基因操作技术07

在BMB171 中 复制
–
– + – – – + – – – + + + – – – ± +
pR-1600 (1.6kb)
pR-2260 (2.26kb) pR-2450 (2.45kb) pR-2570 (2.57kb) pR-2700 (2.7kb) pR-3300 (3.3kb) pR-3400 (3.4kb) pR-3740 (3.74kb) pD-81 pD-82 pD-87 (1.1kb) (3.2kb) (4.0kb)
dutdUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转
化为dUMP, 因此细胞内dUTP的含量大为增加， 其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸 苷嘧啶占据的位置
ung-
UDG酶缺陷, UDG酶[尿嘧啶(uracil) -N-糖基化酶 (glycosylase)]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基
pD-83
pD-84 pD-71 pD-78
(5.7kb)
(5.9kb) (1.3kb) (2.1kb)
pD-712 (2.4kb) pD-714 (4.7kb) pD-719 (5.4kb)
2.2kb
1200 1900
orf1
3400
1kb
1.5kb
0.7kb
突变类型
• 单个碱基的置换 (base substitution) • 简单的插入或缺失 (insertion or deletion) • 系统的缺失、插入或成串碱基的置换
第一节 寡核苷酸介导的诱变
oligonucleotide-mediated mutagenesis
70年代初 ×174 DNA(ss DNA 5386bp), 当 用带琥珀突变的 ss DNA与变性的野生型DNA片段
Biblioteka Baidu
一、Kunkel 法 或称“U”法
一、Kunkel 法 或称“U”法 1．背景知识
dutdUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转
化为dUMP, 因此细胞内dUTP的含量大为增加， 其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸 苷嘧啶占据的位置
一、Kunkel 法 或称“U”法 1．背景知识
Klenow re-ligation
质粒pBMB9741中DNA复制区的定位
ClaI EcoRI HindIII StyI StyI ScaI HindIII SalI FspI ClaI FspI KpnI EcoRI
6.6kb
1 660 950 1850 2100 2260 2230 2700 3400 3430 3800 6000 6600
• 主要活性为3’外切核酸酶活性，可从线
性DNA两条链的3’端去掉除单核苷酸，
• 还是一个内切核酸 (单链，nick, gap) 依赖 Ca++ EGTA可抑制活性
A A digestion vector
B
insert BAL 31
A
B digestion Deleted inserts cloned to plasmid vector
ATG
ATG
ATG
ATG
BamHI
ATG
ATG
EcoRI
PCR
PCR
BamHI
ATG
ATG
EcoRI
PCR
重叠延伸
BamHI ATG EcoRI
第二节 嵌套缺失
第二节 嵌套缺失
1. 外切核酸酶III的消化
Exonuclease III
5‘ 3‘ 5‘ 3‘
5‘ 3‘
2. BAL 31的消化
四 、 PCR定点诱变
1．同源重组法
2．DpnI法
3.重叠延伸 Overlap extension
对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂 合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链
第七章 DNA定点诱变
site-directed mutagenesis of cloned DNA
突变方式
• •
定点诱变
随机诱变(molecular evolution)
易错PCR(erro-prone PCR)


DNA重排(DNA shuffing)
体外随机引发重组(random-priming in vitro recombination) 交错延伸(stagger extension process，StEP)
(2) ligase
3U/13l 可有可无，有则效率高
(3) T4 gene 32 protein 提高含二级结构的ssDNA的突变率
4. primers
要求5’端磷酸化
引物的终极条件： 与靶DNA正确配对 特异性地与靶DNA序列退火
A. 单核苷酸置换插入 or 缺失
• •
5’端完全配对，使得上游(引物)起始的DNA合成 不容易将诱变寡核苷酸取代，约需8-10bp 3’端所形成的杂交体足以引导DNA合成。如果 错配核苷酸太靠近3’端，3’端将不能形成稳定的 杂交体，易被外切活性降解。所以3’端需有79bp完全配对;
转化子诱变法
Synthesize second strand Isolate DNA
Digest DNA (primary digestion)
Transform E.coli
Transform E.coli mutS to propagate plasmids Isolate and digest (Second digestion)
3. DNase I 的消化
内切酶，可优先嘧啶核苷酸水解 ds or ss DNA
Mg2+: 独立作用于每条DNA链，位点随机
Mn2+: 大致在同一位置切割dsDNA
产生平端 或1-2个核苷酸突出
ccc DNA DNase I, Mn++ (low concentration)
A digestion
U U
Isolate phagemid ss DNA
U
与突变寡核苷酸退火
U
U
U
3. 酶
(1) DNA polymerase
T4 65%
T7 11/13 (84.6%)
Klenow 36% 突变率
3. 酶
(1) DNA polymerase
T4 65%
T7 11/13 (84.6%)
Klenow (可能会替换引物) 36% 突变率
五、SOE 重叠延伸剪接术 Splicing by overlap extension
可用于将两个 DNA片段在所期望的位点进行连接
• 设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和 “重叠”部分，引发部分在3‘末端，起引物作用；重叠部 分在5’末端，与待融合的DNA片段序列互补。 • 设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补
3. 酶
(1) DNA polymerase
T4 65%
T7 11/13 (84.6%)
Klenow (可能会替换引物) 36% 突变率
(2) ligase
3U/13l 可有可无，有则效率高
3. 酶
(1) DNA polymerase
T4 65%
T7 11/13 (84.6%)
Klenow (可能会替换引物) 36% 突变率
•
为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长 度最短的诱变寡核苷酸。一般17-19bp, 错配在 中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体
之间的热稳定性差异足够大。
B. 多处缺失或变换2个bp以上的oligo
两侧需12-15bp 侧翼双链区的Tm应约为35-40℃
Tm=4(G+C)+2(A+T)
=36℃ ( 3 each)
突变区域大, 效率越低(两侧形成稳定杂交体
的能力是突变区长度的函数→ 越低）
5. 模板/结果
靶DNA尽可能短，应测序确定其突变
二、Altered Sites ® II in vitro mutagenesis system
位点选择定点诱变法
三、Transformer SiteDirected mutagenesis
一起转染细菌时, 观察到“标记获救”现象,即产生
带野生型基因组的噬菌体
+
野生型DNA片段 突变体×174 DNA
退火
异源双链体
宿主编码 的错配修 复系统
可利用突变的DNA片段 将突变引入到野生型DNA中
全长的野生型基因组
M. Smith
1993年诺贝尔化学奖
加拿大生物化学家
1932年出生于英国，毕业于英国曼彻斯特大学， 1956年移居加拿大。现任加拿大温哥哥华大不列颠哥伦 比亚大学生物技术实验室主任。 1978年发明了寡聚核苷酸定点诱变技术。 利用寡聚核苷酸定点诱变技术，可以人为地通过基 因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研 究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质分子之间的 相互作用。
单链噬菌体载体
phagemid载体
2．原理
Insert target DNA
只有突变链能复制
转化 E.coli CJ236
U U U U U U U U
转化E.coli MV1190 (dut+/ung+)
U U
M13K07感染
U U U U
T4 DNA polymerase DNA ligase
E.coli (dut- / ung- )
合成的 DNA含有尿嘧啶，M13噬菌体 DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基
E.coli CJ236 dut, ung, thi, relA; pCJ105(Cmr) pCJ105 is a F’ plasmid
ss DNA 制备载体
ss DNA 制备载体