培养皿规格细胞计数
细胞培养实验步骤大全(精华版)
细胞培养实验步骤大全(精华版)细胞培养是生物学研究中常用的技术，在许多实验室中都扮演着重要角色。
下面是细胞培养的一般步骤，供参考。
材料准备1. 细胞培养基：根据实验需求选择适当的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 细胞培养器具：培养皿、离心管、移液器等。
3. 细胞培养室：确保环境清洁、无菌。
细胞准备1. 细胞来源：选择要培养的细胞系或原代细胞。
2. 细胞传代：如果使用的是细胞系，根据需要进行传代，确保细胞状态良好。
细胞培养1. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数仪等工具，准确计算细胞数目。
2. 细胞接种：按照实验要求，在含有培养基的培养皿中接种适量的细胞。
根据细胞类型的不同，可能需要预先涂覆培养皿。
3. 细胞培养条件：根据细胞类型的要求，提供适宜的培养条件，如温度、湿度和CO2浓度等。
4. 培养培养：定期更换培养基，保持细胞处于良好的生长状态。
5. 细胞观察：使用显微镜观察细胞形态和生长情况，检测是否存在异常。
细胞处理1. 细胞传代：根据细胞数量和状态，决定是否进行细胞传代。
传代可以延续细胞的寿命和维持细胞应答。
2. 细胞刺激：根据实验设计，给予细胞适当的刺激，如添加药物、因子或介质等。
3. 细胞采集：当需要获取细胞样本时，使用细胞剥离剂或胰蛋白酶等方法将细胞从培养皿中采集。
4. 细胞冻存：如果需要长期保存细胞，可以使用液氮冷冻保存的方法。
先加入冻存液，然后将细胞在适当条件下冷冻保存。
以上是细胞培养的一般步骤，根据具体实验和细胞类型，步骤可能会有所调整和细化。
在进行细胞培养实验时，请始终注意无菌操作和合理使用实验工具，以确保实验结果的准确性和可靠性。
海马细胞实验记录方案
实验记录一、实验名称：海马细胞培养二、实验目的：在细胞水平评估给药后是否能够提高突触可塑性三、实验时间：年月日四、实验地点：五、实验人：六、实验试剂：1.完全DMEM培养基：2.1×PBS：厂家：HyClone；3.0.25%胰酶消化液：4.硼酸盐缓冲液（poly-L-lysine)：5.Neurobasal全培+双抗：6.HBSS缓冲液：七、实验仪器：1.湘仪TD5A-WS台式低速离心机，转子号为853590，水平转子，容量为32×15 ml。
2.培养箱：Thermo SCIENTIFIC培养箱，HERACELL 150i CO2 Incubator。
3.倒置显微镜4.解剖镜八、实验过程：1.准备24孔板，每孔放入一个处理好的玻片，共24孔。
分别加poly-L-lysineBuffer 500μl/孔，放入37℃培养箱中包被2小时以上。
2.4小时后，准备3个10-cm无菌培养皿，分别加20ml的HBSS-buffer，放在冰袋上预冷。
3.用75% 乙醇喷洗剪刀一把、尖头镊子两把、称量勺一把、手术刀片一个；将新生E19小鼠的头和身体分离，把头放在其中一个预冷的平皿中。
4.取大脑：左手用一把尖头镊子压住小鼠头部的眼睛处，右手用手术刀片将头顶处划开，再用另一把尖头镊子扒开头部的皮和脑壳，（注意不要弄坏大脑）右手拿称量勺尾端轻轻插入需出的大脑的底部，轻挑出大脑，放入到另一个干净的平皿中。
5.用上述取大脑的方法将剩余的小鼠大脑取出。
6.取海马体：在解剖镜下，左手用尖头镊子压住小脑处，右手翻开大脑的半球，去除血网，分离血网下的海马体（带状深色，半透明，靠近大脑半球的边缘），将海马体移入最后一个干净的平皿中。
7.用上述取海马体的方法将剩余的海马体取出。
8.全部海马体取出出后，用1ml 枪把海马体轻吸到1个无菌的1.5 ml EP管中，等海马体沉淀后，吸出上清，用PBS清洗10次，1ml/次。
细胞培养
细胞培养
一、复苏
1、开启水浴锅温度设置37℃，预热DMEM。
2、从液氮中取出细胞37℃水浴加热速融。
3、配制培养基：45mL DMEM（HG）+5mL FBS+500ul双抗。
4、将细胞缓慢加入到15mL离心管中，加入5-6mL培养基。
5、800 rpm离心5min。
此时在每个细胞培养皿中加入10mL培养基。
6、吸去上清液，从培养皿中取1mL培养基加入离心管中重悬细胞。
7、将重悬后的细胞加入到培养皿中，放入培养箱中培养。
二、传代
1、开启水浴锅温度设置37℃，预热培养基、PBS、胰酶。
2、取出培养皿，吸去培养基。
3、加入10mL PBS清洗，吸去PBS。
4、加入1mL胰酶消化3min。
5、加入5mL培养基终止消化，吸出到15mL离心管中。
可适当吹打使细胞全部
被收集。
6、800rpm离心5min。
此时在每个细胞培养皿中加入10mL培养基。
7、离心后吸去上清，加1mL培养基重悬细胞，一般情况下一盘分成三盘，将重
悬后的细胞分成三份分别加入到培养基中。
三、细胞计数。
培养皿规格细胞计数
/item.htm?id=131********&ad_id=&am_id=&cm_id=&pm_id=培养器皿面积（cm2）培养液量（ml）细胞量96 孔培养板0.32 0.1 10524孔培养板 2 1.0 5×10512孔培养板 4.5 2.0 1066孔培养板9.6 2.5 2.5×1063.5 cm 培养皿8 3.0 2×1066 cm 培养皿21 5.0 5.2×10610 cm 培养皿55 10.0 13.7×10625cm2 培养瓶25 5.0 5×10675cm2 培养瓶75 15～30 2×107细胞计数（转载）来源：苌生科的日志实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：一、准备工作：取一瓶传代的细胞，待长成单层后以备使用。
二、细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
三、细胞计数：1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数L：按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
细胞生长状况有关指标的检测方法
细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。
所用材料为细胞计数板。
巴氏吸管和显微镜。
步骤如下。
l 取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻擦干。
l 取细胞悬液0.3ml，加入0.9结晶紫染液，混匀后滴半滴于细胞计数板内，以充满不外溢为宜。
也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡。
l 在显微镜下用10X物镜观察计数四角大方格中的细胞数。
代入下式得出细胞密度。
细胞数（ml）=（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞和死细胞数以测定细胞存活百分率。
一般0.5%-1.0%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
此外还可用0.02%的藻红b染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑丝。
细胞存活率=[4大格活细胞数/（4大格活细胞数+4大格死细胞数）]×100%在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/100mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。
二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增值数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。
常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种等量的同一代细胞，经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数的对数为纵坐标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反映出细胞生长的动态。
测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养1周（7天），期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。
也可采用MTT法来进行生长曲线测定。
标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后衰老。
分子生物学与细胞生物学实验基本技术
分子生物学与细胞生物学实验基本技术2005-02实验一组织块培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
二、概述组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。
可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。
但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。
用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。
（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例）三、材料（一）仪器1.净化工作台2.恒温水浴箱3.冰箱（4℃、-20℃）4.倒臵相差显微镜5.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头）3.烧杯（500ml、200ml、10ml）4.广口试剂瓶（500ml）5.玻璃瓶（250ml、100ml）6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩、1×2钩）5.25cm敷料镊（无钩）6.止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式）7.解剖剪（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.1N HCl6.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。
2.组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。
3.平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。
4.剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。
慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装实验的要点：1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代；2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。
尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；实验前要准备的试剂、耗材和仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。
耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。
仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。
第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；实验前准备：安全柜开紫外灯照30分钟；把培养基和试剂放置常温；消化细胞：从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。
细胞铺板：在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。
放置培养箱中培养48h。
插入铺板后图片刚铺板后铺板1天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右；吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。
细胞培养的基本步骤
细胞培养的基本步骤细胞培养是一项重要的生物学技术，通过体外培养细胞系或原代培养细胞，可以研究细胞生物学特性、进行药物筛选和细胞治疗等。
以下是细胞培养的基本步骤：1. 培养皿或细胞瓶的准备：选择合适的细胞培养皿或细胞瓶，通常使用一次性塑料培养皿或细胞瓶，根据不同的细胞类型选择适当的大小和形状。
用肥皂水清洗，再用无菌水冲洗，最后在超净工作台中用无菌滤纸吸干。
2. 培养基的配制：准备含有营养物质和缓冲系统的培养基，常用的有DMEM、RPMI-1640、MEM等，将培养基加入无菌容器中，根据细胞类型和实验需求加入适量的胎牛血清、horse serum、氨基酸、葡萄糖等，最后用高压蒸汽灭菌。
3. 细胞的接种：将体外培养的细胞或原代培养的细胞从冻存管中取出，在超净工作台中用胰蛋白酶消化液消化，轻轻吹打成单细胞悬液，浓度约为1×10cells/mL。
将一定量的细胞悬液接种到培养皿或细胞瓶中，尽量分散均匀。
4. 细胞的饲养：将接种有细胞的的培养皿或细胞瓶放入二氧化碳培养箱中，在含有5%-10%的CO2、95%-90%的空气环境中培养。
培养过程中定期观察细胞生长情况，每天更换一次培养基，根据需要加入适量的胰蛋白酶消化液。
5. 细胞的观察：在显微镜下观察细胞形态和生长情况，记录细胞密度和活力等指标。
定期拍照记录细胞的生长过程。
6. 细胞的传代：当细胞密度达到一定范围时，需要将细胞进行传代培养。
在超净工作台中用胰蛋白酶消化液消化细胞，将培养皿或细胞瓶中的细胞尽量分散成单细胞悬液。
将适量的细胞悬液接种到新的培养皿或细胞瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。
7. 细胞的冻存：将需要长期保存的细胞进行冻存，冻存液通常含有保护剂、DMSO等成分。
将冻存管放入液氮罐中保存。
8. 细胞的计数：定期对细胞进行计数，用血球计数板或细胞计数仪进行计数，根据细胞密度和活力等指标评估细胞的生长状态和活力。
9. 细胞的活力检测：通过MTT比色法、台盼蓝染色法、流式细胞术等方法检测细胞的活力或死亡情况，进一步分析细胞生长特性和药物敏感性等。
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
具体步骤一、ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养。
二、EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
7. 形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
cfu计数法
cfu计数法CFU计数法是一种常用于描述细胞或微生物数量的方法。
CFU的全称是Colony Forming Unit，即菌落形成单位。
CFU计数法的基本原理是通过在适宜的培养基上培养微生物，使其形成可见的菌落，然后根据菌落的数量来估算原始微生物的数量。
本文将详细介绍CFU计数法的原理、步骤和应用。
一、CFU计数法的原理CFU计数法的基本原理是假设每个菌落来自于一个初始的微生物细胞，因此可以通过计算菌落的数量来估算原始微生物的数量。
在进行CFU计数之前，需要将待测样品进行适当的稀释，以确保每个培养基上只有一个菌落形成单位。
当菌落呈现可见的大小和形态时，可以进行计数。
二、CFU计数法的步骤1. 准备培养基：根据待测微生物的特性选择适宜的培养基，如琼脂培养基、血琼脂培养基等。
将培养基加热熔化后，分装到培养皿中。
2. 样品处理：将待测样品进行适当的稀释，以确保每个培养基上只有一个菌落形成单位。
可以使用生理盐水、缓冲液等进行稀释。
3. 接种培养基：将稀释后的样品取适量滴于培养基表面，然后用无菌的分液器均匀地将其扩展开来。
4. 培养：将接种好的培养基培养在适宜的温度和湿度条件下，通常为37°C。
5. 计数：在培养一定时间后，菌落会呈现可见的大小和形态，可以用肉眼或显微镜对菌落进行计数。
6. 计算：根据每个培养皿上的菌落数量，结合稀释倍数，可以计算出原始样品中微生物的数量。
三、CFU计数法的应用CFU计数法广泛应用于微生物学研究和生物制品的质量控制。
在微生物学研究中，CFU计数法可以用于评估抗菌物质的抑菌效果、测定细菌对不同药物的耐药性等。
在生物制品的质量控制中，CFU计数法可以用于检测制品中的微生物污染水平，确保产品的安全性。
四、CFU计数法的优缺点CFU计数法具有以下优点：1. 简单易行：CFU计数法不需要复杂的仪器设备，只需要基本的培养基和培养条件即可进行。
2. 可视化：通过CFU计数法可以直观地观察到菌落的形态和数量，方便进行计数和分析。
微生物细胞大小的测定方法
微生物细胞大小测定一、实验目的了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。
二、实验原理微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。
用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺（图-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。
测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小方格所代表的相对长度。
镜台测微尺（图20-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。
校正时，将镜台测微尺放在载物台上，图1目镜测微尺图2镜台测微尺由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。
三、实验器材1．活材料：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草杆菌(Baccillussubtilis)染色标本片。
2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸。
四、实验方法1．目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。
先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。
细胞培养中细胞活力检测标准操作规程
细胞培养中细胞活力检测标准操作规程一、目的：建立用于细胞培养过程中染色排除法检测细胞活力的操作规范，以确保标准细胞在传代扩增前细胞活力达到一定标准。
二、范围：细胞复苏后冻存前三、仪器：超净工作台、倒置显微镜四、试剂及耗材：4%的台盼蓝染液、载玻片、盖玻片、计数器五、操作规程1.超净台紫外照射灭菌半小时，DMEM高糖完全培养基、1640完全培养基、PBS 溶液在37℃水浴锅中预热，0.25%胰酶平衡至室温。
2.从培养箱中取出培养至细胞丰度达80%以上的贴壁细胞的培养皿，用75%的乙醇喷洒后拿进超净台，用滴管移去培养皿中的培养液，用2mL的PBS溶液清洗细胞一遍，弃去，以洗掉残存的培养液。
3.用移液枪吸取2 mL 0.25%胰酶至培养皿中，轻轻摇晃使胰酶覆盖整个平皿，在显微镜下消化3-5 min，观察培养皿中的细胞直至细胞变圆，从培养皿脱落。
4.向培养皿中加入2 mL的DMEM高糖完全培养基，终止胰酶消化，用吸管吹打细胞至细胞成单分散状态。
将细胞悬液转移至15 mL离心管中，900 rpm离心3min，小心弃去全部上清液。
（若为悬浮细胞，上述步骤可省略。
用吸管轻轻吹打培养液后全部转移入15mL 离心管中，900 rpm离心4 min弃去上清即可。
）5.加入2mL PBS溶液将细胞沉淀吹打均匀，若为悬浮细胞，加入900µLPBS溶液稀释10倍；若为贴壁细胞，加入400µLPBS溶液稀释5倍。
6.取90µL稀释后的细胞悬液，按9:1的量加入10µL 0.4％台盼蓝染色液（终浓度为0.04%），充分混匀，静置3 min。
7.吸取10µL染色后的细胞悬液显微镜下观察，计数细胞总数及染色后细胞。
活细胞圆形透明，死细胞染成蓝色，用活细胞占计数细胞中的百分比表示细胞活力。
每种细胞测三次取平均。
活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%注意事项①染色时间不能太长，否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色，使结果偏低。
细胞培养方法
细胞一细胞培养（一）原代培养○1胰蛋白酶消化法1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块用细胞筛过滤，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养○2组织块法1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（二）传代培养○1贴壁细胞1.先将含10%血清和1%双抗的培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃水浴锅中预热20min2.观察细胞融合率是否达到80%-90%3.将所需用品放入紫外照射30min的超净工作台中，物品放入前需用75%酒精擦拭或放入后立即用酒精擦拭4.吸去培养基，加入PBS冲洗两遍，洗去残留培养基，加入胰蛋白酶至刚好覆盖培养皿底 （6㎝培养皿约1ml），放入培养箱中消化0.5-2分钟5.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀，吸入离心管中，1000r/min离心5min6.离心后，小心吸去上清夜，加入5ml培养基轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml7.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养○2悬浮细胞1.将培养皿中的培养基吸至离心管中，1000r/min离心5分钟2.离心后吸去上清液，加入5ml培养基，轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml3.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（三）细胞冻存○1贴壁细胞冻存1.配置细胞冻存液2.吸去培养基，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶刚好覆盖培养皿底，放入培养箱中消化0.5-2min3.消化后的细胞，转移至离心管中，1000r/min离心5min4．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml5.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中○2悬浮细胞冻存1.配置细胞冻存液2.将细胞转移至离心管中，1000r/min离心5min3．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml4.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中仪器：15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、倒置显微镜、程序性降温盒、液氮罐试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM（高糖）培养基、胎牛血清、二甲基亚砜（四）细胞复苏1.将冻存的细胞从液氮中小心取出，快速在37℃水浴锅中摇晃解冻，一般在1min内完成，若离水浴锅较远可将细胞放置在干冰上2.将冻存管内液体转移至离心管中，1000r/min离心5min3.去除上清液，加入培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至5×105个/ml4.每个6㎝培养皿加入5ml复苏后的细胞，放入37℃，5%CO2培养箱中培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。
培养皿规格细胞计数
培养皿规格细胞计数是一项重要的实验室工作，它可以帮助研究人员评估细胞生长情况并确定最佳的细胞培养条件。
以下是关于培养皿规格细胞计数的1000字回答：一、背景知识细胞计数是生物学研究中的一项基本技术，主要通过计数细胞数量来评估细胞生长情况。
常用的细胞计数方法包括活细胞计数和死细胞计数的区分。
培养皿是一种常见的细胞培养容器，具有较大的容积，可以容纳大量的培养液和细胞。
在计数细胞时，我们需要考虑培养皿的规格对计数结果的影响。
二、培养皿规格对细胞计数的影响培养皿的规格对细胞计数的影响主要体现在两个方面：一是计数难度，二是计数结果的准确性。
1. 计数难度培养皿的规格越大，其中的细胞数量越多，这会增加计数难度。
在计数大量细胞时，容易出现漏计或重复计数的现象。
因此，我们需要采用适当的计数策略，如先对整个培养皿进行粗略的估计，然后对需要精确计数的区域进行细致的观察。
2. 计数结果的准确性培养皿的规格越大，其中的细胞数量越多，但计数结果的准确性不一定越高。
这主要受到以下因素的影响：（1）死细胞的比例：在细胞培养过程中，一些细胞可能会死亡，这些死亡的细胞在计数时不会被计入，因此会使计数结果偏小。
相反，一些活细胞可能会在生长过程中死亡，这些死亡的细胞在计数时会被计入，因此会使计数结果偏大。
因此，我们需要对死细胞进行准确的区分和计数，以获得更准确的细胞数量。
（2）污染细胞的比例：在细胞培养过程中，一些杂质可能会进入培养皿中，这些杂质在显微镜下看起来像细胞，但实际上不是真正的细胞。
这些污染细胞的加入也会使计数结果偏大。
为了减少污染细胞的干扰，我们需要选择高质量的培养基和过滤器，并在显微镜下仔细观察每一个视野中的细胞。
三、结论和建议综上所述，培养皿规格对细胞计数的影响是显著的。
为了获得准确的细胞数量，我们需要采用适当的计数策略和技巧，如先对整个培养皿进行粗略的估计，然后对需要精确计数的区域进行细致的观察；同时，我们还需要注意死细胞和污染细胞的区分和计数。
常见培养皿规格及细胞量
常见培养皿规格及细胞量今天咱们来聊一聊培养皿这个很有趣的东西哦。
你们知道吗？培养皿就像一个个小小的房子，是用来养细胞的呢。
培养皿有不同的大小，就像我们住的房子有大有小一样。
有一种比较小的培养皿，直径大概是35毫米。
想象一下，这个培养皿就像我们平时吃饭用的小盘子那么大。
这种小培养皿里面养的细胞量就不会太多，就好像小房子里住不了太多的人一样。
比如说，可能只能养几十到几百个细胞。
就像一个小小的蚂蚁窝，蚂蚁的数量不会特别多。
还有一种常见的培养皿，直径是60毫米。
这个就比之前的大一些啦，有点像我们家里盛菜的中等大小的盘子。
这种培养皿能养的细胞量就比35毫米的多不少呢。
可能能养到几百个到上千个细胞。
就像一间稍微大一点的屋子，可以住下更多的“小居民”——细胞啦。
再大一点的培养皿，直径有100毫米呢。
这个就很大了，像我们看到的那种很大的圆盘。
在这个大培养皿里，就可以养很多很多的细胞啦，可能会有成千上万个。
这就好比是一个很大的公寓，能住好多好多的人。
那为什么要有不同规格的培养皿呢？这就和我们的需求有关啦。
比如说，科学家叔叔阿姨们刚开始做实验，只是想先观察一小部分细胞的生长情况，就像我们先养几只小宠物看看好不好养一样，那就会选择小的35毫米培养皿。
如果他们想要大规模地培养细胞，就像要养一群小动物，就会选择100毫米的大培养皿啦。
我给你们讲个小故事哦。
有一个小科学家，他刚开始做细胞实验的时候，没搞清楚培养皿的大小和细胞量的关系。
他用35毫米的培养皿想要养很多很多的细胞，就像把一群大象塞进一个小帐篷里，结果细胞都挤得不行，长得一点都不好。
后来他知道了不同培养皿的作用，选择了合适的培养皿，细胞就像在舒服的家里一样，长得又健康又快。
所以呀，了解常见培养皿的规格和能养的细胞量是很重要的呢。
这样我们就能更好地在这个小小的细胞世界里做好各种有趣的实验啦。
是不是觉得很神奇呀？。
培养皿中细菌的计数和单菌落分离要求的菌落数还是有区别的
培养皿中细菌的计数和单菌落分离要求的菌落数还是有区别的教材中出现多次计数的问题，如细菌的计数，酵母菌的计数，标志重捕法动物计数，样方法抽样调查，种群数量的变化规律等。
问题：培养皿内菌落计数得到细菌数需要控制数量范围是多少？菌落的分离需要控制在什么数量范围内？细菌的计数有哪些方法？01试题1：如图是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程。
请回答（1）图中选择培养基应以为唯一氮源；鉴别培养基还需添加作指示剂。
（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1m L，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是，每克土壤样品中的细菌数量为个。
解析：（1）脲酶能够催化尿素分解为氨，因此要从土壤中筛选产脲酶的细菌，培养基应以尿素为唯一氮源；由于尿素被脲酶分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，p H升高，从而使酚红指示剂变红，因此鉴别培养基还需添加酚红作指示剂。
（2）用于计数细菌菌落数的常用方法是稀释涂布平板法，统计的菌落数应介于30～300之间，故选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数．每克该土壤样品中的菌落数对应的应该是每毫升菌液中的细菌数目，所以每克该土壤样品中的菌落数为（156+178+191）÷3÷0.1×105=1.75×108个。
答案：（1）尿素酚红（2）稀释涂布平板 1.75×108个02通过上述试题的菌落计数，发现计算怎么会取后三个数据，舍去13这个数据？而浙科版教材中，明明提到每个培养皿最适宜的是20个以内？（如下所示）那是因为浙科版教材说的20以内，目的是分离菌种，应该有个适当的培养，得到菌落。
接下来，我们还需要把有一定量的菌种取下来，进行扩大培养或保藏。
也就是说，菌落需要生长到一定的大小，如果数量太多，不能得到单菌落，意思是重叠（如下图）。
所以，菌落数控制在20以内，不能太多。
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培养器皿面积（cm2）培养液量（ml）细胞量
96 孔培养板0.32 0.1 105
24孔培养板 2 1.0 5×105
12孔培养板 4.5 2.0 106
6孔培养板9.6 2.5 2.5×106
3.5 cm 培养皿8 3.0 2×106
6 cm 培养皿21 5.0 5.2×106
10 cm 培养皿55 10.0 13.7×106
25cm2 培养瓶25 5.0 5×106
75cm2 培养瓶75 15～30 2×107
细胞计数（转载）
来源：苌生科的日志
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
一、准备工作：
取一瓶传代的细胞，待长成单层后以备使用。
二、细胞悬液制备：
细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
三、细胞计数：
1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数L：按照下面公式计算细胞密度：
（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液与染液是1：1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为1.0mm（长）×1.0mm（宽）
×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3。
四、细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；
2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；
4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。
如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
5.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
五、初学者易犯的错误：
1.计数前未将待测悬液吹打均匀。
2.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
3.滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。
六、本实验特殊试剂的配制：
4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。
使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。
= = = = = = = = = = = = = = = = = = 另一例 = = = = = = = = = = = = = = = = =
步骤：
（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(or Erythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色
-Erythrosin bluish)。
（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。
若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积
=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。
高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；
细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；
细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 最后再随便说说 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~
原理都是一样的，我大部分也是借鉴集体智慧的结晶
我个人在做的时候感觉最重要的就是悬液一定要摇均匀，否则对后续的计数影响很大
而实际上做起来也是挺简单的，多做几遍，主要的几点记住了就OK（笑）
最后，也是最重要的一点
一定要调好焦距，我们要计数的只是细胞，千万别计数其他的杂质（我最初很乌龙，汗；还好知道的人不多 = =+）。