WB实验原理

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。

原理

1．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。

2．Western 印迹

在Western印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜），然后可被染色。随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白）检测。Western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。

方法

1.样品的制备

从细胞中提取蛋白质样品用于Western印记的方法有两种，一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞；二是制备细胞提取液。可根据不同的目的采用不同的方法。如果仅是定性实验，可应用第一种方法；如果需测定蛋白含量并进行定量实验，可应用后一种方法。1.1 凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品

1）裂解细胞或组织

a.单层培养细胞：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃去洗液并吸尽残余的PBS液体，

加入一定体积（50～200μl）的加热到85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液[50mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 100mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝，10%甘油] 溶解细胞，用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中，用于步骤2）。

b.悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷

的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris.Cl（pH 7.6），0.001mol/L EDTA （pH 8.0），1μg/ml Aprotinin，100μg/ml PMSF]，涡流振荡混匀后，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液[100mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 4% SDS, 0.2% 溴酚蓝，20% 甘油]，混匀后，用于步骤2）。

c.动物组织：用冷的PBS洗去残血后，加入一定体积用冰预冷的悬浮缓冲液，用剪

刀剪碎，如有必要可在冰浴下匀浆，然后加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀后，用于步骤2）。

2）将样品置于沸水浴中加热10分钟。

3）室温下以10000rpm将样品离心10分钟，将上清移至一新管中，分装后，冻存于-20℃。

1.2裂解缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品

用于制备哺乳动物细胞蛋白质裂解缓冲液有多种，在对靶蛋白的抗原性一无所知的情况下，一般使用三去污剂和单去污剂裂解缓冲液，然后逐步过渡到更专门的提取方法。

三去污剂裂解缓冲液：50mmol/L Tris.Cl（pH 8.0），150mmol/L NaCl，0.02% 叠氮钠，0.1% SDS，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% NP-40，0.5% 去氧胆酸钠

单去污剂裂解缓冲液：50mmol/L Tris.Cl（pH 8.0），150mmol/L NaCl，0.02% 叠氮钠，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% NP-40或Triton X-100。

高盐裂解缓冲液：50mmol/L HEPES（pH 7.0），500mmol/L NaCl， 100μg/ml PMSF，1% NP-40，1μg/ml Aprotinin。

无盐裂解缓冲液：50mmol/L HEPES（pH 7.0）， 100μg/ml PMSF，1% NP-40，1μg/ml Aprotinin。

1）裂解细胞或组织

a.单层培养细胞：用冷PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃取洗液并吸尽残余的PBS液体，

加入一定体积（50～200μl）用冰预冷的裂解缓冲液，置于冰上孵育20分钟。然后用细胞刮刀将细胞刮下，连同裂解缓冲液一起移至微量离心管中，用于步骤2）。b.悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷的

裂解缓冲液，重悬细胞，于冰上放置30分钟后，用于步骤2）。

d.动物组织：用冷的PBS洗去残血后，加入一定体积用冰预冷的裂解缓冲液，用剪

刀剪碎，如有必要可在冰浴下匀浆，用于步骤2）。

2）于4℃以12000rpm将裂解物离心2分钟。

3）将上清移至一新管中，分装后，冻存于-20℃。电泳时取出适量的提取液（50μg）与等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液混合后，置于沸水浴中加热5分钟以使蛋白变性。

2．蛋白含量的测定（Bradford）

2.1 所需试剂

1）0.15mol/L NaCl： NaCl 0.88g

水 100ml

2）0.5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）：BSA 0.5mg

0.15mol/L NaCl 1ml

3）考马斯亮蓝溶液：

在1L容量瓶中，将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml磷

酸，然后补加水至容量瓶体积。用滤纸过滤后，于4℃保存。

2.2 操作步骤

1）分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml BSA（ 1.0，2.5，5.0，10和20μl），以0.15mol/L NaCl补足体积至20μl，同时以两管20μl的0.15mol/L NaCl作空

白对照。

2）每管各加入480μl考马斯亮蓝溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。

3）用1cm光径的比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线。

4）取待测样品2.5μl，补加0.15mol/L NaCl 17.5μl，480μl考马斯亮蓝溶液，混匀后，在A595下比色，从BSA标准曲线中确定待测样品的蛋白含量。如果待测样品

的浓度过高，可稀释后再测。

3．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western 印迹

3.1 所需试剂