基因芯片技术及其在结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药性检测方面的研究进展

目前基因芯片的大规模临床应用还 存在尚未克服的技术缺陷。主要包括芯片 诊断特异性和灵敏度低、芯片诊断成本高 昂和芯片诊断配套仪器价格昂贵等等。 ４展望
基因芯片技术发展到今天不过短短 十几年时间．虽然还存在这样或那样的 问题，但其在基闪表达谱分析、基凶诊 断、药物筛选及序列分析等诸多领域已 呈现出广阔的应用前景．随着研究的不 断深入和技术的更加完善．基因芯片一 会在生命科学研究领域发挥出其非凡 的作用。尤其在结核病方面，在分枝杆菌 的基阗分型、菌种鉴定和耐药基因的检 测等方面．将发生越来越重要的作用，我 们相信这一天很快就会到来。 ５参考文献 『１］ 朱国萍，解俊．ＤＮＡ芯片一世纪之交的
非接触微机械印刷法ｒ『＇０ｓＰＯＴ和软光刻 复制等。主要有两种基本方法．①原位合 成：“３：②合成点样法［，一］：另外一种方法 是合成点样的改进型。除上述３种方法 外，还有以凝胶块为阵点的芯片或者也 可以通过导电的吡咯单体的聚合形成微 阵列。探针的荧光素标记分为间接标记 和直接标记。间接标记是指将生物素连 接在探针上．利用亲和素对生物素有极 高亲和力的原理．进行分子杂交．然后用 偶联有荧光素或链霉亲和素进行检测。 直接标记是通过荧光素直接与探针核苷 或磷酸戊糖骨架共价结合。或掺入荧光 素一核苷三磷酸以标记探针．杂交后，直 接检测荧光信号ｍ】。（２）样品的制备。包 括样品ＤＮＡ或ＲＮＡ的分离提纯和用 ＰＣＲ技术对靶基因片段扩增以及对靶基 因标记。将样品进行提取、扩增，获取其 中的蛋白质或ＤＮＡ、ＲＮＡ．然后用荧光标 记。由于目前的检测体系还不能检测出 未扩增的标记样品．所以待测样品在杂 交前一般都要进行ＰＣＲ反应。在扩增过 程中对靶ＤＮＡ进行标记。（３）基因探针 的固定化。生物分子探针是与靶分子互 补的序列。基因探针的固定化方法目前 常用的有两种：聚赖氨酸法、醛基一氨基 法。（４）杂交反应。杂交反应是一个复杂 的过程，受很多因素的影响。选择合适的 反应条件使生物分子问的反应处于最适 状况中。（５）芯片信号的检测与分析。样 品中靶基因与固定在芯片上的探针发生 特异性杂交而结合在芯片上的不同点． 荧光素分子受特定波长的激发光照射出 特定波长的荧光，杂交越完全，得到的信 号也就越强。 ２基因芯片技术在结核病研究中的应 用 ２．１ 基因芯片技术用于分枝杆菌菌种鉴 定 ＮＴＭ的分离率全国差异很大［－引。 ２０００年非结核分枝杆菌的分离率平均为 １１．１％，耐药率为９５．９％，耐多药率为 ８３．７％［”Ⅲ。ＮＴＭ具有天然的对抗结核药 物的耐受性。传统的分枝杆菌菌种鉴定 是鉴定结核杆菌复合群和非结核分枝杆 菌，耗时长，步骤繁琐。最近发展起来并 广泛使用的快速培养技术．如
３当前面临的困难 尽管基因芯片技术已经取得了长足
的发展，得到人们的瞩目，但仍然存在着 许多难以解决的问题，例如技术成本昂 贵、复杂、检测灵敏度较低，重复性差、分 析范围较狭窄等问题。这些问题主要表 现在样品的制备、探针合成与固定、分子 的标记、数据的读取与分析等几个方面。 基因芯片的特异性还有待提高。上述问 题不仅是当前和今后一段时期内国内外 基因芯片技术研究的焦点．同时也是基 因芯片能否从实验室研究推向临床应用 的关键问题。
基因芯片技术始创于２０世纪９０年 代初．由美国Ａ毋ｍｅⅢｘ公司的Ｆｏｄｏｒ博 士开始相关研究ｆ２ｌ】。基斟芯片在结核分枝杆 菌快速鉴定方面的应用研究一经报道． 立即引起了国内外学者的高度重视ｍ引． 成为本世纪分子生物学的研究热点．应 用于分枝杆菌的菌种鉴定和耐药性检测 等方面。１９９８年，Ｇｊｎｇｅｒａｓ等［驯利用结核 分枝杆菌ｒｐｏＢ基因保守区７０５ ｂｐ特异 核苷酸序列探针与基因芯片杂交．对１０ 种１２１株分枝杆菌进行基因分型与菌种 鉴定。１９９９年Ｔｍｅｓｃｈ等［∞３基于１６Ｓ ｒＲＮＡ 和ｒｐｏＢ基因序列，利用基因芯片技术鉴 定出７０株２７种不同菌种的分枝杆菌临 床分离株和１５株耐利福平菌株为准确 理解ＤＮＡ同源性高的分枝杆菌基因组 间的差异．１９９９年Ｂｅｈｒ等【“】通过ＤＮＡ芯 片对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和卡介 苗（ＢＣＧ）的基因组进行杂交试验比较，证 实ＢＣＧ缺失与结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ致 病相关的区域。由此可见。对关系密切的 分枝杆菌基因差异的正确了解．对高同 源性的分枝杆菌的准确鉴定和疫苗的合 理设计提供了新的思路。 ２．２基因芯片技术用于结核分枝杆菌耐 药性检测我国结核病疫情呈现“六多” 的特点：感染人数多；患病人数多；新发 患者多；死亡人数多；农村患者多；耐药 患者多。全国菌阳肺结核患者中耐药患 者约占ｌ／４．而他们传播引起新患者的耐 药率高达２８％．每年由结核病带来的直 接损失超过３５亿［引。
并为控制疾病的传播提供了可能性。 １９９８年，Ｃｉｎｇｅｒａｓ等。驯利用结核分枝
杆菌ｒｐｏＢ基因保守区７０５ｂｐ特异核苷酸 序列探针与基因芯片杂交．对１０种１２ｌ 株分枝杆菌进行基因分型与菌种鉴定。 作者用ｒｐｏＢ寡核苷酸芯片技术与常规双 脱氧核苷酸测序方法，分析了ｌｏ种分支 杆菌种问与种内的序列多样性，并确证 了几种特异性单碱基多态性。１９９９年 １’ｍｅｓｃｈ等ｔ。：基于１６ｓ ｒＲＮＡ和ｒｐｏＢ基因 序列，利用基渊芯片技术鉴定出７０株２７ 种不同菌种的分枝杆菌临床分离株和１５ 株耐利福平菌株．结果正确地鉴定了２７ 个种属中的２６个．而且检测出了所有耐 利福平的１５株结核分枝杆菌ｒｐｏＢ突变 基因。２００２年张万汀等。４ｊ报道应用基因 芯片技术检测ｌ株结核分枝杆菌药物敏 感株和４株耐多药株结核分枝杆菌．基 因芯片扫描结果经分析与传统药敏检测 结果相符合。２００３年崔振玲等：臼ｊ用芯片 检测耐异烟肼分离株ｋａｔＧ、ａｈｐｃ调节区 域和ｉｎｈＡ调节区域的基因突变。２００３年 端木和运等：圳报道应用基因芯片检测 ２０株耐ＩＮＨ、ＲＦＰ结核分枝杆菌临床分 离株的ｋａｔＣ、ｒｐｏＢ基因突变。２００３年李 胡渤等㈣用ＤＮＡ芯片对５９株耐药结核 分枝杆菌进行耐异烟肼、耐利福平基因 进行检测。２００３年单万水等㈨报道３５株 耐利福平结核菌中有９１．４％用直接测序 法检测出存在ｒｐｏＢ基因突变，ＤＮＡ芯片 的检测效率为７１．４％。 ２．３基冈芯片的优势基冈芯片在感染 性疾病、遗传性疾病和肿瘤等疾病的临 床诊断方面具有独特的优势。与传统检 测方法相比．它可以在一张芯片同时对 多个患者进行多种疾病的检测：无需机 体免疫应答反应，能及早诊断；待测样品 用量小：能检测病原微生物的耐药性，病 原微生物的亚型：极高的灵敏度和可靠 性；检测成本低，自动化程度高，利于大 规模推广应用。这些特点使得医务人员 在短时间内．可以掌握大量的疾病诊断 信息．这些信息有助于医生在短时间内 找到正确的治疗措施２００５年１月中国 科学院武汉病毒所分析生物化学与分析 生物技术学科组邓教宇助理研究员报告 题为“结核分枝杆菌耐药性检测基因芯 片研究”，他报告了结合现代分子生物学 和基因：占片技术．建立的一种准确、快速 和灵敏的结核分枝杆菌耐药性检测实用 化新方法．它扩展了基因芯片的研究内 容，对于结核病的早期诊断、结核菌耐药 性快速测定及耐药性结核病的有效防治 和控制具有重要意义。
万方数据
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ＢＡＣＴＥＣ４６０．ＢＡＣＴＥＣ９６０无疑大大缩短 了培养周期．但只能检测是结核杆菌复 合群还是非结核分枝杆菌，依然无法达 到快速检测的要求。目前常用的分子生 物学方法有始于１９８９年的ＰＣＲ—ＳＳＣＰ、 ｖａｎｅｅｃｈｏｕｔ等㈨报道的ＰｃＲ．ＲＦＬＰ、ＰｃＲ． 直接测序法［１７。”、ＤＮＡ ｐｍｂｅ和分子灯塔 法…等，这些方法各有优缺点，仍不能满 足临床的需要。
临床实验室中传统的药敏试验方法 烦琐、费时，由于结核分枝杆菌生长缓 慢，在得到分离株后３～４周才能获得结 果。Ｂａｃｔｅｃ．９６０ＴＢ系统使结核分枝杆菌 药物敏感性试验时间缩短．但还不能为 结核病的早期治疗提供有利依据，造成 结核患者在人群中播散。
基因芯片是近几年在高科技领域内 出现的最具时代特征的重大科技进展之 一。利用基因芯片可以快速获得各种疾 病菌种和耐药性方面的信息，为疾病的 治疗提供依据。 ｌ基因芯片技术 １．１ 基因芯片历史同顾生物芯片的最 初构想来源于１９８９年美国加州的 Ａ所ｍｅⅢｘ公司的前身Ａ卿ｍａｘ公司里的 一次即兴的建议。当时Ｅ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ发现被 标记的核酸分子能够与另一个被固化的 核酸分子配对杂交，因此，Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交 可被看作是最早的生物芯片…。１９９１年 利用光蚀刻光导合成多肽１２】。１９９２年第 一块生物芯片诞生。１９９３年设计了一种 寡核苷酸生物芯片［“。１９９４年又提出用 光导合成的寡核苷酸芯片进行ＤＮＡ序 列快速分析［“。到１９９６年制造出世界上 第一块商业化的生物芯片。近年来，合成 的寡核甘酸探针因其独特的优点而备受 关注商］，如（１）可根据需要合成相应序列： （２）可识别靶序列内１个碱基的变化； （３）可大量合成且能够用酶学或化学方法 进行非放射性标记。圳。 １．２基因芯片的定义 ＤＮＡ芯片是生
目前常用的耐药基因分子生物学检 测方法有：聚合酶链反应一ＤＮＡ直接测序 法；聚合酶链反应一单链构象多态性分 析；聚合酶链反应一异源双链构象分析； ＲＮＡ／ＲＮＡ错配法：分子灯塔法；线性探 针法和聚合酶链反应一酶联免疫吸附试 验．等等。但是都因各种原因难以满足临 床的快速需要。
芯片技术最大优势是能同时分析成 千上万个基因，可将所有突变的探针固 定到一张芯片上，只须一次杂交，即可获 得某一菌株对所有药物的敏感性结果， 因而对指导医生合理用药非常有价值，
作者单位：ｌ０００９ｌ北京市，解放军３０９ 医院全军结核病研究所
物芯片目前应用最广泛的产品。基因芯 片又称ＤＮＡ芯片（ＤＮＡ ｃｈｉｐｓ）或ＤＮＡ微 阵列（ＤＮＡ ｍｉｒｃｏａ丌ａｙ）．是生物芯片中的 一种。其特点是高度平行性、多样性、微 型化和自动化ｉ”。 １．３基因芯片技术原理基因芯片的工 作原理与Ｓｏｕｔｈｅｍ、Ｎｏ曲ｅｍ是一致的．都 是应用已知核酸序列作为探针固定在玻 璃等基片上．然后与待测样品的ＤＮＡ或 ＲＮＡ互补的靶核苷酸序列杂交．从而获 得待测样品的信息。基因芯片技术由于 同时将大量探针固定在支持物上．所以 可以一次性对样品大量序列进行检测和 分析．从而解决了传统核酸印迹杂交技 术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数 量少、检测效率低等不足’８］，而且，通过 设计不同的探针阵列，使用特定的分析 方法可使该技术具有多种不同的应用价 值。 １．４基因芯片的主要类型和制备方法 １．４．１ 主要类型生物芯片包括ＤＮＡ 芯片、蛋白芯片及芯片实验室三大领域。 基因芯片按其性能和用途可分为两类： 毛细管型和基闪探针型。按基因芯片技 术主要分为两大类：（１）ｃＤＮＡ微点阵 （ｃＤＮＡ ｍｉｃｍａｎ－ａｙ）。（２）寡核苷酸微阵列 芯片叫ｏ】。按基因芯片的用途分为表达芯 片、基因组芯片和测序芯片．按芯片上核 甘酸的长度分为寡核甘酸芯片、ｃＤＮＡ芯 片和基因组芯片。按片基可分为无机片 基和有机合成物片基。按工作原理可分 为杂交型、合成型、连接型、亲和识别型 等。按分析过程可分为样品制作芯片、生 物化学反应芯片、检测芯片、芯片实验室。 根据生物芯片的特点和发展趋势，可将其 分为两类。第一类为高密度分子微阵列 芯片。第二类是以各种结构微阵列为基 础的生物芯片．由微通道或反应池等构 成的通道型微阵列及生物传感芯片…】。 １．４．２制备方法（１）芯片的制备。首先 要寻找有意突变位点设计、合成探针；其 次在制备基因芯片时要考虑阵列的密 度、再生性、操作的简便性、成本的高低 等几方面的因素。目前ＤＮＡ芯片的制备 方法有：光引导原位合成法、化学喷射 法、接触式点涂法、原位ＤＮＡ控制合成、