人工冬虫夏草不同部位核苷类成分分析

Key words: artificial Cordyceps; adenosine; adenine; cordycepin; high -performance liquid chromatography;
determination
冬虫夏草作为我国传统名贵的药用植物，由 于特殊的生长要求，市场的需求量在不断增加，
LU Yan-yan 1, QIU Xi-min 1*, JIANG Cheng1, LIU Sheng-zi 1, GUO Si-wei 1, CHEN Wen2
(1.Pharmacy Department of Medical College of Hunan Normal University, Changsha 410006; 2.Changsha Medical University, Changsha 410219)
中不但子实体含有腺嘌呤、腺苷和虫草素，菌丝体及固体培养残基也含有这 3 种主要核苷类物
质，具有进一步开发利用价值。
关键词： 人工冬虫夏草；腺苷；腺嘌呤；虫草素；高效液相色谱法；含量测定
中图分类号： TS 567.3+5
文献标志码： A
文章编号： 1005-9989(2011)04-0250-03
Analysis of nucleoside constituents in different parts of the artificial Cordyceps sinensis
收稿日期： 2010-09-07
* 通讯作者
基金项目： 国家大学生创新性实验项目(043-0094)；湖南省教育厅重点项目(10A071)。
作者简介： 陆艳艳(1985—)，女(侗族)，硕士，主要从事中草药分离分析研究工作。
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2011 年 第 36 卷 第 4 期
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
305.6 ng 范围内线性关系良好。
内稳定，满足实验要求。
2.5 重复性实验
2.8 回收率实验
取虫草子实体粉末，平行提取 5 份， 在拟定
精密称取虫草子实体粉末各 9 份，每份约 5 g ，
HPLC 条件下测定。结果腺嘌呤平均值为 194. 87 平均分为 3 组。分别加入与试样含量相当的腺嘌
μg/g， RSD 1.8% ； 腺 苷 的 平 均 值 为 1 302.96 呤、腺苷和虫草素，按 2.2 制备供试品溶液，测定
平均回收率/% 98.02 98.56 99.09
RSD/% 1.3 1.2 1.2
2.9 样品含量测定 分别将 3 个样品的供试液进样测定。测定结
果见表 2、表 3、表 4。
表 2 人工冬虫夏草不同部位虫草素含量比较(n=5)
样品
不同批次含量置信区间/(μg/g)
子实体
1356.92±0.74
菌丝体
无水乙醇、石油醚：分析纯；甲醇：色谱纯； 超纯水：自制；腺嘌呤、腺苷标准品：Sigma；虫 草素标准品(98%)；人工冬虫夏草药材：益康高科 技生物医药有限公司。
2 方法与结果
1
2.5
5.0
7.5
10.0
mL
图 3 子实体 HPLC 图
3
2 1
2.1 色谱条件与系统适应性实验 流 动 相 : 甲 醇 - 水 (20 ∶80) ， 依 利 特 ODS(4.6
1101.040±0.37
固体培养残基
350.96±0.14
RSD/% 2.0 4.4 Байду номын сангаас.4
表 3 人工冬虫夏草不同部位腺苷含量比较(n=5)
样品 子实体 菌丝体 固体培养残基
不同批次含量置信区间/(μg/g) 1302.52±0.47 635.02±0.14 171.73±0.06
RSD/% 1.3 1.6 3.4
本实验结果表明， 湖南益康高科技生物医药 有限公司培养的人工冬虫夏草子实体、菌丝体及 固体培养残基中都含有核苷类物质，仅含量有差 别，其中子实体中核苷类量最高，虫草素含量明 显高于文献报道的西藏虫草(5.4 μg/g)和蚕蛹虫草 (726 μg/g)[4]，菌丝体和固体培养残基亦含各有效
取腺嘌呤、腺苷、虫草素对照品适量，精密
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食品安全与检测
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称定，配制成质量浓度分别为 0.1、25、19.1 mg/L 2.6 精密度实验
的对照品溶液[8]。
精 密 吸 取 质 量 浓 度 分 别 为 0.1、 25.0 、 19.1
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人工冬虫夏草不同部位核苷类 成分分析
陆艳艳 1， 邱细敏 1*， 蒋 诚 1， 刘胜姿 1， 郭思维 1， 陈 文 2 (1.湖南师范大学医学院药学系，长沙 410006； 2.长沙医学院，长沙 410219)
围内呈线性关系; 腺苷: Y =83 838 X - 5 687.1 ， r =
取虫草子实体溶液 1 份，分别于 0、2、4、6、
0.999 6 ，在 24.0～400 ng 范围内呈线性关系; 虫草 8、12 h 测定，记录色谱图，测定结果腺嘌呤、腺
素: Y =91 351 X + 35 403 ， r = 0.999 6，在 19.1 ～ 苷、虫草素的 RSD 均小于 3%，样品溶液在 12 h
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野生虫草已经远远不能满足当前需求。20 世纪 70 年代以后，我国开始进行人工冬虫夏草培养及药 理方面的研究， 取得显著成果[1]。核苷类物质为冬 虫夏草有效成分之一，尤以腺嘌呤、腺苷和虫草 素具有明显的药理作用， 可用于调节免疫力，治 疗肝 肾疾 病 和 抗 肿 瘤 等 [2- 3]。 目 前 人 工 冬 虫 夏 草 药 用部位主要采用子实体，本实验针对工业生产中 的副产物菌丝体未能充分利用，固体培养残基更 是作为废料处理的浪费现象，以湖南益康高科技 生物医药有限公司培养的人工冬虫夏草为样本， 通过测定比较人工冬虫夏草不同部位及固体培养 残基中核苷类物质的含量差别，力图为进一步开 发利用人工冬虫夏草资源提供参考。
3 讨论 色谱条件的选择 流动相的选择：调整甲酸 -
表 4 人工冬虫夏草不同部位腺嘌呤含量比较
样品 子实体 菌丝体 固体培养残基
不同批次含量置信区间/(μg/g) 197.29±0.28 144.05±0.16 70.08±0.10
RSD/% 4.0 5.0 2.2
水、乙腈 - 水、甲醇 - 乙腈 - 水的比例及尝试钾 盐缓冲溶液，考察柱子的分离度、对称性及理论 塔板数，最终确定 HPLC 测定的最佳流动相：甲醇 - 水(20∶80)。
进样 1 、4 、8 、12 、16 μL ，以进样量(μL) 对 算三者的 RSD 分别为 0.27%、0.19%、0.16% 。结
峰面积( A) 作回归方程，分别为：腺嘌呤：Y =8 果表明， 仪器精密度良好。
410 X - 2 180.3 ， r = 0.999 2 ，在 1.0～16.0 ng 范 2.7 稳定性实验
加入标样量/mg 0.1973 0.1973 0.1973 1.3025 1.3025 1.3025 1.3569 1.3569 1.3569
测得量/mg 0. 1966 0.1934 0.1902 1.3010 1.2631 1.2873 1.3219 1.3541 1.3575
回收率/% 99.64 98.02 96.40 99.88 96.97 98.83 97.42 99.79 100.0
1 仪器与试剂
3
12
2.5
5.0
7.5
10.0
mL
图 2 固体培养残基 HPLC 图
3
2
1.1 仪器 高效液相色谱仪：HPLC - 2010，紫外检测器，
SHIMADZU(LC- solution 工作站)；色谱柱：依利特 Sinochrom 300A ODS(4.6 mm×200 mm)；超声清洗 仪：AS 2060，autosience；超纯水制备仪：Water Purifier。 1.2 药材与试剂
2.5
5.0
7.5
10.0
mL
图 4 菌丝体 HPLC 图
2.2 供试品溶液的制备
取人工冬虫夏草干品的子实体、菌丝体及固
体培养残基适量，粉碎称质量，加无水乙醚于圆 底烧瓶中，连续回流脱脂。过滤药渣风干后用 8 倍量沸水回流提取 3 次，分别以 10、6、6 倍体积 的沸水，各提取 2、1、1 h，合并抽提液[5]，浓缩 后，用 3 倍体积无水乙醇沉淀 3 次，室温下放置 24 h ，离心 15 min(3000 r/min)，上清液为核苷类物 质[9-10]。精 密量取上清 液 0.1 mL 于 10 mL 容量 瓶 中， 流动相稀释至刻度， 摇匀， 过滤， 取续滤 液， 即得。 2.3 对照品溶液的制备
μg/g，RSD 1.8%；虫草素平均值 1 316.93 μg/g， 回收率。实验结果见表 1。结果表明，回收率满足
RSD 1.2%。证明此方法重现性良好。
实验要求[6]。
表 1 加样回收率实验结果(n=5)
编号 1 2 3 1 2 3 1 2 3
取样量/g 1.004 1.009 1.013 1.017 1.019 1.018 1.009 1.008 1.009
2.4 线性关系和线性范围实验
mg/L 的腺嘌呤、腺苷、虫草素对照品溶液 8 μL ，
取腺嘌呤 1.0 mg/L，腺苷 25.0 mg/L ，虫草素 在上述色谱条件下，连续进样 6 次，峰面积值平
19.1 mg/L 的对照品溶液，在上述色谱条件下分别 均值分别为：62 865.4、694 330.4、726 705.0，计