植物细胞培养

常见的几种固定化培养系统 流化床生物反应器： 流化床生物反应器 细胞包裹在胶粒、泡沫颗粒中，通入空 气使固定化细胞悬浮于反应器中； 填充床生物反应器： 填充床生物反应器： 细胞固定在胶粒、泡沫颗粒或连续的多 个网中，细胞固定不动通过流动的培养液 传质； 膜生物反应器： 膜生物反应器： 常见的是中空纤维和螺线式卷绕反应器， 传质效率低，易阻塞，产物收获较困难， 投资大。
（二）化学方法
1、饥饿法：控制营养使细胞处于饥饿状态， 、饥饿法：控制营养使细胞处于饥饿状态， 后加营养培养； 后加营养培养； 2、有丝分裂抑制法：向培养液中加入化学抑 、有丝分裂抑制法： 制剂抑制细胞分裂，包括尿苷、 制剂抑制细胞分裂，包括尿苷、秋水仙素
五、一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足 三个条件： 三个条件： 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小； 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小； 分散性良好 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致 均一性好 相同； 相同； 细胞生长迅速（2～3天加倍）。 细胞生长迅速（ 生长迅速 天加倍）。
1）、细胞的驯化、筛选与细胞株的建立 ）、细胞的驯化、筛选与细胞株 细胞株的建立 ）、细胞的驯化 愈伤组织的诱导与培养 单细胞的分离（机械或酶解法） 细胞无性系的分离（过滤涂板培养） 细胞株的筛选（选疏松长势好的细胞 株， 并测定细胞代谢物含量）
适合大规模培养的细胞株应具备何条件？ 适合大规模培养的细胞株应具备何条件？ 细胞株应具备何条件
（三）、植物细胞生物反应器 ）、植物细胞生物反应器
生物反应器的特点： 生物反应器的特点 在可控制条件下（物理和化学），细 在可控制条件下（物理和化学），细 ）， 胞得到大规模培养（工作体积大），而且 胞得到大规模培养（工作体积大），而且 ）， 单位体积生产能力高。 单位体积生产能力高。
1、植物细胞培养特性
类型 气升搅拌式 机械搅拌式 鼓泡式 溶氧 高 中 中 破坏性 混合度 低 强 低 均匀 较均匀 不均匀 限制因素 细胞浓度高时有死角 细胞浓度高时混合不匀 有死角，发生细胞沉降 有死角，
悬浮培养系统
机械搅拌式
气升搅拌式
2）、固定化培养系统 ）、固定化培养系统 ）、 特点： 特点：细胞固定而培养液循环流动 按照其支持物不同可以分为两大类： 按照其支持物不同可以分为两大类： 支持物不同可以分为两大类 A、包埋式固定化培养系统：琼脂、琼 包埋式固定化培养系统：琼脂、 固定化培养系统 脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺； 脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺； 附着式固定化培养系统 尼龙网、 固定化培养系统： B、附着式固定化培养系统：尼龙网、 聚氨酯泡沫、中空纤维。 聚氨酯泡沫、中空纤维。
2、化学方法 、
是在细胞悬浮培养中加入草酸盐 加入草酸盐（能结合细 加入草酸盐 胞间质中果胶钙的钙离子 ）、秋水仙素 秋水仙素 （0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白 水解乳蛋白（对细胞分 水解乳蛋白 散有一定的作用）。
3、酶法 、
利用果胶酶和纤维素酶 果胶酶和纤维素酶使细胞分离。 果胶酶和纤维素酶
六、悬浮细胞培养方法
分批培养法 半连续培养法 连续培养法
分批培养法： 分批培养法 ● 是一种封闭的培养体系，培养过程 中不放出培养液，也不补加培养液； ● 培养方法：旋转培养；往返培养； 旋转振动；搅动培养；
半连续培养法
在培养过程中，每隔一定时间更换一部 分培养液或添加某种营养成分。
连续培养法
生长速度快； 生长速度快； 目的代谢产物含量高； 目的代谢产物含量高； 适合悬浮细胞培养。 适合悬浮细胞培养。
2）、扩大培养 ）、扩大培养 ）、 逐级放大，用作培养的种子； 细胞株鉴定：经常鉴定，防止细胞株退化 和变异。 3）、生物反应器培养 ）、生物反应器培养 ）、 培养方式同微生物，可以是分批培养、 半连续培养、连续培养。
4、 、
优点：可以连续观察 连续观察细胞的分化和发育； 连续观察 缺点：通气性差，水分难保持，pH易变动。
5 、悬浮细胞培养： 将细胞接种于液体培养基中培养。 （单独讲解）
第二节、 第二节、悬浮细胞培养
悬浮培养(suspension culture): 是指将单个游离细胞或小细胞团 单个游离细胞或小细胞团 在液体培养基 液体培养基中进行培养增殖的技术。 液体培养基
细胞本身的特性 细胞培养液的流变特性 培养过程的气体传递与影响 泡沫与器壁表面黏附性 细胞分裂与愈伤组织的形成 悬浮细胞分批培养生长特点
）、细胞本身的特性 （1）、细胞本身的特性 ）、
细胞体积比微生物细胞大（10－200m）, 是微生物细胞的30－100倍； 植物细胞生长速度慢； 植物细胞壁易受机械剪切力的影响； 细胞常以非均相集合细胞团的方式生长
优点： 优点：
简便、 简便、成功率高
缺点： 缺点：
不能在显微镜 下直接观察
此法适用于难于培养的植物种类 此法适用于难于培养的植物种类 难于培养
3、液体浅层培养
技术：先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸 管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右， 石蜡膜封口，静置培养。 优点： 、培养物与空气接触面大，通气性好； 、细胞代谢产物容易扩散，不会造成有害 物质的危害； 、继代培养方便、便于观察。 缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察
）、悬浮细胞分批培养生长特点 （6）、悬浮细胞分批培养生长特点 ）、
延迟期：也叫适应期，细胞很少分裂 对数生长期：细胞开始分裂，并以几何级数增加 减缓期：细胞分裂减速 静止期（稳定期）：生成的和死亡的细胞数目达 到平衡，总数不变 衰亡期：细胞加快死亡
2、生物反应器培养过程： 、生物反应器培养过程：
八、细胞的保存
继代培养保存法： 细胞定期继代培养，常用； 低温保存法： 5－10度温度下培养并定期更换培养液； 冰冻保存法： 分为低温保存（－20度）和超低温保存 （液氮保存）
第三节、植物细胞培养的应用
植物细胞含有人类所需的成分，包括 初生代谢物（蛋白质、碳水化合物、 初生代谢物（蛋白质、碳水化合物、脂 肪等） 次生代谢物（多酚类、香精油、 肪等）和次生代谢物（多酚类、香精油、 生物碱、树脂等），传统提取分离这些 生物碱、树脂等），传统提取分离这些 ）， 物质由于资源短缺和需求量的加大， 物质由于资源短缺和需求量的加大，难 以满足需求， 以满足需求，通过细胞培养生产植物产 品成为解决的有效途径。 品成为解决的有效途径。
（一）、细胞培养的主产品 ）、细胞培养的主产品
1、药用代谢产物 、 生物碱（吡啶、喹啉）、蛋白质类 生物碱 蛋白质类 （氨基酸、植物抗生素、）、酚类化合物 酚类化合物 （黄酮类、单酚类、醌类）、萜类化合物 萜类化合物 （三萜皂甙、甾体皂甙、单萜、倍半萜、 二萜）等。 例子： 豆杉细胞 紫草细胞 紫杉醇（抗癌药物） 紫杉醇 紫草宁（烧伤、痔疮） 紫草宁
一、悬浮培养的过程： 悬浮培养的过程：
二、悬浮培养的优点：
一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善 改善 营养供应； 营养供应 二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有 有 害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害； 害物质 三是振荡培养可以适当改善气体的交换 改善气体的交换； 改善气体的交换
三、悬浮培养过程中细胞生长情况分析 测定方法：
2、影响生物反应器细胞培养的主要因素 、
1）、细胞遗传特性 ）、细胞遗传特性 ）、 取材部位、细胞株的选择 2）、培养的环境条件 ）、培养的环境条件 ）、 主要因素包括光照、温度、搅拌与混合、 通气、营养盐、pH、调节因子
3、生物反应器培养系统 、
悬浮培养系统 固定化培养系统
1）、悬浮培养系统 ）、悬浮培养系统 ）、
二、单细胞的培养方法
平板培养 看护培养 液体浅层培养 微室培养（微滴培养）
1、平板培养 、 定义： 将一定量细胞接种到或混合到装有 一薄层固体培养基的培养皿内进行培养 的方法。
技术要点： 单细胞悬浮液的制备：先过滤细胞悬浮 液，去掉全部组织块和大的细胞团，获得 含单细胞或4-6个的细胞团的悬浮液 调节细胞密度； 固体培养基的制备； 接种细胞：把单细胞悬浮液转移到琼脂 平板上，铺成大约1mm的薄层，然后观察 细胞植板率。
（二）、细胞培养技术的优点 ）、细胞培养技术的优点
1、培养细胞是在无菌条件下生长的,不受地 、培养细胞是在无菌条件下生长的 不受地 无菌条件下生长的 季节和气候限制； 区、季节和气候限制； 2、占地面积少； 、占地面积少； 3、天然产物的生产在控制的条件下进行 可 控制的条件下进行 、天然产物的生产在控制的条件下进行,可 以得到超越整体植物产量的代谢产物； 以得到超越整体植物产量的代谢产物； 4、能够产生原植物所没有的，甚至是至今在 、能够产生原植物所没有的， 自然界还没有的化合物。 自然界还没有的化合物。
通过控制连续添加和排出的新老营养液的 量，维持培养液体积恒定，据操作的不同又 可分为封闭式和开放式 封闭式和开放式两种。 封闭式和开放式 封闭式： 封闭式：回收流出的细胞于培养系统中， 细胞数目增加
●
开放式： 开放式：流出的细胞不回收于培养系统 中，但进行细胞收获
●
七、影响悬浮细胞生长的因素： 起始愈伤组织的质量； 接种细胞密度； 培养条件：方式、温度； 继代周期。
植板率：它以能长出细胞团的单细胞在接 种单细胞中所占的比例来表示。 形成的细胞团数 植板率(％)＝ ×100％ 接种的细胞数
优点：便于定点观察； 缺点：通气性较差。
2、看护培养
1953年Muir创立； 定义：是指用一块活跃生长 活跃生长的愈伤组织来 活跃生长 看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一 种培养方法； 具体方法 具体方法：将单个Baidu Nhomakorabea胞接种于滤纸上，再 置于愈伤组织上培养。
第四章 植物细胞培养
本章主要内容
单细胞的分离与培养 悬浮细胞培养 植物细胞培养的应用
第一节、 第一节、单细胞的分离与培养
一、分离单细胞的方法 1、物理方法 2、化学方法 3、酶法
1、物理方法 、
将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经摇 摇 床不断振动，使细胞分散。若向细胞悬浮液中吹 床不断振动，使细胞分散 入脉冲压缩气体，细胞分散的更好 。
1、细胞计数：单位体积细胞浓度； 2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占 的体积； 3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重
四、悬浮细胞培养的同步化方法 （一）物理方法
（二）化学方法
（一）物理方法
1、体积选择法：将培养细胞经过一定大小的 、体积选择法： 筛网过滤，对细胞按大小分别进行收集。 筛网过滤，对细胞按大小分别进行收集。 2、冷处理法：先收集细胞，后在低温（一般 、冷处理法：先收集细胞，后在低温（ 为4度）下处理一定时间后加培养液培养。 度 下处理一定时间后加培养液培养。
2、天然食品、食品添加剂 、天然食品、 色素（胡萝卜素、叶黄素、单宁）、甜 味剂（甜菊苷）、香料物质、饮料（可可 碱、咖啡碱）等； 3、杀虫剂、杀菌剂 、杀虫剂、 万寿菊细胞中获得农药噻吩烷；鹰嘴豆细 胞中得到除虫菊脂；香草细胞中分离到鱼 藤酮杀虫剂等； 4、饲料、精细化工产品 、饲料、 桑细胞培养 银胶菌细胞培养 养蚕饲料 橡胶
）、泡沫与器壁表面黏附性 （4）、泡沫与器壁表面黏附性： ）、泡沫与器壁表面黏附性： 植物细胞在培养过程中易分泌黏多糖、 蛋白质等物质导致黏度增大； 植物培养过程中易产生大量气泡。
对策： 利用消泡剂和在器皿表面涂抹硅油 消泡剂和在器皿表面 利用消泡剂和在器皿表面涂抹硅油
）、细胞分裂与愈伤组织的形成 （5）、细胞分裂与愈伤组织的形成 ）、 单个细胞3－5天内可观察到细胞分裂，根 据培养的目的不同选取策略： 快繁种苗：细胞分裂长成小细胞团后形成 快繁种苗 小愈伤组织块，然后转到分化培养基上培养； 生产细胞代谢产物：分散细胞团，保持细 生产细胞代谢产物 胞分裂
）、细胞培养液的流变特性 （2）、细胞培养液的流变特性 ）、 体现在两方面： 首先，细胞培养中易结团 其次，细胞培养过程中易产生黏多糖等物 质，降低传氧速度，影响细胞生长。 ）、培养过程的气体传递与影响 （3）、培养过程的气体传递与影响 ）、 植物细胞培养需通过光合作用，植物细 胞都好氧，因此培养过程需注意o2和co2的 供应及比例关系。