白细胞介素

白细胞介素的分类



IL-11：il-11由骨髓基质细胞产生，分子量约为23kd，是造 血微环境中一个多功能的调节因子。 IL-12：il-12主要由b细胞和巨噬细胞产生；其分子是一种 异型二聚体，40kd（p40）和35kd(p35)的2个亚基通过二 硫键相连接。 IL-13:细胞来源：il-13由th2细胞产生，分子量约10kd；其 基因位于第5号染色体上，与il-4基因紧密连接。il-13分子 的氨基酸顺序与il-4有20％～25％的同源性，在功能上也 与il-4有许多相似之处。

1.PCR扩增
PCR (Polymerase chain reaction) 聚合酶链式反应：在DNA聚合酶催化下，对 特定的DNA序列进行的复制反应 本质：生物体DNA复制原理在体外合成DNA 发明者：Mullis，生物技术革命的象征， 1993年获得诺贝尔奖

2.酶切反应
概念：在特异位点上催化dsDNA分子的断 裂敏感的蛋白质，高温会降解破坏
策略：生产期可采用先高温，后低温，变温表达，避 免蛋白质降解
例如： 大肠杆菌和酵母生长最低温度为10℃
大肠杆菌生长最适温度为37℃，最高温度为45℃ 酿酒酵母：生长最适温度为30℃，最高温度为40℃
白细胞介素2的应用列举
1.肿瘤 2.AIDS（艾 滋病） 3.抗病毒， 细菌感染 4，自身免疫 系统疾病
酶切体系组成：目标和质粒DNA，缓冲液， 限制性内切酶。 反应条件：适宜温度(37℃)，1小时以上。 终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。 电泳检查：酶切完全性。
3.连接反应
概念：

DNA 双链上相邻的3′-羟基和5′-磷酸基因 共价结合形成3′-5′-磷酸二酯键，使原来断 开的DNA缺口重新连接起来。

显微镜下的白细胞介素
白细胞介素的分类



IL-1：又称淋巴细胞刺激因子。 IL-2：又称T细胞生长因子，TCGF IL-3：又称为多能集落刺激因子（multi-csf）。 IL-4：由抗原或丝裂原刺激的cd4+t细胞产年， 活化的肥大细胞亦可产生il-4。 IL-5：由抗原活化的cd4+t细胞产生；肥大细胞 也能产生il-5。 IL-6：可由多种细胞合成，包括活化的t细胞和 b细胞、单核－巨噬细胞、内皮细胞、上皮细 胞以及成纤维细胞等。
参考文献：

基因工程制药- 白细胞介素-百科 各种白介素的作用-免疫学技术-生物帮 第二节-2-豆丁网
白细胞介素的分类




IL-7 ：il-7是由骨髓基质细胞分泌的糖蛋白，分子量为25kd； 其基因位于第8号染色体。 IL-8 ： il-8主要由单核－巨噬细胞产生；其他如成纤维细胞、 上皮细胞、内皮细胞、肝细胞等亦可在适宜的刺激条件下 产生il-8。 IL-9：细胞来源：il-9主要是由th细胞产生，在人和实验鼠 的体内都可以自我合成。 IL-10 1、细胞来源：il-10的分子量为35～40kd，通常为二 聚体；主要由th2细胞产生，也可由单核细胞、角质细胞 及活化的b细胞产生。

白细胞介素2生产工艺流程

发酵 工程菌为大肠杆菌。 种子用LB培养基； 发酵用M9CA培养基，30℃10小时，后 提高温度至42℃，诱导3小时。
分离纯化

包涵体制备： 离心收集，菌体悬于EDTA溶液中， 用超声波破碎细胞，后8000r/Min离 心，收集沉淀（包涵体和细胞碎片）
包涵体洗涤及裂解
5.筛选与鉴定

转化后的细胞类型
非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞
转化子：导入外源DNA的转化细胞
非重组子：仅含有空载体分子的转化子
重组子：含有重组DNA分子的转化子 目标重组子：含有连接正确的重组分子（目的） 非目标重组子：不含目的基因重组子
筛选方法
抗生素筛 选法： 抗生素的抗 性基因| 氨苄青霉素

用Tris-HCL洗涤3次，离心收集沉淀，用盐酸 胍变性，离心收集上清液。 凝胶过滤及复性： 上清过Sephacryl S-200柱，醋酸液洗脱，收 集洗脱峰。 干燥： 冷冻真空干燥。


工程菌构建流程
研究内容
目标切，连接
遗传转化与筛选
白细胞介素
白细胞介素：

白细胞介素即是由多种细胞产生并作用于多 种细胞的一类细胞因子。
目前至少发现了38个白细胞介素，分别命名为IL-1~IL38， 功能复杂，成网络，复杂重叠;在免疫细胞的成熟、活化、 增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它 们还参与机体的多种生理及病例反应。

白细胞介素的由来：
连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连 接酶。 连接反应：16℃-26℃，数小时，或过夜。 终止反应：在70℃加热10分钟。
4.转化

转化：把外源基因导入宿主细胞的过程；

某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞 的DNA，使其基因型和表型发生相应变化的现象
感受态细胞制备：

大肠杆菌转化法- CaCl2法
筛选方法
篮白斑筛选法： lacZ基因，重组子 白色，非重组子蓝色。 培养基中含X-gal X-gal: 5-溴-4-氯3-吲哚-β-D-半乳糖 苷 β -半乳糖苷酶可以 把培养基中无色的Xgal分解成半乳糖和 呈蓝色的5-溴-4-氯 -靛蓝，使菌落成蓝 色
鉴定方法
菌落PCR：含有目标基因
载体大小：电泳检测
酶切鉴定：目标基因插入及插入方向
测序确证：目标基因的序列准确无误
工程菌构建的质量控制

为了确保工程菌构建的有效性，必 须遵循GMP及其有关生物制品研 究技术指导原则，做好菌种的纪录 和管理。
温度对工程菌产物合成的影响
生长与生产温度不一致

较高温度表达量达，易形成包涵体 策略：较低温度下有利于表达可溶性蛋白质
白细胞介素的分类


IL-14; il-14由t细胞分泌，其成熟形式含468个氨基酸残基， 可刺激活化的b细胞增殖，抑制丝裂原诱导的b细胞分泌免 疫球蛋白。 IL-15 ：il-15是新发现的一种因子，可由活化的单核－巨 噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生。
白细胞介素2(IL-2)
细胞来源：主要由T细胞产生。又称T细胞生 长因子。 作用方式：以自分泌和旁分泌方式发挥效应。 主要生物学功能： （1）活化T细胞，促进细胞因子产生 （2）刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产 生细胞因子，诱导LAK细胞产生。 （3）促进B细胞增殖和分泌抗体。
将培养液转入离心管中，冰上放置10 分钟，然后于4℃下离心10 分 钟。 弃去上清，用预冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml 轻轻悬浮细胞， 冰上放置15-30 分钟后，4℃下，离心10 分钟。

加入连接反应产物：混匀，置冰上30分钟。 热击：42℃，90s； 置冰上，1－2分钟。 扩增培养：加入LB培养基，37℃，45分钟。 涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上。 筛选培养：37℃，出现菌落。
外源基因导入与培养
工程菌
新性状、功能、物质
工程菌构建的目标

获得质粒能稳定遗传、基因能高效和 定向表达的载体，确保药物的生物活 性。
大 肠 杆 菌 构 建 技 术
大肠杆菌


细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛、无芽孢、 一般无荚膜。裂殖。 菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。
大肠杆菌构建技术

白细胞介素（interleukin,IL）最初是指由白细 胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子，虽 然后来发现白细胞介素可由其他细胞产生,也可 作用于其他细胞，这一名称仍被沿用。 在1979年第二届国际淋巴因子专题讨论会上， 白细胞介素将来自单核-巨噬细胞、T淋巴细胞 所分泌的某些非特异性发挥免疫调节和在炎症 反应中起作用的因子称为白细胞介素 （interleukin，IL）。