4原生质体培养和融合
细胞工程___第四章原生质体与细胞融合用
五.原生质体鉴定
1)低渗爆破法：无壁吸水向外膨胀直至胀破，是无形 的。有部分细胞壁，则原生质体从破碎后留下的残 迹仍保持半圆形的细胞壁。
2)荧光染色法:将原生质体放大离心管中，加入0·7mo l/L甘露醇配置的0.05%~0.1%荧光增白剂溶液，染 色5-10Min ，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光 显微镜下观察(波长3600-4400A0)。绿色光显示纤维 素的存在，发出红色光的没有纤维素的真正的原生 质体。
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质 体的稳定性与活性，促进细胞壁形成及细胞分裂等。
常用质膜稳定剂有：
葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl•2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid 2-( N-吗啉代)乙磺酸
作用：不但具有质膜稳定作用，还具有缓冲作用，调 节pH值。
(4)氧电极法:有活力的原生质体在光照下会进行光合 作用而放出氧气，在没有光照的条件下进行呼吸而 耗氧。因此，可以采用氧电极来测定氧的变化来原 生质体是否具有活力。
第二节 细胞融合
一、细胞融合的概念
细胞融合，也称原生质体融合，或体细 胞杂交。是指两种异缘（种间、属间）原生 质体，在诱导剂诱发下或电冲击下，发生膜 融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞， 进一步发育成杂种植物体。
甘露醇
0.6 M
CaCl•2H2O
0.5%
MES
5.0 mM
pH
5.8
6、原生质体的游离与纯化(以叶为例)
1）、原生质体的游离
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将 去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无 菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表 皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在 酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉， 留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
修改第八章原生质体培养和融合
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8
使用的酶主要有： 纤维素酶(Cellulase)、 果胶酶(Pectolyase)、 离析酶(Macerozyme )、 半纤维素酶(Hemicellulase) 崩溃酶(Driselase)， 其中纤维素酶和果胶酶是最必要的。
a
9
酶液中的渗透压是原生体分离的另一个因素，植物细 胞去壁后，必须由合适的渗透压替代细胞壁维持的机械压力， 酶液中的渗透压过低会使细胞吸涨而破裂；渗透压过高，细 胞除受到渗透压力而破裂外，还会损害细胞生长代谢 。
培养基，将适当密度的原生质体悬浮液加在含琼脂的培养基上。 液层较浅，有利于通气，而且固体培养基中的养分可以释放到 液层中去，以补充培养物对养分的消耗。另外培养物中的代谢 产物对原生质体的生长不利，可以为固体层所吸收，降低或消 除毒害。
a
14
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
原生质体纯化(以柑桔原生质体为例，界面法)
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15
果胶酶和 纤维素酶
过滤、离心
原生质体制备流程（以叶片为例）图
a
17
第二节 原生质体的培养
一、原生质体培养的方法 1. 液体培养
培养基中不加凝固剂，仅仅用液体培养基按所需植板密度重悬 原生质体后，直接植板在培养皿中即可。 液体浅层培养法是目前 原生质体培养中广泛应用的方法之一。 优点：操作简便，对原生质体伤害小，有利于通气。 缺点：容易使原生质体互相粘连、聚集，导致原生质体损坏；并且 难于定点观察监测单个原生质体的发育过程。
a
13
***沉降法：利用密度不同沉降速率不同的原理，低速离心使 原生质体沉于离心管底。此法方便，但不易除尽一些完整的 细胞或破碎的原生质体。 ***界面法利用原生质体和破碎细胞比重不同，低速离心条件 下完整的原生质体漂浮于密度不同的两相分界处，碎片留在 低层相中，可从两相界面收集到高纯度原生质体。
原生质体无菌分离培养与融合
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离 心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法
头，滤膜（*4） 和电融合法。
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。 加1ml13%CPW洗液悬浮。
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，滤膜（*4）
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主 质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有
效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而 具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一 些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够 长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。
材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 原生质体的酶解与分离（无菌条件）
个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 CPW洗生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
原生质体融合育种
（二）原生质体融合的影响因素 １、融合剂 电场融合的优点： 适于动植物、微生物细胞；融合频率高 可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合 钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生 复原： 再生培养基 细胞壁重建 形成菌落 P239 图9.8
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母细胞壁结构和遗传标记 菌龄对原生质体形成影响大 亲本灭火的方法：紫外线
热 药物
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节 霉菌原生质体融合育种 二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长 （3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种 三、原生质体转化育种 何种形式DNA转化率高？ 质粒
第一节 微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种 脂质体转移 原生质体转染等
第二节 微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原 生质体发生融合，并产生重组子的过程。
原生质体融合操作方法
原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起，以形成单一的细胞。
在实验室中，原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。
以下是一种常用的原生质体融合操作方法：
1. 制备原生质体：收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。
用酶类解除细胞壁以获得原生质体。
2. 制备混合物：在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。
3. 让细胞融合：通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损，让细胞形成互通。
4. 分离融合物：将融合物分离出来，并放在一个合适的培养基上培养。
5. 检测融合结果：使用显微镜观察细胞是否真正融合，或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。
需要注意的是，原生质体融合需要谨慎操作，避免损坏细胞结构或引入杂质。
在实验中，需要仔细选择不同类型的原生质体，以确保它们能够融合。
14.4原生质体融合的方法
原生质体融合的方法原生质体融合又叫体细胞杂交，是指将不同来源的植物原生质体进行融合，再经培养获得杂种植株的过程。
一、盐类融合法1909年，Kuster用低渗NaNO溶液引起原3生质体的融合。
融合方法获得1972年，Carlson等用NaNO3了第一株体细胞杂种，即烟草与其野生种间体细胞杂种（粉蓝烟草与郎氏烟草）。
原理：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2、NaCl、CaCl2等。
通过改变细胞膜表面的理化特性，增加细胞的内吞作用，而实现融合。
应用最早的融合法，但由于异核体形成率低，且对细胞有毒害，目前已不太应用。
二、高钙-高pH融合法1973年，Keller和Melchers用强碱性的高浓度钙离子（5mM CaCl2·2H2O，pH10.5）溶液融合烟草叶肉原生质体，获得种内及种间体细胞杂种。
原理：CaCl 2•2H 2O 0.05mol /L ，pH9.5-10.5，可使质膜表面特性发生改变，而发生融合。
异核体形成率有所提高，但对细胞有一定毒害，目前已不太应用。
三、聚乙二醇（PEG）融合法1974年，Kao和Michaylub用聚乙二醇(PEG)作融合剂，明显提高了异核体的形成率，且对细胞的毒性很低。
因此，该方法迅速展开。
1978年，用PEG法，成功获得了西红柿与马铃薯第一个属间体细胞杂种。
薯番茄或番茄薯PEG融合原理：短时间内，细胞质膜粘连，形成分子桥，进行融合。
四、PEG 、高钙-高pH 相结合的融合法PEG 融合液PEG600030%Ca(NO 3)2•4H 2O0.1M 甘露醇0.4-0.6M pH 10.0五、电融合法开发较晚，1979年，Senda发现电融合方法。
由于对细胞无毒害，已广泛应用。
电融合必须有融合仪和融合板。
电融合仪融合板两个电极原生质体电融合的基本程序①细胞膜的接触：两极通以交变电流，使原生质体沿电场方向排列成串珠状；②膜的击穿：再给以瞬间的高强度电脉冲，使原生质体膜局部受损失而导致融合。
遗传学ppt课件第4章 原生质体培养及融合配色
缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害， 因而活力高的原生质体较少。
B、离心沉淀法
酶解产物 +原生质 体培养基
0.45mol/L甘露醇 400g，5min
碎片带
原生体
利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然 后再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离
经酶液处理后，细胞壁被降解，释 放出球状原生质体。为使原生质体从组 织上解离下来，酶解的最后2小时需轻 度振荡，速度为45转/分（rpm）。
酶解液
酶解后的产物包括：
完整原生质体
破碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片 酶及其它不利于原生质体培养的试剂。
五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以
104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基
→ 固体增殖培养基 → 再分化培养基 → 器官、胚胎或植株分化。
培养方式详见第二节。
1）液体培养
分成三个阶段
➢ 培养基Ⅰ：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水 解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露 醇，pH 5.8
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
4.原生质体培养与细胞融合(植物组织培养)
原生质体培养与细胞融合第一节原生质体培养一、原生质体的培养概况1、概念：植物的原生质体：指除去细胞壁以后的裸露细胞。
原生质体培养：是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完整植株的过程。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功。
2、原生质体培养的意义①比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
②便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本科植物，高光效植物，高抗植物）③原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等3、原生质体培养程序取材→预处理→分离→纯化→活力检测→培养→细胞壁再生→细胞分裂分化→愈伤组织→愈伤分化→再生植株取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、愈伤组织或悬浮细胞预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
二、原生质体的分离和纯化1 原生质体的分离叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。
细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。
分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法（1）机械法①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状；②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。
（缺点）获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。
原生质体的分离与融合
02
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。
诱导原生质体融合
03
杂种植株的再生与鉴定
选择融合体或杂种细胞
(一) 原生质体融合
原生质体融合（Protoplast fusion）是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。 自然融合（Spontaneous fusion） 来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达50~70%。实际上自然条件下受精就是一种自发融合。
2.酶法
原生质体的分离
01
二、影响原生质体分离的因素
01
原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透
02
压、酶解时间、温度等。
03
组织和细胞材料的生理状态
04
植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体
05
的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很
06
容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应
添加标题
质杂种。
体细胞杂交
物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。
01
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。
01
体细胞杂种的应用
一、体细胞杂种的应用潜力
添加标题
植物育种中的核质替换
添加标题
细胞质杂种的获得
添加标题
远缘杂交创造新物种
原生质体培养与融合
飘浮法
采用比原生质体密度大的高渗溶 液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯 化方法。 优点： 可以避免分离的原生质体因震 荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不 好，原生质体则不易漂浮。可采 用不同浓度和不同离心速度分次 漂浮的方法。
影响原生质体培养的因素
培养条件
温度，光照
植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
供体细胞的生长同步性
原生质体再生过程
原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质 体在适当的培养方法和良好的培养条件下， 很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细 胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分 化出完整植株的过程。 细胞壁再生 细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 植株再生
胡萝卜培养 6d 细胞
8~10d形成细胞 10~ 5~30 团，4周后形成 20 胚状体
矮牵牛愈伤 4d 组织 2~ 油菜叶片 3d
10
马铃薯子叶 48h 46.1 马铃薯花粉 2h
2周后形成20~25 个细胞的细胞团 15d形成细胞团 28d愈伤组织 9~10d形成16个 细胞的细胞团 15d形成细胞团
影响原生质体培养的因素
原生质体的活力
原生质体的起始密度
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生
质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能 分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率 常显著提高。
渗透压稳定剂 培养基营养
原生质体培养经常使用的KM-P培养基就
是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS 培养基为基础 改进的。
渗透压稳定剂
植物细胞原生质体的制备与融合
植物细胞原生质体的制备与融合。
1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。
此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。
（2）原生质体融合：即体细胞杂交。
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。
若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。
2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。
在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。
如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。
游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。
基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。
（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。
但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。
因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。
常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。
对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。
最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。
①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。
③酶解：除菌绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。
经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
原生质体培养及融合
主要方法： 漂浮法、界面法和沉降法等。
30
A. 漂浮法：使用的飘浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，是由聚乙烯
吡咯烷酮包被的SIO2颗粒的无菌胶体悬液）、Ficoll（菲可，水溶 性聚蔗糖）。
原理：采用比原生质体比重高的渗透溶液，使原生质体漂浮在 溶液表面，具体方法为：
子叶/叶片 下胚轴
39
五、原生质体培养
培养密度很重要（原因）：一般以104-105个/ml为宜。 常用的培养方法：液体浅层培养、固体平板培养、 固－液双层培养
40
1) 原生质体的培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进 行培养。
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养 基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现 象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况。
9
4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作 研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞 器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗 传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。
10
胞质体( cytoplast ) ：不含细胞核，只有细胞质。 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。
4
细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
5
原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同 种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离 体培养，使其再生成为杂种植株的技术。
植物原生质体培养及细胞融合过程
3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
植物原生质体培养及细胞融合过程
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离
（一）材料来源
植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织 以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。
果胶酶/纤维素酶 纯度高， 但浓度不来自太高； 木本植物加入半纤维素酶。
植物原生质体培养及细胞融合过程
◆渗透稳定剂
如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。
①糖溶液系统
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；
②盐溶液系统
包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，
提高原生质体的稳定性植物；原使生质R体培N养A及酶细胞不融合活过程化；并使离子稳定。
细胞壁的组成
纤维素 半纤维素 果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶
少量蛋白质
植物原生质体培养及细胞融合过程
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，
原生质体融合技术简介
2 原生质体的制备
获得有活力、去壁较为完全的原生质体是原生质 体融合育种技术的先决条件。 在细菌和放线菌中，制备原生质体主要采用溶菌 酶；制备葡萄球菌的原生质体，则需用溶葡萄球 菌素处理；制备酵母菌的原生质体时， 一般可用 蜗牛酶；制备丝状真菌的原生质体时，可用蜗牛 酶，在丝状真菌的原生质体制备中很少单独使用 一种酶，而是采用两种或三种酶混合处理。 另外，影响原生质体制备的因素有许多，主要是 菌体的性质 ，酶的性质以及反应环境
(1)直接法 原生质体融合后直接分离到MM或SM上，即可 (1)直接法 原生质体融合后直接分离到MM或SM上，即可 直接检出融合细胞。其优点是只需一步就可得到重组体， 而大多数重组体是稳定的，缺点是难以检出那些表型延 迟而基因已重组的融合体。 (2)间接法 把融合产物分离到CM上，使原生质体再生， (2)间接法 把融合产物分离到CM上，使原生质体再生， 融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到SM上。其 融合和非融合的原生质体都能生长，再分离到SM上。其 优点是能促使细胞更好地再生，表型延迟重组体容易检 出。缺点是需要两步才能检出重组体，需要相当大的人 力和物力，而且得到的重组体不大稳定。 直接法和间接法都要用营养缺陷性标记，所得重组体不 一定能提高目的产物的产量。 (3)钝化选择法 (3)钝化选择法 钝化选择法是指灭活原生质体和具活性原 生质体融合，把亲株中的一方（野生型）原生质体在 50° 热处理2 50°C热处理2-3小时，使融合前原生质体代谢途径中的 某些酶钝化不能再生，再与另一方（双缺陷性）原生质 体融合，并分离到mm上，灭活除用加热方法外，还可以 体融合，并分离到mm上，灭活除用加热方法外，还可以 用紫外或药物处理。
3 原生质体的再生
酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能 重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂， 这是原生质体融合育种的必要条件。仅有细胞质膜 的原生质体对渗透压很敏感、很容易破裂，致使原 生质外流而使细胞死亡。所以，再生培养基必须与 原生质体内的渗透压相等。这就要在再生培养基中 加入具有一定渗透压的基质，即渗透压稳定剂 原生质体的再生是一个非常复杂的过程．一些学者 研究认为，若原生质体的细胞壁剥去得不太彻底， 则有助于细胞壁的再生，残留的细胞壁尤如结晶时 的“晶种”一样。大量实验也证明，破壁太彻底往 晶种” 往会引起原牛质体再生率的大大率较高 由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融 合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂 交频率都明显高于常规杂交方法。 2 受接合型或致育性的限制较小 由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用， 因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质 体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合 型或致育性的限制就比较小。 3 重组体种类较多 由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发 生相互接触．有机会发生多次交换，可以产生各种各样 的基因组合而得到多种类型的重组体
原生质体分离与融合
原生质体的分离、融合与培养一、实验目的1.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理。
2.掌握植物原生质体分离、融合和培养的基本过程。
3.了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。
二、实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
三、实验材料、试剂与仪器1．材料新鲜的菠菜叶片2．试剂（1）酶液：依次加入 1.25%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.04%甘露醇、20mmol/LKCl和20mmol/L2-吗啉乙磺酸（MES），55℃水浴10min，冷却至室温，再加10mmol/LCaCL2、5mmol/Lβ-巯基乙醇和0.1%BSA，0.45um微孔滤膜过滤，溶液呈透明橙色。
（2）PEG溶液：4GpPEG4000\3mL去离子水、2.5mL0.8mol/L甘露醇和1mL1mol/L CaCL2。
（3）MMg溶液：0.4mol/L甘露醇、15mmol/LMgCl2、mmol/LCaCl2和4mmol/LMES。
原生质体制备与融合
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• 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
细胞壁脱去后，原生质体必须在高渗环境中保存及生长，否则会 因为渗透压而破裂。因此，渗透压稳定剂也是影响原生质体制备的重 要因素。
0.5% 纤维素酶+1mol/L 的 山梨醇处理Lecanicillium sp.
高倍显微镜下酶解前 Lecanicillium sp. 菌丝
混合酶液处理 Lecanicillium sp. 制得原生质体（×200）
原生质体的融合
原生质体的融合的不同产物
电诱导融合法： 短时间强电场作用， 质膜发生可逆性电击 穿，促使原生质体融 合
原生质体融合的方法
激光诱导融合法： 让原生质体先紧密 贴在一起，后用激 光对接触处照射， 使细胞融合
化学诱导融合法
• 酶解时间、温度、pH值对原生质体制备的影响
酶解时间的长短直接影响原生质化的效果，处理时间过短，脱壁 不完全，处理时间过长，会导致原生质体脱水皱缩，再生率显著降低 。而且不同的的酶都有各自的最适酶解温度。酶解时温度选择的原则 是既有利于原生质化，又能防止原生质体被破坏。酶解时的pH值随 酶和物种有一定的差异，需根据实际情况对pH值进行优化。
影响原生质体融合的因素
• 无机离子对原生质体融合的影响
原生质体融合过程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促进融合，而 K+、Na+会显著降低融合率。
• 融合剂PEG对原生质体融合的影响
仅将原生质体混合在一起融合率并不高，需要添加融合剂来提高 融合率。PEG较常使用。PEG的相对分子质量和浓度高低对融合都有 较大的影响。PEG浓度过高会导致原生质体皱缩甚至是中毒，过低导 致原生质体破裂。
融合子的筛选
原生质体融合
利用仙台病毒诱导细胞融合的步骤： （1）先将亲本细胞（待融合的细胞）分别制成悬浮液、 混合离心； o （2）将沉积细胞悬于灭活的仙台病毒悬液里，在4 C 低温下摇动20分钟，使细胞形成凝集块； （3）再将温度升至37oC，间歇摇动30分钟，使其融 合； （4）洗去病毒，将融合细胞浮于选择性培养基进行培 养。
植 物 原 生 质 体 融 合 及 再 生 植 株 过 程
杂种植株的鉴定方法：
（1）杂种植物形态特征、特性鉴定 （2）杂种植物的核型分析 （3）同工酶分析 （4) 分子标记鉴定：RFLP、AFLP、SSR、 ISSR 、RAPD标记鉴定
形态学鉴定
形态标记即植物的外部特征，如花的形状及颜 色、果实(种子)的形状及颜色、叶型、表皮毛、株 型、穗型、千粒重、耐逆性以及对疾病的抗性等。 形态标记简单直观，但是标记少、多态性差、易受 环境条件和其它修饰基因的影响，并且许多性状为 数量性状，由几个位点控制，表现为一个范围，而 不是简单的性状差异。
第三节、植物原生质体技术及应用
一、原生质体分离 二、原生质体分离及纯化操作 三、原生质体培养 四、体细胞杂交（原生质体融合）
1 体细胞杂交研究历程及一般概念 2 体细胞杂交的一般流程
3 杂交细胞的鉴定
4 细胞杂交的应用
五、原生质体的遗传饰变
（一）体细胞杂交的含义及研究历程
概念：不同亲本（种间或属间等）的原生质体，在人 工诱导下，相互接触，从而发生膜融合、胞质融合、 核融合并形成杂种细胞，经过培养进一步发育成杂种 植株。这一过程称为原生质体融合或细胞杂交。 原生质体融合的意义
电融合仪
Fusion phases of oat（燕麦）protoplasts (Avena sativa)
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1、 离心沉淀法
原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原 生质体沉于底部。
步骤： • 第一步：原生质体溶液用400目网筛过滤。 • 第二步：离心（500~1000r/min离心5~6min）。 • 第三步：吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）
重新悬浮，再离心沉淀。如此2~3次。 • 第四步：用原生质体培养液洗1次，收集原生
对幼叶来说，酶浓度较低：0.5％-1％纤维 素酶，果胶酶(0.2％-0.5％); 酶量少
对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶 酶的浓度要提高到1％或2％。酶量大 酶液PH值：5.4 - 5.8
PH高，酶活性低 PH低，原生质体损坏多
2.3 酶液渗透压
• 裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下， 才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。 因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁 对原生质体起保护作用。
•常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、 山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。
目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地 维持渗透浓度。而蔗糖等易被原生质体吸收利用， 降低渗透浓度，故不常用。
2.4 材料预处理 (暗处理，预培 养和低温处理)
在酶处理前，常把供体组织置于合适浓 度的稳压液中，预质壁分离约一小时后再用 酶液处理。
2-6 其它
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
2-7 原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
• 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
• 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
• 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6
质体。
洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇，
10mmol/LCaCl2 ` H2O, 0.7mmolK H2PO4,
洗涤液pH： 5.6
2 、 接口法
•原理：选两种不同渗透浓度的 溶液，其中一种溶液的密度大于 原生质体的密度，另一露醇溶液
细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。 因为细胞壁不仅具有保护功能，还参
与细胞的生长和分化等生命活动。
但是：原生质体必须再生出细胞壁才能
继续发育。
二、原生质体分离及培养
（一） 分离方法 1. 机械法：利刃机械切割 2. 酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
2.Enzymatic isolation
2.1 材料 •获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的 植物体幼嫩部分。
1986年：Spangenberg单个原生质体培养成功；
2、原生质体培养的意义
（1）为细胞融合奠定基础。
有性杂交不能进行细胞质交流
（2）是遗传工程的理想受体。
能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。 原生质体也具有全能性
原生质体是分子水平和细胞水平上研 究遗传信息动态的结合点
（3）理论研究
•叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显 的叶绿体，便于在融合中认识。但禾本科叶肉 原生质体往往不能分裂，因此，常采用悬浮细 胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是 处于对数生长早期的细胞。
2.2 酶的种类和浓度
纤维素酶（Cellulase） Onozuka R-10 果胶酶（Pectolyase）Y-23 半纤维素酶（Hemicellulase）
高尔基体
液泡
微丝
叶绿体 线粒体
质膜
细胞核 内质网 微管 细胞壁
细胞壁由三种主要成分构成 纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%
一、原生质体培养发展简史及其意义
1、发展简史
1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体；
1960年： 1960年英国诺丁汉大学Cocking 教授 率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度 活性可再生的番茄幼根细胞原生质体；
• 第四步：将小块烟叶放入混合酶液25 ℃处理8~10 小时
• 第五步：过滤、离心、洗涤（ 0.7 mol甘露醇液 含0.1 m mol CaCl2 ）。如此2~3次、得原生质体
图示原生质体分离过程（以叶片为例）
加果胶酶 和纤维素酶 过滤、离心
（二） 原生质体纯化
• 酶解处理后得到混合液包括原生质体、 细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶 液除去，才可以继续培养。
1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场；
1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分 离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法。
1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首 次获得再生植株。
1993年有49个科、146个属的320多种植物， 经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主 要是农作物和经济植物，从一年生扩展到多 年生，从草本到木本、从高等植物到低等植 物，食用菌、藻类、大豆、棉花、油菜、水 稻、玉米、柑桔、猕猴桃、桃、苹果、马铃 薯、胡萝卜、黄瓜、杨树、云杉等；
原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增 加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度； 降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来 酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在 的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活 率。
2-5 酶解处理的条件
光：一般黑暗下静止进行； 温度：25℃，兼顾原生质体及酶活性； 时间：几小时到几十小时，太长不利于原 生质体的活性，一般<24小时。如烟草叶片 酶处理2小时后叶肉细胞解离完毕。
25%蔗糖溶液
3、 漂浮法
原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使 原生质体漂浮在液体的表面。
洗涤液：3%蔗糖 + 0.4mol/L甘露醇+ 1480mg/LCaCl2 2 H2O 。或11%~23%的 蔗糖溶液。
4.原生质体培养与融合
原生质体培养的意义 原生质体操作方法 原生质体融合的意义 融合方法 体细胞杂种鉴定方法
原生质体（Protoplast）
• 1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开 的那部分细胞物质。
• 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的 裸露细胞。
细胞
植物细胞模式图