芸香苷和槲皮素

槐花米中芸香苷提取及槲皮素的分离与检识[适用对象]药学专业

[实验学时] 18学时

一、实验目的

学习黄酮类化合物的提取、分离和检识，通过实验要求：

（1）通过芸香苷提取与精制，掌握沸水提取黄酮类化合物的原理和操作。

（2）掌握由芸香苷水解制取槲皮素的方法。

（3）掌握黄酮苷和黄酮苷元的分离。

（4）掌握黄酮类化合物的主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分的检识方法。

二、实验原理

由槐花中提取芸香苷的方法很多，本实验是根据芸香苷在冷水和热水中的溶解度差异的特性进行提取和精制，或根据芸香苷分子中具有酚羟基，显弱酸性，能与碱成盐而增大溶解度，以碱水为溶剂煮沸提取，其提取液加酸酸化后则芸香苷游离析出。

三、仪器设备

单口园底烧瓶，冷凝管，铁架台，烧杯，电炉，烘箱、水浴锅、三角烧瓶，微量抽滤器，布氏漏斗，滤纸，试管，层析槽，石棉网，毛细管等。

四、相关知识点

槐花为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾，主要含

芸香苷（芦丁），含量高达12~20%，水解生成槲皮素、葡萄糖及鼠李糖。

芸香苷（rutoside ），分子式C 27 H 30 O 16，分子量610.51，淡黄色针状结晶，mp.177~178℃。难溶于冷水（1﹕8000），略溶于热水（1﹕200），溶于热甲醇（1﹕7），冷甲醇（1﹕100），热乙醇（1﹕30），冷乙醇（1﹕650），难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等，易溶于吡啶及稀碱液中。

槲皮素（quercetin ），分子式C 15 H 10 O 7，分子量302.23，黄色针状结晶，mp.314℃（分解）。溶于热乙醇（1﹕23），冷乙醇（1﹕300），可溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、氯仿、乙醚中，几不溶于水。 O

O O H OH OH

OH

OR

五、实验步骤

（一）芸香苷的提取（水提取法）

称取槐花米50克，置1000 ml 烧杯中，加沸水800 ml ，加热保持微沸1小时，趁热用棉花过滤，滤渣再加600 ml 水煮沸1小时，趁热过滤，合并2次滤液，放置夜，析出大量淡黄色沉淀，抽滤，沉淀用水洗3~4次，抽干置于空气中干燥即得粗芸香苷，称重计算得率。

（二）芸香苷的水解

称取芸香苷粗品2克，尽量研细，投入500 ml圆底烧瓶中，加2%H2SO4溶液150 ml，接上冷凝管，直火加热煮沸1.5小时，滤取沉淀物（即苷元槲皮素），滤液保留以鉴定糖部分，槲皮素沉淀经水洗涤抽干，自然干燥，称重并计算水解得率。

（三）芸香苷、槲皮素重结晶

称取芸香苷粗品2克，加甲醇50 ml，加热溶解，趁热过滤，滤液浓缩一半，放置析晶，过滤。滤液适当浓缩后放置，复析出结晶，滤取结晶。必要时结晶再用甲醇重结晶一次。

取槲皮素全部，加适量95%乙醇，同上法重结晶一次。

（四）芸香苷、槲皮素和糖的纸色谱鉴定

1、点样：取新华一号色谱滤纸，规格20 cm×20 cm，在滤纸下端约2 cm处用铅笔画一直线，间隔2 cm分别点上下列样品或标准溶液：

（1）糖样品溶液（2）标准葡萄糖溶液

（3）标准鼠李糖溶液（4）芸香苷样品甲醇溶液

（5）芸香苷标准品溶液（6）槲皮素样品甲醇溶液

（7）槲皮素标准品溶液

2、展开剂：正丁醇-醋酸-水（4﹕1﹕5）上层上行展开。

3、显色：展开完毕，将滤纸取出，记录溶剂前沿位置。待溶剂挥尽后，在（3）与（4）点之间剪开，分别显色。

（1）糖的显色：喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，在105℃烘10分钟，显棕色斑点。计算并比较样品和标准品的Rf值。

（2）黄酮化合物的显色：

①可见光下观察色斑，紫外灯下观察荧光斑点。

②经氨气薰后再观察。

③待氨气挥尽后，喷1% AlCl3甲醇溶液，再观察。

④计算并比较样品与标准品的Rf值。

（五）芸香苷和槲皮素性质试验

1、酸性试验：取小试管8支，每4支一组，第一组每管中加入芸香苷1mg，第二组每管中加入槲皮素1mg，每组四管中分别加入稀氨水、5%碳酸氢钠水溶液、5%碳酸钠水溶液、1%氢氧化钠水溶液各2 ml，振摇后观察各管溶解情况。溶解的溶液应呈黄色。再加浓盐酸数滴酸化，黄色褪去或变浅，并有沉淀析出或产生混浊。

2、Molish反应：取试样1 mg置小试管中，加乙醇0.5 ml溶解，加α-萘酚试剂1~2滴，摇匀。倾斜试管，沿管壁徐徐注入浓硫酸约0.5 ml静置。观察两层溶液的界面变化，出现紫色环者为阳性，表示样品分子中含有糖的结构（糖和苷类均呈阳性反应），比较芸香苷和槲皮素的不同。

3、Fehling试验：取试样数mg，溶于0.5 ml热水中，加斐林氏试剂甲、乙等量混合液2 ml，沸水浴上加热，如产生氧化亚铜的暗红色或黄色沉淀表示有还原糖或其它还原性物质。充分加热作用后滤去沉淀，滤液滴加浓盐酸酸化，在水浴上加热水解，水解液以10% NaOH 中和，再进行斐林氏试验，此时显阳性反应者表示样品为糖苷化合物。比较芸香苷和槲皮素的不同。

4、盐酸-镁粉反应：取芸香苷1 mg ，加乙醇2 ml ，在水浴上加热溶解，加镁粉约50 mg ，滴加数滴浓盐酸，溶液由黄色渐变红色者表示有黄酮类化合物。以同法试验槲皮素。

如用锌粉代替镁粉，则芸香苷（3-羟基与糖结合成苷）仍有作用，而槲皮素（黄酮醇类）不呈还原显色反应。因此可区别两者。

5、锆-柠檬酸反应：取样品1 mg ，加甲醇2 ml ，在水浴上加热溶解，再加2%二氯氧锆甲醇溶液3~4滴，凡有3-羟基或5-羟基的黄酮即呈鲜黄色。然后加2%柠檬酸甲醇溶液3~4滴，有3-羟基的黄酮黄色不褪。比较芸香苷和槲皮素的不同。

6、三氯化铝反应：取样品1 mg 溶于甲醇中，加1%三氯化铝甲醇溶液2~3滴，黄酮类呈鲜黄色，并有荧光。

（六）实验流程

槐花米50g

滤液（弃去） 2g 芸香苷粗品 精制芸香苷 槲皮素精制品

加2%硫酸 ，放冷抽滤 滤液（糖类） 沉淀（苷元） 95%乙醇重结晶 甲醇重结晶 鉴定反应