间的转移，从而创 造出具有优良性状的新品种。
通过原生质体融合，可以将多个优良性状 集中到一个新品种中，实现高效基因导入 。
抗病性改良
将抗病基因导入动物细胞中， 提高动物的抗病能力，减少疾 病的发生。
在微生物育种中的应用
01
02
03
高产菌株的选育
通过原生质体融合技术， 将高产菌株进行杂交育种 ，获得具有优良性状的高 产菌株。
抗菌抗药性改良
将抗菌或抗药基因导入微 生物中，提高微生物的抗 菌或抗药性，用于医药、 农业等领域。
遗传稳定性差
由于原生质体融合打破了物种的遗传 稳定性，因此新品种的遗传稳定性较 差，容易发生变异。
法规限制
原生质体融合涉及到伦理和法规问题 ，需要进行严格的伦理审查和法规限 制。
未来发展方向
提高技术水平
未来需要不断提高原生质体融合 的技术水平，提高融合效率和遗 传稳定性。
拓展应用领域
原生质体融合方法及原理
原生质体融合方法及原理一、原生质体融合方法。
1. 化学法。
- 聚乙二醇（PEG）融合法可是原生质体融合的常用化学方法哦。
PEG就像一个超级黏合剂呢。
它能使原生质体紧紧地挨在一起。
你想啊，原生质体原本都是单个儿的，PEG在那儿一搅和，就把它们拉到一块儿啦。
它会改变原生质体的膜结构，让膜上的一些分子重新排列，这样就创造了融合的条件。
就好像是给原生质体们牵红线，让它们有机会亲密接触然后融合在一起。
2. 物理法。
- 电融合法也很有趣呢。
想象一下，原生质体就像一个个小泡泡。
电融合的时候，就给它们加上一个电场。
这个电场就像是一个魔法力量，在合适的电场强度和脉冲时间下，原生质体的膜会被诱导发生极化。
膜上的电荷分布就变得不均匀啦，然后就会相互吸引。
就像小磁铁一样，“啪”地一下就贴到一起，然后就融合成一个新的原生质体啦。
二、原生质体融合原理。
1. 膜融合。
- 原生质体融合最关键的就是膜融合啦。
不管是化学法还是物理法，最终目的都是让原生质体的膜融合起来。
原生质体的膜是有流动性的，就像软软的果冻一样。
当受到外界的刺激，比如PEG的黏合作用或者电场的极化作用时，膜上的脂质分子和蛋白质分子就开始动起来啦。
它们会调整自己的位置，使得两个原生质体的膜能够逐渐靠近，然后融合成一个连续的膜，这样就把两个原生质体的内部物质包到一起啦。
2. 细胞内物质混合。
- 一旦膜融合了，两个原生质体里面的细胞质、细胞器这些东西就开始混合啦。
这就像是两个小伙伴把自己的宝贝都拿出来放到一起分享。
线粒体、叶绿体这些细胞器在新的原生质体里面开始重新组合和分配工作。
细胞核里面的遗传物质也在这个新的环境里可能会发生一些奇妙的变化呢，比如说基因的重组，就像把两盒不同的拼图碎片倒在一起重新拼一样，可能会拼出全新的图案，也就是产生新的性状啦。
原生质体融合就是这么一个充满神奇和惊喜的过程呀。
遗传学ppt课件第4章 原生质体培养及融合配色
优点：可得到较为纯净、完整的原生质体。
缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害， 因而活力高的原生质体较少。
B、离心沉淀法
酶解产物 +原生质 体培养基
0.45mol/L甘露醇 400g，5min
碎片带
原生体
利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然 后再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离
经酶液处理后，细胞壁被降解，释 放出球状原生质体。为使原生质体从组 织上解离下来，酶解的最后2小时需轻 度振荡，速度为45转/分（rpm）。
酶解液
酶解后的产物包括：
完整原生质体
破碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片 酶及其它不利于原生质体培养的试剂。
五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以
104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基
→ 固体增殖培养基 → 再分化培养基 → 器官、胚胎或植株分化。
培养方式详见第二节。
1）液体培养
分成三个阶段
➢ 培养基Ⅰ：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水 解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露 醇，pH 5.8
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害， 因而活力高的原生质体较少。
B、离心沉淀法
酶解产物 +原生质 体培养基
0.45mol/L甘露醇 400g，5min
碎片带
原生体
利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然 后再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离
经酶液处理后，细胞壁被降解，释 放出球状原生质体。为使原生质体从组 织上解离下来，酶解的最后2小时需轻 度振荡，速度为45转/分（rpm）。
酶解液
酶解后的产物包括：
完整原生质体
破碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片 酶及其它不利于原生质体培养的试剂。
五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以
104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基
→ 固体增殖培养基 → 再分化培养基 → 器官、胚胎或植株分化。
培养方式详见第二节。
1）液体培养
分成三个阶段
➢ 培养基Ⅰ：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水 解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露 醇，pH 5.8
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
第六章 原生质体融合
NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再 相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。
2 高pH(10.5)-高Ca离子法
1973年：Keller和Melchers用pH10.5的 50 mMCaCl2溶液在37℃时，诱 发烟草叶肉原生质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。
细胞质杂种
细胞质杂种只具有一个亲本的细胞核，而具 有两个亲本细胞质的遗传物质，细胞质杂种可用 来转移细胞质基因所决定的遗传性状，如胞质雄 性不育基因，抗除草剂基因及其对某些抗生素抗 性的特征，以及一些光合作用有关的特征，均可 通过胞质杂种来转移这些优良基因，因而在遗传 育种中具有重要意义。
非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一 亲本的少量核物质(1～2条染色体)和全部细胞 质融合； 细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一 亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同 的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因 组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物， 在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以 使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被 洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜 大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原 生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
原生质体的融合过程包括3个主要阶段：
1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合； 3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。
①凝聚作用阶段：
两个或两个以上原生 质体膜彼此靠近
②小区域融合阶段：
2 高pH(10.5)-高Ca离子法
1973年：Keller和Melchers用pH10.5的 50 mMCaCl2溶液在37℃时，诱 发烟草叶肉原生质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。
细胞质杂种
细胞质杂种只具有一个亲本的细胞核，而具 有两个亲本细胞质的遗传物质，细胞质杂种可用 来转移细胞质基因所决定的遗传性状，如胞质雄 性不育基因，抗除草剂基因及其对某些抗生素抗 性的特征，以及一些光合作用有关的特征，均可 通过胞质杂种来转移这些优良基因，因而在遗传 育种中具有重要意义。
非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一 亲本的少量核物质(1～2条染色体)和全部细胞 质融合； 细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一 亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同 的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因 组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物， 在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以 使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被 洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜 大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原 生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
原生质体的融合过程包括3个主要阶段：
1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合； 3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。
①凝聚作用阶段：
两个或两个以上原生 质体膜彼此靠近
②小区域融合阶段：
原生质体融合技术简介ppt课件
5
三 原生质体融合的过程
甲 解酶 融
乙
合
亲株 原生
再质体
生
融合体
再生
筛选 优化
6
•
遗传标记亲株筛选
•
原生质体制备
• 原生质体再生及再生频率计算
•
原生质体的融合
•
异核体检出
•
重组体检出和鉴定
• 重组体的形态，生理生化和遗传分析
7
1 标记菌株的筛选
• 用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以 便于重组体的检出。常用营养缺陷型和抗性作为 标记，也可以采用热致死，孢子颜色，菌落形态 作为标记。实际时究竟采用哪种遗传标记，要根 据实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是 为了进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因 的营养缺陷性或抗性菌株；如果从育种角度进行 原生质体融合，由于大多数营养缺陷性菌株都会 影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷性标 记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷 性菌株
11
• (1)渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不 仅起到保护原生质体免于膨胀作用，还有助于酶 和底物的结合。渗透压稳定剂多采用Kcl、NaCl等 无机物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸钠等有 机物。菌株不同，最佳稳定剂也有差异，在细菌 中多用蔗糖，丁二酸钠、NaCl等；在酵母菌中多 用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用Kcl和NaCl等。 稳定剂的使用浓度一般均在o．3一o．8mol/L之间。
• 1 杂交频率较高 • 由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融
合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 交频率都明显高于常规杂交方法。 • 2 受接合型或致育性的限制较小 • 由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用， 因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质 体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合 型或致育性的限制就比较小。 • 3 重组体种类较多 • 由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发 生相互接触．有机会发生多次交换，可以产生各种各样 的基因组合而得到多种类型的重组体
三 原生质体融合的过程
甲 解酶 融
乙
合
亲株 原生
再质体
生
融合体
再生
筛选 优化
6
•
遗传标记亲株筛选
•
原生质体制备
• 原生质体再生及再生频率计算
•
原生质体的融合
•
异核体检出
•
重组体检出和鉴定
• 重组体的形态，生理生化和遗传分析
7
1 标记菌株的筛选
• 用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以 便于重组体的检出。常用营养缺陷型和抗性作为 标记，也可以采用热致死，孢子颜色，菌落形态 作为标记。实际时究竟采用哪种遗传标记，要根 据实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是 为了进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因 的营养缺陷性或抗性菌株；如果从育种角度进行 原生质体融合，由于大多数营养缺陷性菌株都会 影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷性标 记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷 性菌株
11
• (1)渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不 仅起到保护原生质体免于膨胀作用，还有助于酶 和底物的结合。渗透压稳定剂多采用Kcl、NaCl等 无机物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸钠等有 机物。菌株不同，最佳稳定剂也有差异，在细菌 中多用蔗糖，丁二酸钠、NaCl等；在酵母菌中多 用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用Kcl和NaCl等。 稳定剂的使用浓度一般均在o．3一o．8mol/L之间。
• 1 杂交频率较高 • 由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融
合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 交频率都明显高于常规杂交方法。 • 2 受接合型或致育性的限制较小 • 由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用， 因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质 体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合 型或致育性的限制就比较小。 • 3 重组体种类较多 • 由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发 生相互接触．有机会发生多次交换，可以产生各种各样 的基因组合而得到多种类型的重组体
第十四章 植物原生质体融合技术与体细胞杂交
胶酶
• 1.3.2 影响原生质体产量与质量因素
• 产量高、质量好、活性强、能进行分裂并形成愈伤组织 或胚状体是原生质体培养成功的基础。
• 影响原生质体产量和质量的因素很多，主要是：
1、起始材料：物种、基因型、外植体
2、酶的种类及活性
3、酶液的渗透压 4、原生质膜的稳定剂 5、酶解时间与温度 6、分离与纯化方法
（2） 体细胞杂交的类型 植物细胞杂交按照所用亲本原生质体的性质可以分
为三类：
第一类为常用的体细胞杂交； 第二类是配子间细胞杂交； 第三类是配子－体细胞杂交。
A 第一类为常用的体细胞杂交，即用双亲的体细胞原
生质体或其衍生系统进行诱导融合，再经培养、筛选、
鉴定等步骤得到细胞杂种； B 第二类是配子间细胞杂交，即用双亲的性细胞原生 质体为融合亲本，其他步骤同第一类； B 第三类是配子－体细胞杂交，即一个融合亲本为性
3 原生质体培养
3. 1 原生质体培养基的选择
(1). 培养基种类的选择
原生质体培养基与细胞培养基相似，在细胞培养基上进行改良。 禾谷类：MS、N6等为基本培养基 十字花科和豆科：B5、KM、K8p、KM8p 茄科：MS、NT、K3
KPR培养基（Kao,1977）
成分 MgSO4· 2O 7H KC1 CaC12· 2O 2H KNO3 NH4NO3 KH2PO4 Sequestrene 330Fe MnSO4· 2O H ZnSO4· 2O 7H CuSO4· 2O 5H CoC12· 2O 6H 含量（mg / L） 成分 300 300 600 1 900 600 170 28 10.0 2.0 0.025 0.025 葡萄糖 果糖 核糖 木糖 甘露糖 鼠李糖 纤维二糖 山梨醇 甘露醇 丙酮酸钠 柠檬酸 含量（mg / L） 成分 68 400 125 125 125 125 125 125 125 125 5 10 盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素 D-泛酸钙 叶酸 对氨基苯甲酸 生物素 氯化胆碱 核黄素 抗坏血酸 维生素A 维生素D3 含量（mg / L） 1.0 10 0.5 0.2 0.01 0.005 0.5 0.1 1.0 0.005 0.005
• 1.3.2 影响原生质体产量与质量因素
• 产量高、质量好、活性强、能进行分裂并形成愈伤组织 或胚状体是原生质体培养成功的基础。
• 影响原生质体产量和质量的因素很多，主要是：
1、起始材料：物种、基因型、外植体
2、酶的种类及活性
3、酶液的渗透压 4、原生质膜的稳定剂 5、酶解时间与温度 6、分离与纯化方法
（2） 体细胞杂交的类型 植物细胞杂交按照所用亲本原生质体的性质可以分
为三类：
第一类为常用的体细胞杂交； 第二类是配子间细胞杂交； 第三类是配子－体细胞杂交。
A 第一类为常用的体细胞杂交，即用双亲的体细胞原
生质体或其衍生系统进行诱导融合，再经培养、筛选、
鉴定等步骤得到细胞杂种； B 第二类是配子间细胞杂交，即用双亲的性细胞原生 质体为融合亲本，其他步骤同第一类； B 第三类是配子－体细胞杂交，即一个融合亲本为性
3 原生质体培养
3. 1 原生质体培养基的选择
(1). 培养基种类的选择
原生质体培养基与细胞培养基相似，在细胞培养基上进行改良。 禾谷类：MS、N6等为基本培养基 十字花科和豆科：B5、KM、K8p、KM8p 茄科：MS、NT、K3
KPR培养基（Kao,1977）
成分 MgSO4· 2O 7H KC1 CaC12· 2O 2H KNO3 NH4NO3 KH2PO4 Sequestrene 330Fe MnSO4· 2O H ZnSO4· 2O 7H CuSO4· 2O 5H CoC12· 2O 6H 含量（mg / L） 成分 300 300 600 1 900 600 170 28 10.0 2.0 0.025 0.025 葡萄糖 果糖 核糖 木糖 甘露糖 鼠李糖 纤维二糖 山梨醇 甘露醇 丙酮酸钠 柠檬酸 含量（mg / L） 成分 68 400 125 125 125 125 125 125 125 125 5 10 盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素 D-泛酸钙 叶酸 对氨基苯甲酸 生物素 氯化胆碱 核黄素 抗坏血酸 维生素A 维生素D3 含量（mg / L） 1.0 10 0.5 0.2 0.01 0.005 0.5 0.1 1.0 0.005 0.005
微生物原生质体融合育种精品PPT课件
☺促融时间：促融时间增加可以使原生质体融合机会增多，但是，PEG对原 生质体有毒，为保证原生质体的再生能力，促融时间不宜过长。
☺无机离子：原生质体融合过程中需要一定量的 Ca2+和Mg2+促进融合， 而 K+、 Na+会显著降低融合率， 融合时一般 Ca2 +0 . 01 mol / L、 Mg2+0 . 02 mol / L 为佳。各菌种间略有差异。
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3、原生质体再生
原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生 。不同微生物的原生质体最 适再生条件存在一定的差异 ▪ 培养基：在再生培养基中会添加一些营养物质 这些物质可能是作为细胞壁 合成的前体物质 也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢 加速细胞壁合成的作用。 ▪ 菌龄：菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全， 营养供给不足再生能力也较低；菌龄长的原生质体再生率高。 ▪ Ca2+：Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与 活性。
过
低速离心数分钟
程
除去上清液，收集沉淀物
0.1 mol/L CaCl2洗涤两次 用融合液悬浮制备的融合体
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原生质体融合的影响因素
☺PEG浓度：PEG既是促融剂又是渗透压稳定剂，低浓度低分子量的PEG促 融效果不好，也容易导致原生质体破裂。但是高浓度的PEG会导致原生质 体收缩，降低融合频率，而且过高浓度的PEG对原生质体有毒害作用。一 般为40%。
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写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
☺无机离子：原生质体融合过程中需要一定量的 Ca2+和Mg2+促进融合， 而 K+、 Na+会显著降低融合率， 融合时一般 Ca2 +0 . 01 mol / L、 Mg2+0 . 02 mol / L 为佳。各菌种间略有差异。
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3、原生质体再生
原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生 。不同微生物的原生质体最 适再生条件存在一定的差异 ▪ 培养基：在再生培养基中会添加一些营养物质 这些物质可能是作为细胞壁 合成的前体物质 也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢 加速细胞壁合成的作用。 ▪ 菌龄：菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全， 营养供给不足再生能力也较低；菌龄长的原生质体再生率高。 ▪ Ca2+：Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与 活性。
过
低速离心数分钟
程
除去上清液，收集沉淀物
0.1 mol/L CaCl2洗涤两次 用融合液悬浮制备的融合体
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原生质体融合的影响因素
☺PEG浓度：PEG既是促融剂又是渗透压稳定剂，低浓度低分子量的PEG促 融效果不好，也容易导致原生质体破裂。但是高浓度的PEG会导致原生质 体收缩，降低融合频率，而且过高浓度的PEG对原生质体有毒害作用。一 般为40%。
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写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
(三)原生质体融合
二、原生质体融合育种程序
（一）直接亲本及遗传标记的选择 （二）原生质体的制备与再生 （三）原生质体融合 （四）融合体再生
（一）直接亲本及遗传标记的选择
一般把诱变谱系中筛选获得的不同正变 株作为直接亲本进行融合。 现在认为融合亲本应采用较大差异的近 亲菌株。
标记：营养缺陷型，抗性 热致死（灭活）孢子颜色菌落形态 遗传分析：采用营养缺陷型，抗性 提高产量：热灭活 荧光染色标记
酶解
过滤
离心 原生质体
培养基组成 Musilkova 等研究发现，黑曲霉在限制性培养 基或合成培养基中分离原生质体的数量会显著 增加。 放线菌只有在加入甘氨酸的培养基中培养后， 才能使酶类易于渗入和瓦解细胞壁。 ②菌体的培养方式 丝状菌常用平板玻璃纸法 细菌和酵母多用振荡沉没培养法。
①
（1）影响原生质体制备的因素
沉淀物用酶液悬浮水解去壁制成原生质体 高渗溶液洗涤原生质体 原生质体稀释后取适量放入无菌培养皿 培养皿移至紫外灯下诱变 再生培养基再生培养 分离优质菌株并遗传稳定性鉴定 菌种特性和发酵性能研究
出发菌株的培养和 原生质体制备
选择合适的化学诱变剂，配制成合适的浓度 加入原生质体悬浮液（含高渗溶液）
诱变处理 离心弃诱变剂、原生质体用稳定液洗涤
原生质体育种
Weibull 等于 1953 年首次用溶菌酶处理巨大芽 孢杆菌细胞获得原生质体，并首次提出原生质 体的概念。 Mcquillen 于 1955 年首次发现巨大芽孢杆菌原 生质体再生方法。 1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会 上提出原生质体融合。
与正常细胞相比，原生质体具有一些 新的独特的特性
再生培养基再生培养 分离优质菌株并遗传稳定性鉴定
第六章 原生质体融合
例如：
猴和小鼠 牛和大肠杆菌 苹果和番茄 马铃薯和番茄 人和小鼠细胞
二、原ห้องสมุดไป่ตู้质体融合的类型
1.依据所选用亲本原生质体的来源可分为：
①体细胞杂交：
双亲的体细胞原生质体进行融合
②配子－体细胞杂交：
融合亲本一个是体细胞原生质体，另一个为性 细胞原生质体。精卵细胞与体细胞原生质体融 合可获得三倍体杂种。
③融合阶段
原生质桥 扩展，融合完 成，形成球形 的异核体或同 核体。
4 电融合法
Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合
电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极， 一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变 电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一 条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电 击穿，从而导致融合。
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物， 在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以 使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被 洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜 大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原 生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
③配子间原生质体融合：
融合亲本为精卵细胞，精卵细胞的体外融合成
功，标志着高等植物受精过程的研究从此可以
置于人工控制的离体条件下进行。
原生质体融合的类型
2.依据所选用亲本原生质体的来源是否相同：
自发融合（仅限同一物种之内）
诱导融合（指应用某种诱变剂导致原 生质体融合的方法）
诱导融合
对称融合：是指两个完整的原生质体融合， 在融合子细胞内含有两个融合亲本全套染色 体和全部的细胞质。
原生质体融合技术简介
2 原生质体的制备
获得有活力、去壁较为完全的原生质体是原生质 体融合育种技术的先决条件。 在细菌和放线菌中，制备原生质体主要采用溶菌 酶；制备葡萄球菌的原生质体，则需用溶葡萄球 菌素处理；制备酵母菌的原生质体时， 一般可用 蜗牛酶；制备丝状真菌的原生质体时，可用蜗牛 酶，在丝状真菌的原生质体制备中很少单独使用 一种酶，而是采用两种或三种酶混合处理。 另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是 菌体的性质 ，酶的性质以及反应环境
(1)直接法 原生质体融合后直接分离到MM或SM上，即可 (1)直接法 原生质体融合后直接分离到MM或SM上，即可 直接检出融合细胞。其优点是只需一步就可得到重组体， 而大多数重组体是稳定的，缺点是难以检出那些表型延 迟而基因已重组的融合体。 (2)间接法 把融合产物分离到CM上，使原生质体再生， (2)间接法 把融合产物分离到CM上，使原生质体再生， 融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到SM上。其 融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到SM上。其 优点是能促使细胞更好地再生，表型延迟重组体容易检 出。缺点是需要两步才能检出重组体，需要相当大的人 力和物力，而且得到的重组体不大稳定。 直接法和间接法都要用营养缺陷性标记，所得重组体不 一定能提高目的产物的产量。 (3)钝化选择法 (3)钝化选择法 钝化选择法是指灭活原生质体和具活性原 生质体融合，把亲株中的一方（野生型）原生质体在 50° 热处理2 50°C热处理2-3小时，使融合前原生质体代谢途径中的 某些酶钝化不能再生，再与另一方（双缺陷性）原生质 体融合，并分离到mm上，灭活除用加热方法外，还可以 体融合，并分离到mm上，灭活除用加热方法外，还可以 用紫外或药物处理。
3 原生质体的再生
酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能 重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂， 这是原生质体融合育种的必要条件。仅有细胞质膜 的原生质体对渗透压很敏感、很容易破裂，致使原 生质外流而使细胞死亡。所以，再生培养基必须与 原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中 加入具有一定渗透压的基质，即渗透压稳定剂 原生质体的再生是一个非常复杂的过程．一些学者 研究认为，若原生质体的细胞壁剥去得不太彻底， 则有助于细胞壁的再生，残留的细胞壁尤如结晶时 的“晶种”一样。大量实验也证明，破壁太彻底往 晶种” 往会引起原牛质体再生率的大大率较高 由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融 合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 交频率都明显高于常规杂交方法。 2 受接合型或致育性的限制较小 由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用， 因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质 体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合 型或致育性的限制就比较小。 3 重组体种类较多 由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发 生相互接触．有机会发生多次交换，可以产生各种各样 的基因组合而得到多种类型的重组体
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1）热灭活：主要作用在细胞质中，使核糖体16S亚 基或核糖体RNA受到损伤。
2）紫外线灭活：致死损伤部位主要在DNA位点上。 3）化学药剂灭活：使细胞代谢过程中的某些关键酶
不可逆的失活，导致原生质体即使在适宜的条件 下仍然不能再生。
3.3灭活的机理 3.4灭活原生质体特点与应用
• 灭活机制
• 目前对灭活原生质体的融合机制还不很清楚。
2）不能互补融合形成重组体的原因 因为紫外线的 作用位点主要在原生质体的 DNA 上，而且不同 的细胞中作用位置可能有很大差别，这样双亲株 原生质体用紫外线灭活或分别用紫外线和温度灭 活，融合后损伤可以互补，而双亲株都用热灭活， 可能在不同的细胞中作用位点差别不大。所以不 能互补融合形成重组体。
• 3）在单亲灭活原生质体融合中，有人认为可以实现遗传 物质的单向传递，被灭活亲株起供体作用。但是在双亲灭 活原生质体融合时，二亲株都以零或接近零的存活率被灭 活，仍可以相当高的频率形成重组体，说明灭活的原生质 体仍可以起到受体作用， 否则不能形成重组体。 因此认 为只有损伤互补才能较为圆满地解释灭活融合。
• 计算方法：常用的是血球计数板记数法。 • 原生质体形成率(% )=(酶解前的菌落数-酶解后的菌落数）
/酶解前的菌落数×100%。
3、灭活原生质体融合
3.1亲本及其遗传物质的标记选择
常用的有带隐性性状的营养缺陷性和抗性标记， 还有热致死（灭活），孢子颜色和菌落形态。目 前比较好的是灭活标记。
• 3.2常用的灭活标记方法：
原生质体融合技术的优点
1）可实现常规杂交方法无法做到的种间、属间、门间 甚至跨界的远缘杂交；
2）并可以大幅度提高亲本之间的重组频率，集中双亲 株优良性状的机会更大。
3）与常规杂交技术相比，原生质体融合时亲本整套染 色体参与交换,遗传物质转移和重组性状较多,集中双亲本 优良性状机会更大，为异源DNA片段交叉互换创造一个 优良的环境；
• 而且酶量过大会使细菌脱壁太彻底，失去了原生质体再生 时合成细胞壁的引物，易使菌体凝集，降低原生质体的再 生率。
酶解时间对原生质体制备的影响
• 充足的酶解时间是细菌原生质体化的必要条件，原生质体 形成率随酶解时间延长而增加，但再生率会由于随酶解时 间过长导致细胞壁脱壁彻底无法再生而降低。
• 原因可能是酶解超过某一临界值后，细胞壁消化过于充分 使细胞破裂或失去再生能力，从而导致再生率的降低再生 培养基的组分也是影响原生质体再生的一个重要因素。
• 因此要控制好原生质体制备时的酶解时间。
甘氨酸浓度对原生质体制备的影响
• 在培养基中添加一定浓度的甘氨酸培养后，易于使细胞壁 的网状结构松动，释放原生质体，可有效促进菌丝体细胞 壁形成对溶菌酶敏感的结构，提高制备的原生质体质量;
• 添加甘氨酸后，发酵液的状态也有所改变，菌丝结块、挂 壁现象减少，菌丝分散更加均匀。
酶解温度对原生质体制备的影响
• 不同的酶具有各自不同的最适温度，同时还要注意菌株生 长的最适温度，以避免因温度不当而导致原生质体活性降 低，甚至破坏，因此确定酶解温度通常要二者兼顾，这对 水解细胞壁是至关重要的。一般酶解温度控制在20~40度。
Байду номын сангаас
酶浓度对原生质体制备的影响
• 原生质体形成率在一定范围内与溶菌酶的浓度成正比。当 浓度过高溶菌酶作用于原生质体时，形成率得到提高高， 但溶菌酶中往往含有一些对原生质体有害的酶类（如过氧 化物酶、核糖核酸酶等），因此，当达到一定浓度时，必 然会严重地影响原生质体的活性；
• 但过高的甘氨酸浓度会抑制菌体的正常生长而得不到足够 的菌丝体。
渗透压对原生质体制备的影响
• 原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透 压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存；
• 在低渗溶液中，原生质体将会破裂而死亡，对于不同的菌 种，采用的渗透压稳定剂不同。
2.3原生质体形成率的计算
4）大幅度提高亲本之间重组频率，扩大了重组的亲本 范围。
2、原生质体的制备
• 2.1 原生质体融合技术的过程
原生质体融合技术一般包括标记菌株的筛选、原生质体制备、培 养、融 合、再生, 原生质体转化等。
原生质体的制备首先要去除细胞壁,当前去壁的方法主要有机械法、 非酶法和酶法, 现在使用较多的为酶法。 • 2. 2 原生质体制备条件的确定 具体包括： 1）酶解温度； 2）酶浓度； 3）酶解时间； 4）甘氨酸； 5）渗透压； 6）菌龄；
原生质体融合技术
学号：11110010127 姓名：魏福静
原生质体融合技术
• 1、原生质体融合技术的发展 • 2、原生质体的制备 • 3、原生质体形成率的计算 • 4、灭活原生质体融合 • 5、原生质体融合的方法 • 6、原生质体融合技术应用与展望
1、原生质体融合技术发展简介
• 原生质体融合技术育种( protoplast fusion)是20世纪 70年代发展起来的基因重组技术。通过两个遗传性状不同 的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。从1960年法国 的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了 自发融合现象到1979年匈牙利的Pesti提出了运用融合育 种技术提高青霉素的产量,原生质体融合技术的成熟使得开 始了在微生物育种实际工作中的应用。
灭活原生质体融合技术的特点
• 1）灭活原生质体融合，特别是双亲灭活原生质体融合， 省去了使出发菌株获得稳定遗传标记的过程， 灭活亲株 原生质体的方法又易于掌握；
• 2）可以在不利用选择培养基的情况下， 排除了双方亲本 类型的再生产物， 有利于选择重组融合子， 提高了筛选 效率。
• 1）Wright 的损伤互补原则 Wright使用不同的生化药 剂分别灭活两株动物细胞，融合后得到了活的杂交细胞， 他认为这是由于两株细胞的致死损伤得到了互补的结果。 Fodor等热灭活带有标记的 B.megaterium 的二个亲株原 生质体，经PEG 诱导后未获得融合子。李焕娄等在研究弗 氏链霉菌的株间灭活原生质体融合时发现，当两亲株的原 生质体分别用热和紫外线，或都用紫外线灭活，然后进行 融合，而两亲株都用热灭活时，未能获得重组体。这些实 验都支持了Wright 的损伤互补原则。
2）紫外线灭活：致死损伤部位主要在DNA位点上。 3）化学药剂灭活：使细胞代谢过程中的某些关键酶
不可逆的失活，导致原生质体即使在适宜的条件 下仍然不能再生。
3.3灭活的机理 3.4灭活原生质体特点与应用
• 灭活机制
• 目前对灭活原生质体的融合机制还不很清楚。
2）不能互补融合形成重组体的原因 因为紫外线的 作用位点主要在原生质体的 DNA 上，而且不同 的细胞中作用位置可能有很大差别，这样双亲株 原生质体用紫外线灭活或分别用紫外线和温度灭 活，融合后损伤可以互补，而双亲株都用热灭活， 可能在不同的细胞中作用位点差别不大。所以不 能互补融合形成重组体。
• 3）在单亲灭活原生质体融合中，有人认为可以实现遗传 物质的单向传递，被灭活亲株起供体作用。但是在双亲灭 活原生质体融合时，二亲株都以零或接近零的存活率被灭 活，仍可以相当高的频率形成重组体，说明灭活的原生质 体仍可以起到受体作用， 否则不能形成重组体。 因此认 为只有损伤互补才能较为圆满地解释灭活融合。
• 计算方法：常用的是血球计数板记数法。 • 原生质体形成率(% )=(酶解前的菌落数-酶解后的菌落数）
/酶解前的菌落数×100%。
3、灭活原生质体融合
3.1亲本及其遗传物质的标记选择
常用的有带隐性性状的营养缺陷性和抗性标记， 还有热致死（灭活），孢子颜色和菌落形态。目 前比较好的是灭活标记。
• 3.2常用的灭活标记方法：
原生质体融合技术的优点
1）可实现常规杂交方法无法做到的种间、属间、门间 甚至跨界的远缘杂交；
2）并可以大幅度提高亲本之间的重组频率，集中双亲 株优良性状的机会更大。
3）与常规杂交技术相比，原生质体融合时亲本整套染 色体参与交换,遗传物质转移和重组性状较多,集中双亲本 优良性状机会更大，为异源DNA片段交叉互换创造一个 优良的环境；
• 而且酶量过大会使细菌脱壁太彻底，失去了原生质体再生 时合成细胞壁的引物，易使菌体凝集，降低原生质体的再 生率。
酶解时间对原生质体制备的影响
• 充足的酶解时间是细菌原生质体化的必要条件，原生质体 形成率随酶解时间延长而增加，但再生率会由于随酶解时 间过长导致细胞壁脱壁彻底无法再生而降低。
• 原因可能是酶解超过某一临界值后，细胞壁消化过于充分 使细胞破裂或失去再生能力，从而导致再生率的降低再生 培养基的组分也是影响原生质体再生的一个重要因素。
• 因此要控制好原生质体制备时的酶解时间。
甘氨酸浓度对原生质体制备的影响
• 在培养基中添加一定浓度的甘氨酸培养后，易于使细胞壁 的网状结构松动，释放原生质体，可有效促进菌丝体细胞 壁形成对溶菌酶敏感的结构，提高制备的原生质体质量;
• 添加甘氨酸后，发酵液的状态也有所改变，菌丝结块、挂 壁现象减少，菌丝分散更加均匀。
酶解温度对原生质体制备的影响
• 不同的酶具有各自不同的最适温度，同时还要注意菌株生 长的最适温度，以避免因温度不当而导致原生质体活性降 低，甚至破坏，因此确定酶解温度通常要二者兼顾，这对 水解细胞壁是至关重要的。一般酶解温度控制在20~40度。
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酶浓度对原生质体制备的影响
• 原生质体形成率在一定范围内与溶菌酶的浓度成正比。当 浓度过高溶菌酶作用于原生质体时，形成率得到提高高， 但溶菌酶中往往含有一些对原生质体有害的酶类（如过氧 化物酶、核糖核酸酶等），因此，当达到一定浓度时，必 然会严重地影响原生质体的活性；
• 但过高的甘氨酸浓度会抑制菌体的正常生长而得不到足够 的菌丝体。
渗透压对原生质体制备的影响
• 原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透 压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存；
• 在低渗溶液中，原生质体将会破裂而死亡，对于不同的菌 种，采用的渗透压稳定剂不同。
2.3原生质体形成率的计算
4）大幅度提高亲本之间重组频率，扩大了重组的亲本 范围。
2、原生质体的制备
• 2.1 原生质体融合技术的过程
原生质体融合技术一般包括标记菌株的筛选、原生质体制备、培 养、融 合、再生, 原生质体转化等。
原生质体的制备首先要去除细胞壁,当前去壁的方法主要有机械法、 非酶法和酶法, 现在使用较多的为酶法。 • 2. 2 原生质体制备条件的确定 具体包括： 1）酶解温度； 2）酶浓度； 3）酶解时间； 4）甘氨酸； 5）渗透压； 6）菌龄；
原生质体融合技术
学号：11110010127 姓名：魏福静
原生质体融合技术
• 1、原生质体融合技术的发展 • 2、原生质体的制备 • 3、原生质体形成率的计算 • 4、灭活原生质体融合 • 5、原生质体融合的方法 • 6、原生质体融合技术应用与展望
1、原生质体融合技术发展简介
• 原生质体融合技术育种( protoplast fusion)是20世纪 70年代发展起来的基因重组技术。通过两个遗传性状不同 的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。从1960年法国 的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了 自发融合现象到1979年匈牙利的Pesti提出了运用融合育 种技术提高青霉素的产量,原生质体融合技术的成熟使得开 始了在微生物育种实际工作中的应用。
灭活原生质体融合技术的特点
• 1）灭活原生质体融合，特别是双亲灭活原生质体融合， 省去了使出发菌株获得稳定遗传标记的过程， 灭活亲株 原生质体的方法又易于掌握；
• 2）可以在不利用选择培养基的情况下， 排除了双方亲本 类型的再生产物， 有利于选择重组融合子， 提高了筛选 效率。
• 1）Wright 的损伤互补原则 Wright使用不同的生化药 剂分别灭活两株动物细胞，融合后得到了活的杂交细胞， 他认为这是由于两株细胞的致死损伤得到了互补的结果。 Fodor等热灭活带有标记的 B.megaterium 的二个亲株原 生质体，经PEG 诱导后未获得融合子。李焕娄等在研究弗 氏链霉菌的株间灭活原生质体融合时发现，当两亲株的原 生质体分别用热和紫外线，或都用紫外线灭活，然后进行 融合，而两亲株都用热灭活时，未能获得重组体。这些实 验都支持了Wright 的损伤互补原则。