HEK293T细胞培养ppt课件
HEK293FT细胞培养
293细胞培养293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。
3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。
293T细胞的培养[1]
![293T细胞的培养[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/d6a8872378563c1ec5da50e2524de518964bd36d.png)
293T细胞的培养[1]293T细胞的培养293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。
培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。
传代方法为:1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液;5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。
值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。
所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。
传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。
有些同学反映293T细胞容易结团不易被吹打开来。
如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。
一般293T细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90%融合, 再以1∶4~1∶8的比率传代。
合适的传代周期为2~3天。
传代过程中,消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。
完成传代后放入培养箱前,应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。
冷冻293T细胞的冻存液可以用95%小牛血清加5%二甲基亚砜, 复苏率很高。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
细胞培养技术培训ppt课件版
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下 生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能 状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等， 表明细胞代谢不良。
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倒 置 显 微 镜
back
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液 氮 罐
back
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293、293T细胞培养及转染一点经验
qq ：439572370HEK-293是用DMEM 培养基培养吗？
HEK-293细胞是我在锐赛生物实验室做项目时常培养的细胞，DMEM+10%血清+双抗+谷氨酰胺，这类的细胞贴壁性不是太强，所以不要消化过久，容易损伤细胞。
状态较好的293细胞
细胞生长较快，一般1:3~1:5传代，30%~50%融合度2-3
天即可长满。
细胞状态不好后会变瘦、产生大量黑点（细胞碎片）。
网友咨询：我们这里的293转染质粒效率一直不高，
各种方法均试过了，很少能达到50%，老板说他在
国外做293转染很容易达到80%以上。
我想问一下哪里有好的293细胞卖？非常感谢。
答：293系列的细胞都是非常好转染的：注意点：
1.转染前细胞的铺板密度、细胞状态
2.转染的时间
3.转染试剂与质粒的比值
干扰载体转染293T 细胞48h 的图片，供参考。
293T 细胞生长速度更快，形态较293A 细胞小，贴壁性比293
细胞弱很多，消化时间更要注意，没培养过的刚接手细胞要在注意留种的同时多试验消化几次，掌握经验值。
293
细胞常用于腺病毒包装、293T
细胞常用于慢病毒包装。
HEK-293T ACE2 细胞稳转株使用说明书
派真生物HEK-293T/ACE2 细胞稳转株使用说明书HEK-293T/ACE2 细胞稳转株HEK-293T/ACE2 细胞稳转株ACE2即血管紧张素转化酶II（Angiotensin-converting enzyme2）是一种Ⅰ型膜蛋白,其包括一个N端肽酶结构域( peptidasedomain,PD)和一个C端 Collectrin样结构域（Collectrin-ikedomain,CLD）。
ACE2的PD为冠状病毒的S蛋白提供了直接结合位点。
冠状病毒因其病毒脂质层外由棘突蛋白） spike protein,S蛋白）构成的冠状突起而得名。
冠状病毒通过S蛋白与靶细胞表面特定受体结合,然后进入细胞复制并引起宿主感染。
冠状病毒的S蛋白包含S1及S2两个亚单位,其中S1包含受体结合域（RBD）,RBD直接与血管紧张素转换酶2（ACE2）结合,S2负责与宿主细胞膜融合。
当S1与宿主受体ACE2结合时,S2上的裂解位点暴露并被宿主蛋白酶切断,此过程对于病毒感染十分重要。
本细胞系是将ACE2过表达慢病毒感染293T细胞并筛选得到的稳定株。
HEK-293T/ACE2 细胞稳转株产品描述产品名称：中文名称：包装规格：特性蛋白：HEK-293T/ACE2过表达人源 ACE2 的人肾上皮细胞2管（细胞数1E+7个/管）过表达人的血管紧张素转化酶 2 蛋白（ACE2）建议第一次 1:2 传代。
2 天换液10%DMSO +90%完全培养基Puro 嘌呤抗性传代方法: 传代情况：冻存条件：备 注：检测报告：提供感染滴度数据、293T /hACE2感染图片或荧光素酶表达量结果派真生物复苏细胞：将含有2mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入 5mL 培养基混合均匀。
在 1000rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，补加 4-6mL 完全培养基后吹匀。
然后将所有细胞悬液加入 10cm 皿中培养过夜，培养过夜。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
hek293t细胞基因序列
hek293t细胞基因序列摘要：1.介绍hek293t 细胞2.阐述hek293t 细胞的基因序列3.讨论hek293t 细胞基因序列的重要性正文：一、介绍hek293t 细胞hek293t 细胞是一种人类胚胎肾细胞系，它具有无限制传代的能力，并且易于培养和操作。
由于其独特的特性，hek293t 细胞被广泛应用于生物学和医学研究领域，如基因表达研究、药物筛选和病毒学研究等。
二、阐述hek293t 细胞的基因序列hek293t 细胞的基因序列是指其细胞核中所包含的基因的排列顺序。
这个基因序列决定了hek293t 细胞的生物学特性，如细胞的生长速度、细胞周期和细胞凋亡等。
目前，科学家已经对hek293t 细胞的基因序列进行了深入研究，并发现了许多与细胞生长和功能相关的关键基因。
三、讨论hek293t 细胞基因序列的重要性hek293t 细胞基因序列的重要性体现在以下几个方面：首先，了解hek293t 细胞的基因序列有助于我们深入理解细胞的生物学特性。
通过研究基因序列中的关键基因，我们可以揭示细胞生长和功能的分子机制，从而为细胞生物学研究提供理论基础。
其次，hek293t 细胞基因序列的研究可以为药物筛选提供重要线索。
通过筛选基因序列中的特定基因，我们可以找到潜在的药物靶点，从而提高药物筛选的效率和准确性。
最后，研究hek293t 细胞基因序列有助于优化细胞培养条件。
通过分析基因序列中与细胞生长和凋亡相关的基因，我们可以找到影响细胞生长的关键因素，进而调整培养条件，提高细胞培养的成功率和效率。
综上所述，hek293t 细胞基因序列对于理解细胞生物学、药物筛选和优化细胞培养条件具有重要意义。
293细胞培养
293 细胞是腺病毒载体的包装细胞。腺病毒是继逆转录病毒后用于基因治疗研究的热门 载体。直接将腺病毒载体导入人体内表达目的基因，治疗恶性肿瘤、心血管疾病或一些遗传 疾病已取得可喜进展；利用腺病毒载体在包装细胞 293 中表达分泌性蛋白质，如蛋白酪氨酸 激酶 1C 等亦成为生产重组蛋白的一条途径。因此完善 293 细胞的大规模培养技术具有越来 越重要的市场意义。哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬 浮培养。这三种方式均可用于 293 细胞的大规模培养。
微载体培养
微载体是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和 贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产蛋白质产品， 如 293 细胞、成肌细胞、Vero 细胞、CHO 细胞。常用商品化微载体有三种：Cytodex?，Cytopore 和 Cytoline。
悬浮培养时，由于缺少血清和蛋白的保护作用，293S 对剪切力的敏感度增加，难以达 到高密度培养，导致 293S 产生病毒的数量比贴壁培养低 5-10 倍左右。细胞接种后，灌流培 养 7 天，达到细胞密度 5×106/ml，增殖 5-10 倍。
结论
不管是哪种培养方式，首要的一点是必须操作规范、防止污染；其次根据需要选择合适 的 293 细胞培养方式，对细胞生长状况实行有效的监控，以便获得稳定的蛋白或病毒产物。
无血清悬浮培养
无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养 方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方 向。要实现 293 细胞无血清悬浮培养必须先将贴壁培养 293 改造为悬浮培养 293S 细胞并寻 找适合高密度无血清培养的培养液配方。
HEK293细胞系
文档
HEK293
HEK293细胞比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
293细胞的一个衍生株：293T/17的转染效率更高，成为广大研究者研究基因功能的一个强大工具。
293细胞的缺陷是生长过程中贴壁强度比较小。
所以在实验过程中容易流失，从而影响实验结果。
如果一个实验室新得到的293细胞是邮寄得到的并且细胞在培养瓶中，就需要让细胞沉降几天时间，因为大量细胞会漂浮在培养液里。
来源：人体肾脏形态：上皮细胞生长特性：贴壁注释：该细胞含腺病毒5 D NA 。
培养液：MEM（含 2 mM L-谷氨酰胺和Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠），10% 马血清（热灭活）。
传代：吸去培养液。
用0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。
加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。
加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。
加适量的细胞到新的培养器皿中。
（以1：2到1：4为宜，传代期间培养液2-3天更换1次）
冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。
维持培养液用含2%血清的MEM即可
10%用于加速生长
.。
hek293t细胞基因序列
hek293t细胞基因序列摘要：1.介绍hek293t 细胞2.解释基因序列3.hek293t 细胞的基因序列特点4.hek293t 细胞基因序列的应用正文：1.介绍hek293t 细胞hek293t 细胞是一种人类胚胎肾细胞系，被广泛应用于生物学和医学研究领域。
这种细胞系具有高度的稳定性和易于培养的特点，使其成为分子生物学、基因工程和药物筛选等领域的重要研究工具。
2.解释基因序列基因序列是指一个生物体内某个基因的DNA 序列，通常由一系列碱基（A、T、C、G）组成。
基因序列是生物体遗传信息的基础，决定了生物体的遗传特征和生物学功能。
3.hek293t 细胞的基因序列特点hek293t 细胞的基因序列与其他人类细胞系相比具有一定的特点。
首先，这种细胞系具有正常的人类基因组结构，包含了大约23 对染色体。
其次，由于其来源于人类胚胎肾细胞，hek293t 细胞基因序列在基因表达和调控方面与其他人类细胞系存在一定差异。
4.hek293t 细胞基因序列的应用hek293t 细胞基因序列在生物学和医学研究中具有广泛的应用。
首先，这种细胞系被用于基因编辑技术的研究，例如CRISPR/Cas9 系统。
由于hek293t 细胞具有较高的基因编辑效率，因此成为研究基因编辑技术的理想模型。
此外，hek293t 细胞基因序列还被用于药物筛选和毒性测试。
通过在hek293t 细胞中引入特定的基因序列变异，研究人员可以研究这些变异对药物反应和毒性的影响，从而为药物研发和安全评估提供重要信息。
总之，hek293t 细胞基因序列作为一种重要的生物学研究工具，在基因编辑技术、药物筛选和毒性测试等领域发挥着重要作用。
293T 细胞培养
293T细胞培养1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
3.传代:吸出旧培基，加5mlPBS洗一遍，用移液管加1ml胰酶，洗一遍吸出，37度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml新培育基的新瓶里。
293T细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
293T细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293T细胞的大规模培养。
293T细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液293T时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
HEK293T细胞培养
细胞系的第一步。
细胞的培养具体方法与步骤
传代培养
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到
另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消
化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传 代法或离心法传代。
HEK293T和HEK293细胞
HEK293细胞简介
HEK293细胞在倒置显微镜下的形态
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染
梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲
霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
真菌污染后，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色
漂浮物。
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染检测
镜检有丝状物
细胞污染问题与解决方案
常见的真菌污染
HEK293细胞的复苏
复苏前的准备
DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)：试验前置室温下
将水浴锅预热至37℃
取新培养瓶（75cm2），标记细胞编号、时间，加入10ml DMEM培
养基(37℃预热)，润湿底面
HEK293细胞复苏步骤
根据冻存记录从液氮灌中取出冻存的细胞
迅速投入已经预热至37 ℃的水浴锅中，并快速晃动，在1-2 min内使完全融化
服传出细胞间外。
进入细胞间必须养成随手关门习惯。操作期间，细胞间外门和中门必须处于关 闭状态。
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细胞间的操作注意事项
操净工作台实验前和试验后的灭菌，打开紫外灯15-20分钟。
试验操作期间，应戴手套。并注意随时用75%酒精消毒双手。
实验操作期间，操净工作台的风机应处于打开状态。操作结束后，关闭挡板、 关闭风机。 凡是带入操净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶等到额瓶子均要用75% 酒精擦拭瓶子的外表面。 使用倒置显微镜前，用75%酒精擦拭消毒载物台 使用二氧化碳培养箱时，应尽量缩短开门时间，减少开门次数。 每次倒置显微镜观察细胞后，用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，再放入 放入培养箱中继续培养。
HEK-293细胞复苏培养及冻存汇总
HEK－293细胞复苏培养及冻存作者：杨彪作者单位：辽宁医学院附属第一医院骨科【摘要】目的通过对人胚肾293细胞的复苏培养及其冻存的研究，为进一步行干细胞标记实验奠定基础。
方法复苏培养人胚肾293细胞，倒置显微镜观察人胚肾293细胞的生长状况,计算细胞贴壁率，绘制细胞生长曲线，冻存保留细胞。
结果人胚肾293细胞在普通培养条件下生长良好，6h后大部分细胞已经贴壁，8h细胞已完全贴壁。
结论人胚肾293细胞采用改进方法复苏培养及冻存是简便可行的，为进一步行干细胞标记实验奠定了坚实的前期基础。
【关键词】人胚肾293细胞细胞培养冻存Anabiosis and Cultivation of HEK-293 Cells and CryopreservationYANG Biao1, MEI Xi-fan1, LIU Fu-qiang2(1.Department of Orthopaedics ，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University;2.Department of Endocrine，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000 China)【Abstract】Objective To lay foundation for establishing substructure of stem cells’ labeling and transplantation therapy experimentation through the research on anabiosis and cultivation of HEK-293 cells and cryopreservation. Methods By resuscitating and cultivating HEK-293 cells, observe them with inverted microscope，calculate adherence rate，draw growth curve， cryopreservate and reserve it. Results HEK-293 cells grow well in the common cultivating conditions. Most of the cells have adherenced after 6 hours, and all cells have adherenced after 8 hours. Conclusions It is convenient and feasible to adopted improved ways to resuscitate and cultivate HEK-293 cells. In this way, we have established substantial substructure of stem cells’ labeling.【Key words】 HEK-293 cells;cell culture;cryopreservation干细胞是近年医学研究的热点之一，并显示了良好的应用前景。
HEK293T细胞培养
03
hek293t细胞培养的过程
细胞培养前的准备
细胞培养环境的准备
确保细胞培养实验室的清洁和消毒，准备好所需的培养基、细胞 培养瓶、酶等试剂。
细胞复苏和传代
从液氮或-80℃冰箱中取出细胞，进行复苏和传代，以获得足够的 细胞数量。
05
hek293t细胞培养的挑战与解决方案
细胞培养中的污染问题
污染来源
细胞培养中的污染可能来自培养环境、培养基、细胞本身和操作 过程等。
污染类型
常见的污染类型包括细菌、霉菌、支原体和病毒等。
解决方案
定期检查培养环境、培养基和细胞，使用一次性耗材，严格遵守 无菌操作规程，定期进行支原体检测等。
细胞培养中的生长问题
细胞培养过程中的注意事项
防止污染
维持适宜的pH值
严格控制细胞培养环境，定期对培养基和 细胞进行无菌检测，以防止细菌、霉菌等 污染。
监测培养基的pH值，并适时调整，以确保 细胞的正常生长。
避免细胞交叉污染
注意安全操作
在操作过程中，确保不同种类的细胞分开 存放，避免交叉污染。
操作过程中要穿戴实验室防护服、手套等 防护措施，避免直接接触细胞和培养基， 以防止潜在的生物危害。
选、基因治疗和疫苗研发等。
02
hek293t细胞培养的原理
细胞培养的基本原理
细胞是生命的基本单位，具有自我复 制和分化的能力。在适宜的环境下， 细胞可以生长、繁殖并维持其生物学 特性。
细胞培养技术广泛应用于生物学、医 学、药学等领域，是研究细胞生理、 病理和药理等方面的重要手段。
HEK293T细胞培养ppt课件
加入0.05%（37 ℃预温 ）胰酶消化
加入12ml完全培养基（37 ℃预温 ）将细胞从细胞瓶底部冲下
1:4传代即取3ml细胞悬液加入有9ml完全培养基的新细胞瓶中
放入37℃、5%CO2继续培养
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HEK293细胞的传代
加入0.05%胰酶消化
1
2
刚 加 入 胰 酶 细 胞 还 是 致 密 单 层
服传出细胞间外。 进入细胞间必须养成随手关门习惯。操作期间，细胞间外门和中门必须处于关
闭状态。
.
细胞间的操作注意事项
操净工作台实验前和试验后的灭菌，打开紫外灯15-20分钟。
试验操作期间，应戴手套。并注意随时用75%酒精消毒双手。
实验操作期间，操净工作台的风机应处于打开状态。操作结束后，关闭挡板、 关闭风机。
制定好实验计划和操作程序（准备好实验过程中的一 切用品）
洗手和着装（75%酒精消毒）
进入超净台中的所有物品均需消毒
操作野消毒
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细胞培养耗材
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HEK293细胞的传代
待细胞的融合率达到90%时进行传代。
弃去旧细胞液
4℃遇冷的DPBS（不含Ca2+ 、Mg2+）4ml冲洗后弃液
真菌污染后，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色 漂浮物。 LOGO
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染检测 镜检有丝状物
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细胞污染问题与解决方案
常见的真菌污染
真菌污染
霉菌污染
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细胞污染问题与解决方案
细胞的支原体污染
细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养 过程中被支原体污染是一个世界性的难题
细胞培养技术课件-PPT
潜伏期（有生长活动，而无细胞分裂，一般为6～24小时 对数生长期（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。
最适合进行实验研究） 停止期（平台期）（细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不
再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）
（悬浮细胞没有贴壁过程）
注意： 开放式操作，小心谨慎、谨防污染！
细胞冻存（慢冻）
1 细胞冻存液（1ml/管） 基础培养基70％ 胎牛血清20％ DMSO 10％ （二甲基亚砜，一种渗透性保护剂，可迅
速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓 冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞 外形成冰晶，减少胞内冰晶对细胞的损伤。）
（2）用培养液稀释后低速离心10分钟。 （3）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 （4）隔天换液，但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而损伤细胞。
细胞传代
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上 饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数 量扩大，就必须进行传代（再培养）。
其他实验所需的试剂： 药物（如ATRA）、检测试剂（如MTT）、细胞因子 （如SCF）等
试剂标注规范
试剂名称 配制浓度 配制人 配制日期
NaCl 0.5 mM 张三
耗材
培养皿、瓶、孔板 离心管、移液管 枪尖 其他
小结二 试剂及耗材的分类及用途
培养基（成分、分类）
耗材（分类、用途）
生物安全柜
无菌培养瓶、吸管、离心管的准备 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理（蛋白凝固）（不能擦拭有机玻璃）
细胞生长过程，细胞来源
湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min，破坏微生物孢子、蛋白变性。
内质网定位EGFP稳转细胞株（HEK293T）
内质⽹定位EGFP稳转细胞株（HEK293T）
货号：CY005
ER-EGFP稳定表达293细胞株表达钙⽹蛋⽩（GeneID：811）N
端17AA信号肽和EGFP的融合蛋⽩，定位于细胞内质⽹，内质⽹
为绿⾊荧光蛋⽩标记，可⽤于内质⽹定位实验或者内质⽹定位基
因的研究。
细胞特性：
细胞来源：HEK293V细胞（⼈胚肾细胞）
表达蛋⽩：内质⽹定位EGFP蛋⽩
构建载体：pLV-ER-EGFP（货号VL3504）
筛选抗⽣素：嘌呤霉素
培养基：DMEM⾼糖培养基+10�S
细胞培养⽅法：
以25cm培养瓶传代为例。
1、传代前将细胞培养液、PBS和胰蛋⽩酶温浴到37℃。
2、吸去细胞培养液。
3、⽤PBS漂洗1到2次。
4、加⼊3ml胰蛋⽩酶，轻轻晃动细胞瓶，使胰蛋⽩酶均匀覆盖细胞。
吸去胰蛋⽩酶，将培养瓶放置在细胞培养箱中，37
摄⽒度消化。
由于配制的胰蛋⽩酶活⼒有差别，消化时间可⽤30秒到1分钟。
应在倒置显微镜下观察，看到细胞分开及稍微变圆即可。
5、加⼊5ml 细胞培养基，⽤吸管轻柔吹打分散细胞。
6、按1:4到1:5接种细胞。
pLV-ER-EGFP（货号VL3504）
293-EGFP稳定细胞株。
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取50ml无菌离心管，于超净台内，加入适量DMEM培养基(含 10%胎牛血清)，再逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度，即 制成双倍的冻存液，置室温下待用。
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HEK293细胞冻存步骤
取准备冻存的细胞，弃去培养基，以DPBS2-3ml洗细胞一次 加入0.5-1.0ml 0.05%的胰酶消化
细 胞 开 始 皱 缩 持但 细不 胞明 正显 常， 形仍 态维
4
细 胞 基 本 皱 缩 胞变 吹圆 打， 可此 下时 。细
5
胞如 脱消 落化 随过 弃头 去， 的会 胰见 酶到 溶许 失液多 。流细
3
大细 不胞 再明 形致显 态密皱 ，，缩 部部变 分分小 细细， 胞胞细 皱维胞 缩持间 变正隙 圆常增
DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)：试验前置室温下。 0.05%的胰酶消化液：37℃预温。 程序冻存盒（加250ml异丙醇）、二甲基亚砜(DMSO)、2ml细胞冻
存管（标记细胞名称、代数、日期）、DPBS（不含钙镁）
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HEK293细胞的冻存
冻存前的准备
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HEK293细胞冻存步骤
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细胞简介
细胞是生命活动的基本单位
1983-39德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立 了“细胞学说”的基本原则
1、细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的 2、每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己的“生命” 3、新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生
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细胞培养技术平台
基因诊疗
药物筛选
细胞培养技术
蔺帅
2013年4月
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主要内容
1
细胞简介
2
细胞培养技术平台
3 HEK293T细胞的培养具体方法与步骤
4 细胞培养的常见问题与解决方案
5
细胞间的操作注意事项
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细胞简介
细胞是生命活动的基本单位
1665年英国学者Robert Hooke，用自制的显微镜观察软木的 薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文Cella （小室）词.
加入0.05%（37 ℃预温 ）胰酶消化
加入12ml完全培养基（37 ℃预温 ）将细胞从细胞瓶底部冲下
1:4传代即取3ml细胞悬液加入有9ml完全培养基的新细胞瓶中
放入37℃、5%CO2继续培养
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HEK293细胞的传代
加入0.05%胰酶消化
1
2
刚 加 入 胰 酶 细 胞 还 是 致 密 单 层
HEK293细胞在倒置显微镜下的形态
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HEK293T和HEK293细胞
HEK293细胞简介
HEK293细胞株是转染腺病毒E1A基因的人胚肾上皮细胞，由于 容易转染且容易培养，常被用于转染试验。
HEK293T SV40大T抗原
瞬时转染 转染效率更高
HEK293 稳定转染
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HEK293T和HEK293细胞
加入新鲜培养基10-12ml吹打成细胞悬液 收集细胞悬液至50ml无菌离心管，1000rpm，5min离心.弃上清，加入适量培养基
取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，DMSO最后浓度为10%
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HEK293细胞冻存步骤
细胞浓度为1～5×106cells/ml（细胞计数），分装于已标示完全之细胞冻存管中
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HEK293细胞的传代
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HEK293细胞的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ存
随着传代的次数增加，293细胞会出现生长状态下降， 出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存， 以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
原则：慢冻
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HEK293细胞的冻存
冻存前的准备
原代培养 传代培养
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细胞的培养具体方法与步骤
原代培养
用直接从机体获得的细胞进行的培 养称为原代培养。这种培养过程主 要是采用无菌操作的方法，把组织 （或器官）从动物体内取出，经酶 消化处理，使分散成单个细胞，然 后在人工条件下培养，使其不断地 生长和繁殖。原代培养是建立各种 细胞系的第一步。
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HEK293细胞
HEK293细胞生长条件
完全培养基 10%的胎牛血清 DMEM(4.0mM L-谷氨酰胺 4500mg/ml葡萄糖 ) 1%双抗(1000units /L penicillin 1000mg/L streptomycin) 37℃ 5%CO2
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无菌技术
基因诊断
培养细胞 能做什么
治病机理
试管婴儿
组织工程
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细胞的培养具体方法与步骤
细胞培养细胞培养(cell culture) 的含义，简单地说即是把来 自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境 中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁 殖、衰老等生命现象。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、 病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用
将细胞冻存管放入程序冻存盒中（已加250ml异丙醇），置-80℃超低温冰箱
第二天将细胞放入液氮灌，并记录
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HEK293细胞冻存步骤
细胞冻存的注意事项
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细胞的培养具体方法与步骤
传代培养
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到 另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消 化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传 代法或离心法传代。
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HEK293T和HEK293细胞
HEK293细胞简介
瞬时转染
在瞬时转染中重组DNA导入感染性强的细胞系已获得目的基因暂时但高 水平的表达。转染的DNA不必整合进宿主染色体，当用大量的样品需要 在短时间内分析时，尤其是在转然后的1-4天内收获细胞，所得的溶解 产物用于检测目的基因的表达，可以采用瞬时表达的方式。
稳定转染
这种细胞系中转染的目的基因整合到宿主染色体DNA中并指导适量的目 的蛋白的合成。一般来说转染细胞的效率要比瞬时转染的效率低1-2个 数量级。
制定好实验计划和操作程序（准备好实验过程中的一 切用品）
洗手和着装（75%酒精消毒）
进入超净台中的所有物品均需消毒
操作野消毒
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细胞培养耗材
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HEK293细胞的传代
待细胞的融合率达到90%时进行传代。
弃去旧细胞液
4℃遇冷的DPBS（不含Ca2+ 、Mg2+）4ml冲洗后弃液