比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术

进展评述比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术刘新1,2　应万涛1,2　钱小红1,23(1军事医学科学院放射与辐射医学研究所　北京　100850;2北京蛋白质组研究中心　北京　102206)摘　要　比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。

近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。

比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。

关键词　比较蛋白质组学　稳定同位素标记　体内代谢标记　体外化学标记Application of Stable Isotope Labeling in Comparative ProteomicsLiu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23(1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850;2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206)Abstract　C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics.K ey w ords　C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。

蛋白质是基因的最终产物同时也是基因功能的最终执行体,因而人类基因的表达及其功能有待于在蛋白水平上揭示。

蛋白质组学的研究目的是分离和鉴定组织或细胞中的所有蛋白质。

生物体在生长发育过程中,基因组是相对稳定的,而蛋白表达是高度动态变化的,并且具有严格调控的时间和空间特异性[2]。

为了研究生物体在不同状态下表达的所有蛋白质的动态变化,比较蛋白质组学应运而生,即在蛋白组学水平上,研究在正常生理和病理状态,或受到不同的外部环境刺激下,或在突变等因素影响下,蛋白质表达的变化情况,以期发现生物体内关键的调控分子及与疾病相关的蛋白质标志物,最终为疾病的防诊治、新型疫苗的研发等提供理论依据。

为了研究蛋白质表达的动态变化,基因表达检测技术,如微阵列法[3]、DNA(脱氧核糖核酸)芯片法[4]等曾被广泛使用。

这些方法虽然能够实现对mRNA(信使核糖核酸)进行定性和定量分析,但刘新　男,27岁,博士生,现从事比较蛋白质组学研究。

　3联系人,E2mail:qianxh1@国家自然科学基金(20505019、20505018)、国家重点基础研究发展规划项目(2004C B518707)和北京市科技计划重大项目(H030230280190)资助项目2006207220收稿,2006209221接受mRNA自身存在储存、转运、降解、翻译调控及产物的翻译后加工等一系列复杂过程,从而使mRNA表达和蛋白质表达的相关性并不高,难以准确地反映相应蛋白质的表达变化[5],因而该方法很难有效地应用于比较蛋白质组学研究。

质谱分析法是通过测定样品离子的质荷比来进行成分和结构分析的。

随着电喷雾电离和基质辅助激光解析电离为代表的两项软电离技术的出现,质谱在am ol水平上分析几十万Da的大分子成为可能,从此质谱学出现了一个新的领域———生物质谱学。

快速发展的生物质谱学,为蛋白质组研究提供了关键的技术手段,使规模化分析细胞或组织内的蛋白质成为可能[6]。

近年来,基于稳定同位素标记与质谱联用的技术在比较蛋白质组学中发展迅速。

稳定同位素标记方法用于研究蛋白表达的变化,其原理是将化学性质相同但质量不同的稳定同位素作为内标,对来自不同生理病理条件下的的蛋白质或肽段进行标记,相同的蛋白质或肽段因其质量差异在质谱图中出现一对特征性的同位素峰。

由于它们具有相同的离子化能力,可以通过比较其各同位素质谱峰的强度,分析蛋白质在不同状态下的表达量的变化[7]。

本文力图综述近年来在比较蛋白质组学研究中常用的两大类稳定同位素标记技术———体内代谢标记技术和体外化学标记技术,以期为国内比较蛋白质组学研究提供可以借鉴的研究策略。

1　体内代谢标记技术 体内代谢标记技术作为目前定量分析误差最小的比较蛋白质组学研究策略而得到广泛的应用。

Oda等[7]首先将体内代谢标记的方法应用到酵母实验中,酵母分别在含有天然14N同位素的培养基和富含15N同位素的培养基中培养,然后将在两种培养基中生长的酵母细胞等量混合,经细胞裂解、蛋白质提取、二维凝胶电泳分离和蛋白质染色,寻找到感兴趣的蛋白质点,对其进行胶内蛋白质酶解、肽段提取和质谱鉴定。

从质谱图中可以很清楚地看到一对具有特征性的同位素峰(14N标记的肽段和15N标记的肽段),通过峰强度的比值确定在不同生长条件下蛋白质表达的差异。

Oda等在实验中不仅比较了蛋,同时也准确定量了不同磷酸化位点的磷酸化程度。

Y ates等[8]也采用了类似的研究策略,通过15N对酵母代谢标记,蛋白质提取后经多维色谱分离与质谱鉴定,800多个蛋白质有10倍以上量的差异。

该策略也成功地对大肠杆菌、放线菌以及哺乳动物细胞系等进行了代谢标记[9,10]。

但是,研究发现,富含同位素的培养基一定程度上会影响细胞的正常生长。

另外,如果以元素代谢的形式标记到蛋白质中,若发生不完全标记,则会造成标记和非标记肽段的质量差值不可预测,从而使质谱谱图难以解析。

即使能够完全标记,由于合成到肽段里的同位素的原子数量因其氨基酸组成和分子量不同而不同,这就使得同位素标记肽段的辨认更加困难,进一步增加了分析难度[11]。

为了克服上述标记策略的不足,开发出了基于稳定同位素标记的氨基酸细胞培养策略。

Mann等[12]用氘代亮氨酸作为标记物对肌肉组织蛋白质进行代谢标记,成功定量了肌肉分化过程中蛋白质的表达变化,并将该方法命名为细胞培养氨基酸稳定同位素标记(stable is otope labeling with amino acids in cell culture,SI LAC)。

运用此技术,Neubert等[13]对E phB2信号通路中酪氨酸磷酸化蛋白质组进行定量分析,并且基于表达变化的蛋白质构建了相互作用网络;C ole等[14]在对Her2信号通路中的磷酸化蛋白质组研究中发现,在Her2过表达的细胞中,198种蛋白质的酪氨酸磷酸化水平显著上升,而81种蛋白质的磷酸化水平显著下降。

Han等[15]采用SI LAC技术,通过多级提取的方式对细胞凋亡过程中的细胞核蛋白质组进行了研究,共鉴定和定量了1174种蛋白质,除了大量已知的与细胞凋亡相关的蛋白质,鉴定结果中还有大量与细胞凋亡相关的未知新蛋白。

为了提高SI LAC技术的定量准确性,Neubert等[16]采用不同标记成对肽段的二级碎片离子(y离子)的峰强度比值进行定量分析,这种定量方法和传统的基于不同标记成对肽段的一级质谱峰强度或者抽提的离子色谱峰面积的定量方法相比,具有更好的动态检测范围,并且能有效提高蛋白质鉴定的灵敏度。

SI LAC技术对于稳定同位素标记的氨基酸是有选择的,目前常用的氨基酸是精氨酸和赖氨酸。

主要是基于以下因素考虑:在蛋白质组学研究中,胰蛋白酶被广泛使用,其能够高度特异性酶切赖氨酸和精氨酸残基的羧基端,酶切产生的肽段C末端(赖氨酸的侧链氨基或精氨酸胍基)在酸性条件下均会带上一个质子,从而确保了一级质谱分析(除蛋白末端并且不含有碱性氨基酸的肽段)的离子化效率及二级质谱分析离子的碎裂[17]。

但是实验发现,在用13C精氨酸进行代谢标记时,脯氨酸也会被13C标记,这可能是精氨酸分解代谢时13C转移到了脯氨酸中所致[18]。

综上所述,在体内代谢标记技术中,稳定同位素标记过程发生在代谢水平上,因而极大地减少了蛋白质提取过程中可能引入的定量误差,同时该标记方法多与高分辨率、高准确度的傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR2MS)联用,因而该标记策略是目前比较蛋白质组学中最为准确的定量分析方法。