实验报告-细胞复苏及细胞鉴别与计数

细胞生物学实验报告

实验二细胞复苏及细胞鉴别与计数

1引言

1.1 实验目的

1. 掌握无菌操作技术。掌握细胞复苏技术。

2. 掌握用血球计数板进行细胞计数的方法。

3. 学习死活细胞鉴别的方法。

4. 了解细胞污染的判定方法。

5. 了解细胞形态的多样性。

1.2 实验原理

1.细胞复苏：以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程，复苏时要快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞在1分钟内快速融化至37℃，使细胞迅速通过最易受损的温度区间-5-0℃，使冻存时细胞外的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

2.细胞计数：采用血细胞计数板法，血细胞计数板由一块长约7.5cm，宽

3.5cm的厚玻璃制成，平台中部上下各有一个计数室，每个计数室分9大格，每格边长1mm，面积1mm2，盖上盖玻片后体积为0.1mm3。四角的大格划分为16个中方格，一般用作白细胞、血小板组织培养的细胞计数。中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格面积为0.04mm2，盖上盖玻片后体积为0.004mm3，每个中方格又分成16个小方格，用于红细胞、微生物细胞的计数。细胞计数原则：细胞压线则计上不计下，计左不计右，镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。对每个试样重复计数3次，取其算数平均值。

2实验仪器、试剂及操作步骤

2.1 实验仪器

超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒

（头）、吸管筒（头）、废液缸、移液器、枪头等

2.2 实验试剂

DMEM培养基、血清、抗生素等

2.3 实验步骤

细胞复苏：

1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。

2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。

3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。

4.自液氮中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，立即投入40℃水浴锅中解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内

全部融化。

5.正确摆放超净台内的实验用品，点燃酒精灯，准备一次性滴管和移液管。

6.将冻存管放入离心机中800转/分钟离心10分钟。

7.小心将冻存管移入超净台中，用75％的酒精棉球擦拭冻存管外部，打开冻存管用巴氏吸管弃上清，

加1mL的DMEM培养基吹打细胞使之均匀，取90uL细胞悬液和10uL台盼蓝染液于小指管中进行活细胞染色计数。

8.剩余细胞悬液吸至一个细胞培养瓶中，在细胞培养瓶中补加4mL的DMEM培养基，将盖子拧好稍回转，

混匀，镜下看细胞密度和状态。看完后细胞培养瓶放进5%CO2培养箱中。

9.整理实验用品，使超净工作台整洁干净。

细胞计数：

1.检查计数板：在正式计数前，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否有杂质或干枯的菌体。若

有污物，则需要按以下步骤清洗：1）擦洗，用药棉蘸取95%酒精，轻轻擦洗计数板的计数室。2）冲洗，用蒸馏水冲洗计数板，并用毛边纸吸干其上的水分，最后用擦镜纸擦干净。3）镜检，镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时，才可用于细胞的计数。

2.加样：先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续2-3

次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。

3.计数：将加好样品的计数板置于显微镜载物台的中央，然后按下列步骤操作：1）找计数室，先在低

倍镜下寻找计数板上的大方格位置。寻找时显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗。然后顺着大方格线，移动计数板，使计数室位于视野中间。2）转高倍镜，转至高倍镜后，适当调节光度，使细胞和计数室线条均清晰为止。然后将计数室一角的中格移至视野中。3）计数，计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右和下的不计算在内。4）重复计数3次，取算术平均值。

细胞数/mL细胞原液=4大格细胞总数/4 X 104

4.清洗：计数完毕后，计数板先用95%酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水冲洗，然后吸干，最后用擦镜纸擦干

净。

3 结果与分析

3.1 细胞计数结果

3.2 细胞复苏结果

图 1 Hela细胞在复苏16h后在显微镜下的状态（放大倍数：7*10）

图注：细胞为人宫颈癌Hela细胞，在复苏后进行培养，图为细胞在复苏16h后的状态，该视野下大约有64个细胞。

结果分析：如表1所示，细胞计数的结果是细胞数目在4.5 X 105 个/mL左右，细胞数量适中，死细胞数目在2.2 X 104 个/mL左右，在可接受的范围内。

如图2所示，细胞在复苏后16h后，大部分细胞贴壁生长，生长情况较好，少部分细胞死亡，悬浮在培养基中。

4 思考题

1.细胞传代的步骤和注意事项？

细胞传代步骤在实验一内容中，细胞传代的注意事项有：1）把握好传代时机，80%~90%的细胞融合最佳，过早传代时细胞量少，过晚时细胞生长状态不佳。2）消化时间要适度，过短时细胞不易脱落，过长时细胞易脱落流失并造成细胞损伤。3）消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失；过低时细胞则不易消化。不同细胞对消化液反应不同。4）细胞传代后，应每日对细胞进行观察，并对细胞进行常规性检测，包括：细胞形态、细胞生长状况、营养液颜色、微生物污染等方面进行检查。

2.如何提高细胞冻存的成活率？

1）慢冻快融，冻存过程要逐步降温；2）选择恰当的冻存保护剂；3）冻存保护剂要提前预冷，滴加过程要缓慢。