基因操作技术07
优选第七章基因操作的基本技术
7.3.1 PCR反应的原理和步骤
• 原理：模拟细胞内发生的DNA复制过程，在体 外由DNA聚合酶催化合成特异性DNA片段。
• 步骤： 变性：90～95°C，dsDNA变性为两条ssDNA； 退火：37～60 °C，引物与ssDNA退火； 延伸：70～75 °C，引物在Taq酶作用下延伸。
7.3.2 PCR反应体系的成份
2）热变性法: 原理与碱裂解法类似，其变性手段为加 热变性。但该法缺点为多糖污染较多。
3）两法在变性与复性步骤均需操作温和，以免染色体 DNA断裂成为与质粒DNA分子大小差不多的片段分 子，从而导致染色体DNA污染。
CTAB法
• 基本原理:
表 面 活 性 剂 （ hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB ）可使膜蛋白、核蛋白变性，DNA 释放到溶液中。在高盐（1M NaCl）条件下， DNA 与 CTAB结 合 溶 于 水 中 ， 当 溶 液 中 盐 浓 度降 低时 （0.5M NaCl），DNA与CTAB复合物会沉淀下来。
7.2.1 凝胶电泳技术的原理
• DNA在中性或偏碱性的条件下带负电，在电 泳过程中处于负极的DNA通过凝胶分子筛向 正极移动。迁移速度受电场强度、所带电荷 数量及分子大小、构型等因素的影响，与 DNA分子中的碱基组成和顺序无关。
• 电 泳 结 束 后 ， 用 溴 化 乙 锭 （ ethidium bromide，EB）染色，可观察到DNA在凝胶 中所处位置。
• 分辨率高达1bp，用于DNA序列测定 • 载样量大 • 回收纯度高
mped homogenous electric field, CHEF/pulsed field electrophoresis)
基因操作方法知识
基因操作方法知识
基因操作方法是指通过改变生物体的基因组来改变其性状或特征的方法。
这些方法可以用来研究基因的功能、生物体的生理机制，或者用来改良作物、畜禽、微生物等生物体。
常见的基因操作方法包括基因克隆、基因敲除、基因编辑、基因组测序等。
基因操作方法包括以下几种：
1. 基因克隆：通过将感兴趣的基因从一个生物体中克隆出来，然后将其转移到另一个生物体中，来研究该基因的功能。
2. 基因敲除：通过使用CRISPR/Cas9等基因编辑技术来敲除或静默特定基因，从而研究该基因在生物体中的功能。
3. 基因编辑：利用CRISPR/Cas9、TALEN等基因编辑技术，直接对生物体的基因组进行编辑，实现精准的基因修饰。
4. 基因组测序：通过测序一个生物体的全部基因组来了解其基因组结构和功能，从而深入研究生物体的遗传特性和进化过程。
5. 转基因技术：将外源基因导入到目标生物体中，使其表达新的特性或功能，常用于改良作物、畜禽等经济作物的品质和产量。
基因操作方法在生物学研究、医学治疗、农业生产等领域具有重要的应用价值，同时也引发了一系列的伦理和安全问题，因此在进行基因操作时需遵守相关的法律法规和伦理标准。
基因操作和基因转移技术
基因操作和基因转移技术基因操作和基因转移技术是现代生物科学领域的重要研究方向。
通过这些技术，科学家们可以对生物体的基因进行精确的编辑和调控，以实现对遗传特征的掌控和改变。
本文将介绍基因操作和基因转移技术的原理、应用和潜在风险。
一、基因操作技术基因操作技术是指通过对生物体的基因进行精确的修改和改造，来改变其遗传特征的方法。
其中最常用的技术是CRISPR-Cas9系统。
该技术利用CRISPR序列及Cas9酶的特异性识别与切割功能，实现对基因组的精确编辑。
基因操作技术可以带来广泛的应用。
例如，它可以用于农业领域，使作物具有抗虫、耐旱、耐盐等优良特性，提高农作物产量和质量。
此外，基因操作技术还可以用于治疗遗传性疾病，包括癌症、遗传性肌萎缩性侧索硬化症等。
通过将健康基因导入患者体内，可以修复遗传缺陷，达到治疗目的。
然而，基因操作技术也存在一些潜在的风险和伦理问题。
首先，技术操作不当可能导致出现意外的突变，引发未知的安全性问题。
其次，基因操作可能涉及到人类胚胎和生殖细胞的基因编辑，引发伦理争议和道德困境。
因此，在推广基因操作技术的过程中，需要制定严格的伦理道德规范和安全监管制度，确保技术的安全性和道德性。
二、基因转移技术基因转移技术是指将一个生物体的基因转移到另一个生物体中，以实现目标基因的表达。
这种技术被广泛应用于基础研究、农业改良和生物制药等领域。
常见的基因转移技术包括基因注射、基因枪和细菌介导的基因转移等。
基因转移技术的应用非常广泛。
在研究领域，科学家们可以将目标基因导入模式生物中，以研究其功能和调控机制。
在农业领域，基因转移技术可以用于培育转基因作物，使其具有抗虫、耐逆等优良特性，提高农作物产量和品质。
此外，基因转移技术还用于生物制药领域，例如将人类基因导入细菌中，通过其产生的蛋白质来生产药物。
与基因操作技术一样，基因转移技术也存在一些潜在的风险。
首先，基因转移可能导致转基因生物与野生生物发生杂交，引起生态系统的破坏。
基因操作的原理和过程
基因操作的原理和过程基因操作（Genetic engineering）是一种利用基因技术对生物体的遗传物质进行修改和重组的技术手段。
通过基因操作，可以对生物的基因进行剪接、修饰或移除，并向生物中引入新的基因或基因片段，从而改变生物的遗传特征和表现形式。
基因操作在农业、医学、生物工程等领域都有广泛的应用，它不仅可以提高生物的抗病性、耐性和产量，还可以用于研究基因的功能和调控机制。
基因操作的原理是基于对生物体的基因组进行修改和优化，具体分为以下几个步骤：1. 选择目标基因：首先需要确定要操作的基因，可以是现有生物体中的某个基因，也可以是外源基因。
有时也会选择修改某个特定区域的基因片段。
2. 基因克隆和构建载体：利用分子生物学技术，将目标基因从生物体中分离提取。
然后，将目标基因插入到载体DNA中，构建成重组载体。
常用的载体包括质粒和病毒。
3. 转化目标细胞：将构建好的重组载体导入到目标细胞中。
可以通过多种途径实现细胞的转化，如化学转化、电转化、冷冻复苏等。
4. 基因表达和筛选：在转化成功后，目标基因会在细胞内进行表达，从而改变生物的遗传特征和表现形式。
为了筛选出表达目标基因的细胞，可以在重组载体中引入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
5. 验证和分析：在筛选出表达目标基因的细胞后，需要对其进行验证和分析。
可以通过PCR、酶切、同源重组等技术手段来验证基因操作的结果，并进一步分析基因的功能。
基因操作的过程中有一些关键技术和工具，如PCR技术、限制性内切酶、连接酶、DNA测序等。
这些技术和工具的应用使得基因操作的过程更加高效、准确。
基因操作的应用领域广泛，涉及农业、医学、生物工程等多个领域。
在农业领域，基因操作可以用于改良农作物的品质和产量，提高抗病虫害的能力，延长保存期限等。
比如，通过引入抗病虫害基因，使植物对害虫和病毒的侵害产生免疫反应。
在医学领域，基因操作可以用于治疗遗传性疾病、癌症等疾病。
比如，通过修正患者的遗传突变，可以恢复正常的基因功能。
分子生物学常用技术-基因操作
Triton-溶菌酶法
质粒DNA提取方法的选择
• 常用的碱裂解法,煮沸法，SDS法均可 获得较满意效果．至于有人采用碱裂解 法提取小量细菌培养物的质粒， 用煮沸 法或SDS法进行质粒DNA的大量分离， 只 是各个实验室的习惯问题.
质粒提取的主要方法
• 碱裂解法：
原理：基于染色体DNA与质粒DNA的 变性与复性的差异而达到分离目 的.细菌在强碱性环境中裂解， 蛋白质变性，染色体DNA被蛋白 质包裹缠绕，质粒DNA被释放出 来。
1 保证核酸一级结构的完整性； （pH 4～10；0 ～4℃;机械剪力；核酸酶等）
2 尽量排除其他分子的污染,保证提取核酸的纯度;
1)其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应 降低到最低程度； 2)核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的
有机溶剂和过高浓度的金属离子； 3)其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
质
粒
标记基因
结
构
图
抗性基因
多克隆位点 启始复制子
质粒DNA的提取和纯化
• 质粒的分离与提取则是最常用、最基本的 实验技术． 1、细菌的培养
• 主要步骤： 2、细菌的收集与裂解 3、分离纯化
质粒提取的主要方法
质粒DNA的小量制备
2-5ml
质粒DNA的大量制备
500ml
碱裂解法
方法
煮沸法
SDS裂解法
浓度：
DNA双链:
1 OD ~
DNA单链或RNA: 1 OD ~
寡核苷算单链: 1 OD ~
纯度：
A260/280之比应在1.80
50 µg 40 µg 33 µg
只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
基因操作原理和方法
克隆和重组技术的应用
克隆和重组技术广泛应 用于基因工程、生物制 药、农业和医学等领域 。
在基因工程中，克隆和 重组技术用于生产重组 蛋白、疫苗和抗体等生 物制品。
在农业中，克隆和重组 技术用于改良作物品种 和提高农作物的抗逆性 和产量。
生物科学研究
基因敲除和敲入技术可用于研究基因功能、细胞信 号转导、药物筛选等生物科学研究领域，有助于深 入了解生命活动的本质。
生物制药
基因敲除和敲入技术可用于生产基因工程药物，通 过改造或增强微生物、细胞或动物细胞中的基因表 达，生产具有特定功能的药物。
敲除和敲入技术的限制和挑战
80%
技术难度高
基因敲除和敲入技术需要精确的 操作和设计，对技术和实验条件 要求较高，且存在一定的失败率 和不确定性。
05
基因编辑新技术
CRISPR-Cas9系统
总结词
CRISPR-Cas9系统是一种高效、简单、低成本的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9 蛋白的引导，实现对特定DNA序列的切割和修复。
详细描述
CRISPR-Cas9系统利用向导RNA与目标DNA序列的特异性结合，将Cas9蛋白引导至目 标位置，通过切割DNA双链形成缺口，启动细胞内的DNA修复机制。在修复过程中， 插入、删除或替换特定DNA序列成为可能，从而实现基因敲除、敲入和点突变等基因
基因操作的历史与发展
基因操作技术的起源可以追溯到20 世纪70年代，当时科学家开始探索 限制性内切酶和DNA连接酶等工具 的应用。
随着技术的不断发展，基因操作逐渐 成为现代生物学和医学研究的重要手 段，广泛应用于基因克隆、基因治疗 、基因工程等领域。
基因操作原理知识点总结
基因操作原理知识点总结基因操作是一种在生物体内对基因进行修改或操作的技术，它的出现为生物学、医学和农业等领域带来了革命性的变革。
通过基因操作技术，科学家们可以改变生物体的一些性状，使得其具有更好的抗病性、生长速度、产量等特性，从而为人类生活和生产带来了巨大的便利和利益。
在这篇文章中，我将从基因操作的原理、技术、应用和风险等方面进行详细的介绍和讨论。
基因操作的原则基因操作的基本原理是对生物体的基因进行修改或操作，使得其具有某些特定的性状。
这是通过DNA重组技术来实现的，DNA重组技术是一种利用酶的作用或化学方法，将DNA片段进行切割、粘接、合成等操作，从而实现对基因的改变或移植。
利用这一技术，科学家们可以将某种物种的基因转移到另一种物种中，或者通过改变某个基因的表达方式来使得生物体产生一些新的性状。
基因操作的技术基因操作技术主要包括DNA重组技术、基因克隆技术、基因敲除技术、基因编辑技术等。
其中，DNA重组技术是最基本的技术，它通过切割、粘接、重组DNA片段来改变基因的结构和表达方式；基因克隆技术是一种通过细胞培养和分裂来复制基因的方法，可以用于大规模生产具有某些特定性状的生物体；基因敲除技术是一种通过干扰某个基因的表达来观察该基因在生物体中的功能和作用；基因编辑技术是一种通过精确的操纵基因序列来实现对基因的改变和操作。
基因操作的应用基因操作技术在农业、医学、生物工程等领域都有着广泛的应用。
在农业领域，基因操作技术可以用来改良作物的产量、抗病性、品质等性状，从而为农业生产提供更多的选择和可能；在医学领域，基因操作技术可以用来治疗或预防一些遗传疾病，为人类健康带来更多的希望和机会；在生物工程领域，基因操作技术可以用来生产某些特定的物质或药物，从而为生产和生活提供更多的可能性。
基因操作的风险尽管基因操作技术为人类带来了巨大的利益和希望，但是它可能也会带来一些潜在的风险和问题。
其中，最主要的风险包括对环境的影响和对人类健康的影响。
基因操作技术
乙肝疫苗(CHO, 酵母) 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗
功能 抗凝 促进凝血 剌激白细胞生成 剌激白细胞生成 刺激细胞生长与分化 治疗侏儒症 治疗糖尿病 抗病毒感染及某些肿瘤 激活、剌激各类白细胞 抗组织损伤 利用其结合特异性进行诊断试验、肿 瘤导向治疗 预防乙肝 预防霍乱
基因工程的基本流程
通常 1u指在适当条件下，1小时内完 全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的 酶量。
酶切的温度和时间
• 大多数限制酶反应温度为３７℃， 如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等， 也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应。
• 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定。一般２小 时即可充分酶解。
上游工程
下游工程
克隆 Cloning
• 克隆 指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子
代群体.
细胞克隆 组织克隆 个体克隆 分子克隆 DNA克隆 基因克隆
• 基因克隆 又叫分子克隆。即将特定的DNA片段通过载
体导入宿主细胞，在受体细胞中复制、扩增，以获得单一 DNA分子的大量拷贝。 • 在基因工程中，克隆指含有单一DNA重组体的无性系， 或指将DNA重组体引入受体细胞中建立无性的过程。
反转录酶 （reverse transcriptase）
3′
AAAAAA
Oligo-dT
AAAAAA TTTTTT
cDNA
反转录酶催化的cDNA合成
3 T4 DNA连接酶 T4 DNA ligase
主要作用
• 连接双链DNA • 形成3’，5’-磷酸二酯键
BamH I
4 碱性磷酸酶 alkaline phosphatase
基因工程的目的
• 制取多肽产品
基因工程技术的实用操作技巧分享与总结
基因工程技术的实用操作技巧分享与总结引言：基因工程技术是一种将外源基因导入宿主细胞并使其表达的重要方法，被广泛应用于农业、医学和工业等领域。
掌握基因工程技术的实用操作技巧对于研究人员和实验室来说至关重要。
本文将分享一些基因工程技术的实用操作技巧，帮助读者更好地开展基因工程实验。
一、DNA提取与纯化DNA提取是进行基因工程实验的必要步骤，它包括细胞破碎、DNA的溶解与纯化。
实验室常用DNA提取方法有酚/氯仿法、硅胶柱法和商业化试剂盒法等。
其中，商业化试剂盒法是目前应用最广泛、操作最简单的DNA提取方法，也是初学者首选。
二、DNA限制性内切酶的选择与使用DNA限制性内切酶是常用于基因工程的工具酶，能够识别并切割DNA的特定碱基序列。
在选择和使用DNA限制性内切酶时需注意以下几点：1. 根据酶切位点选择适当的内切酶。
内切酶的酶切位点和识别序列需与目标DNA相匹配。
2. 注意内切酶的最佳反应条件，确保酶的活性和酶切效率。
3. 合理设计双酶切位点，避免酶切产物重组。
三、DNA连接酶与重组技术DNA连接酶主要用于将DNA片段连接起来，常见的DNA连接酶有T4 DNA 连接酶和拼接DNA酶。
在进行DNA连接实验时需注意以下几点：1. 挑选适当的连接酶。
不同连接酶对DNA片段的连接效率和适用的连接方式有所差异。
2. 优化连接反应条件，包括连接酶的浓度、连接时间和温度等。
3. 控制连接酶的用量，过多或过少都会影响连接效率。
四、PCR技术的优化PCR技术是基因工程实验中常用的技术手段，可以在体外扩增目标DNA片段。
为了获得高效的PCR扩增结果，以下几点值得注意：1. 选择适当的引物。
引物的设计需准确匹配目标DNA序列，避免引物间的二聚体和三聚体的形成。
2. 优化PCR反应条件，包括反应体系中的引物浓度、模板DNA浓度、Mg2+浓度和PCR循环数等。
3. 合理设置PCR扩增程序，包括变性、退火和扩增步骤的温度和时间。
6、7、8、9 基因操作的主要技术
2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提
一般过程及原理： （1）组织粉碎
动物组织剪成小块，置液氮中冻结 后研磨成细粉末。
组织培养的细胞用胰酶消化松散后 直接使用。
选用
（2）细胞裂解
0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。 SDS是离子型去垢剂（detergent），可 以使细胞膜崩解。
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小 范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存 在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复 制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染 色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地 整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制， 并通过细胞分裂传递到后代。
大肠杆菌基因组DNA
5.目的基因表达 使导入寄主细胞的目的基因表达出我们 所需要的基因产物。
核酸(供体)的操作
核酸的提取与纯化 核酸的凝胶电泳 核酸分子杂交 PCR技术 DNA核苷酸序列分析 酵母双杂交 转基因技术
第一节 核酸的提取与纯化
就基因工程而言，核酸分子是 其研究所涉及的主要对象，所以 核酸的分离与提取是研究中很重 要的基本技术。核酸样品的质量 将直接关系到实验的成败。
（3）纯化DNA 用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。
（4）沉淀DNA 用2倍体积的无水乙醇。
（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）
（5）除去RNA污染 用RNase。
3. 从植物组织中制备 DNA
一般过程及原理： （1）组织粉碎
用液氮冷冻后研磨成细粉末。 （2）细胞裂解
1)用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴 化铵/2巯基乙醇）。CTAB是阳离子去污剂，
基因操作技术
悬浮培养 →裂解液 →中和 →离心 →收集上清液
❖ 酚萃取除去蛋白质; ❖ 乙醇沉淀, 收集质粒DNA; ❖ DNA纯化:
CsCl2 梯度离心 (大量制备用) 缓冲液溶解, 酚/仿萃取,乙醇沉淀
质粒 DNA 制备工艺
vectors
↓
基因组DNA克隆• cDNA:提取总mRNA → 反转录为cDNA → 重组体DNA
↓
转化
↓cDNA克隆❖ 基因筛选是用分子探针或特殊蛋白质从基因文 库中寻找特定DNA克隆的过程. DNA探针 每一克隆DNA 分子杂交(Southern or Western blot)
检测与定性
DNA 样品
靶DNA克隆
基因操作包括一系列的技术和程序: DNA分离提取、DNA克隆、DNA重组和DNA转化.
Type III 有特定识别位点但在之外几个碱基处
离心
熔胶和去EB • 酚/仿寻找特定DNA克隆的过程. 2 DNA扩增(PCR)
质粒是存在于细菌染色体外的小DNA分子, 是最早用 于基因操作的载体分子, 主要用于携带外源基因进入 细菌细胞中复制和表达.
通常将携带外源基因的载体称为重组载体 (重组DNA)
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1 质粒
• 质粒是染色体外的环状 DNA 分子. 绝大多数 质粒发现于细菌细胞中, 但对细菌的代谢和 生命周期是非必需的.
❖ 较大的DNA分子须在较低浓度的凝胶上进行 电泳,较小的DNA分子可用较高浓度的凝胶.
❖ 当DNA与蛋白质结合时,其电泳迁移明显地 减缓（凝胶阻滞）.
酶切片段的电泳分离
Electrophoretogram
基因操作技术
基因操作原理及相关技术基因操作(gene manipulation)又称基因工程(gene engineering)遗传工程gene cloning molecular cloning 基因操作的核心部份为重组DNA技术。
Recombination DNA technologyDNA Recombination•1 概念：对目的基因进行体外重组，再将重组分子导入受体细胞，使那个基因在受体细胞中复制、转录、翻译表达的进程。
•克隆（clone）：n,无性繁衍系及其后代。
基因完全相同; v,指从同一先人产生这种同一的DNA分子群或细胞群的进程。
（Gene, cell,个体）理论上三大发觉：转化实验：证明了遗传物质的本质是DNA（1944年）和Crick：提出DNA双螺旋结构模型（1953年）Nirenberg等：确信了遗传信息的传递方向（1961-1966年）DNA RNA 蛋白质技术上三大发明：工具酶：分子手术刀，切割与缝合基因，包括限制性内切核酸酶、连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等，对DNA 或RNA进行各类各样的修饰。
载体(vector, vehicle)：本意是媒介体，在基因工程上指能将目的基因导入宿主细胞的DNA分子。
逆转录酶（reverse transcription,RT)：打破了中心法那么，使真核基因制备成为可能，RT-PCR。
RNA DNAgene manipulation 过程1、目的基因的获取（PCR,gene library)；2、载体(vector)的选择与构建(工具酶等）；3、目的基因与载体连接，构建重组DNA分子；4、重组DNA导入受体细胞，转化子挑选；5、受体细胞中目的基因的功能表达。
基因工程的大体进程重组DNA技术的意义•打破了自然种的界限•真核/原核生物间基因的交流•对生物进行定向改造•基因医治（基因矫正/添加，RNAi）•基因工程药物（生长激素，细胞生长因子，重组疫苗等）DNA重组技术引发分子生物学第二次革命，使生命科学进入大科学工程的时期，并带动了生物技术产业的迅猛进展。
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一起转染细菌时, 观察到“标记获救”现象,即产生
带野生型基因组的噬菌体
+
野生型DNA片段 突变体×174 DNA
退火
异源双链体
宿主编码 的错配修 复系统
可利用突变的DNA片段 将突变引入到野生型DNA中
全长的野生型基因组
Байду номын сангаас
M. Smith
1993年诺贝尔化学奖
加拿大生物化学家
1932年出生于英国，毕业于英国曼彻斯特大学， 1956年移居加拿大。现任加拿大温哥哥华大不列颠哥伦 比亚大学生物技术实验室主任。 1978年发明了寡聚核苷酸定点诱变技术。 利用寡聚核苷酸定点诱变技术，可以人为地通过基 因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研 究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质分子之间的 相互作用。
在BMB171 中 复制
–
– + – – – + – – – + + + – – – ± +
pR-1600 (1.6kb)
pR-2260 (2.26kb) pR-2450 (2.45kb) pR-2570 (2.57kb) pR-2700 (2.7kb) pR-3300 (3.3kb) pR-3400 (3.4kb) pR-3740 (3.74kb) pD-81 pD-82 pD-87 (1.1kb) (3.2kb) (4.0kb)
转化子诱变法
Synthesize second strand Isolate DNA
Digest DNA (primary digestion)
Transform E.coli
Transform E.coli mutS to propagate plasmids Isolate and digest (Second digestion)
•
为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长 度最短的诱变寡核苷酸。一般17-19bp, 错配在 中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体
之间的热稳定性差异足够大。
B. 多处缺失或变换2个bp以上的oligo
两侧需12-15bp 侧翼双链区的Tm应约为35-40℃
Tm=4(G+C)+2(A+T)
=36℃ ( 3 each)
• 主要活性为3’外切核酸酶活性，可从线
性DNA两条链的3’端去掉除单核苷酸，
• 还是一个内切核酸 (单链，nick, gap) 依赖 Ca++ EGTA可抑制活性
A A digestion vector
B
insert BAL 31
A
B digestion Deleted inserts cloned to plasmid vector
U U
Isolate phagemid ss DNA
U
与突变寡核苷酸退火
U
U
U
3. 酶
(1) DNA polymerase
T4 65%
T7 11/13 (84.6%)
Klenow 36% 突变率
3. 酶
(1) DNA polymerase
T4 65%
T7 11/13 (84.6%)
Klenow (可能会替换引物) 36% 突变率
Klenow re-ligation
质粒pBMB9741中DNA复制区的定位
ClaI EcoRI HindIII StyI StyI ScaI HindIII SalI FspI ClaI FspI KpnI EcoRI
6.6kb
1 660 950 1850 2100 2260 2230 2700 3400 3430 3800 6000 6600
单链噬菌体载体
phagemid载体
2．原理
Insert target DNA
只有突变链能复制
转化 E.coli CJ236
U U U U U U U U
转化E.coli MV1190 (dut+/ung+)
U U
M13K07感染
U U U U
T4 DNA polymerase DNA ligase
四 、 PCR定点诱变
1．同源重组法
2．DpnI法
3.重叠延伸 Overlap extension
对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂 合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链
3. 酶
(1) DNA polymerase
T4 65%
T7 11/13 (84.6%)
Klenow (可能会替换引物) 36% 突变率
(2) ligase
3U/13l 可有可无，有则效率高
3. 酶
(1) DNA polymerase
T4 65%
T7 11/13 (84.6%)
Klenow (可能会替换引物) 36% 突变率
3. DNase I 的消化
内切酶，可优先嘧啶核苷酸水解 ds or ss DNA
Mg2+: 独立作用于每条DNA链，位点随机
Mn2+: 大致在同一位置切割dsDNA
产生平端 或1-2个核苷酸突出
ccc DNA DNase I, Mn++ (low concentration)
A digestion
五、SOE 重叠延伸剪接术 Splicing by overlap extension
可用于将两个 DNA片段在所期望的位点进行连接
• 设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和 “重叠”部分，引发部分在3‘末端，起引物作用；重叠部 分在5’末端，与待融合的DNA片段序列互补。 • 设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补
pD-83
pD-84 pD-71 pD-78
(5.7kb)
(5.9kb) (1.3kb) (2.1kb)
pD-712 (2.4kb) pD-714 (4.7kb) pD-719 (5.4kb)
2.2kb
1200 1900
orf1
3400
1kb
1.5kb
0.7kb
dutdUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转
化为dUMP, 因此细胞内dUTP的含量大为增加， 其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸 苷嘧啶占据的位置
ung-
UDG酶缺陷, UDG酶[尿嘧啶(uracil) -N-糖基化酶 (glycosylase)]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基
第七章 DNA定点诱变
site-directed mutagenesis of cloned DNA
突变方式
• •
定点诱变
随机诱变(molecular evolution)
易错PCR(erro-prone PCR)
DNA重排(DNA shuffing)
体外随机引发重组(random-priming in vitro recombination) 交错延伸(stagger extension process，StEP)
突变类型
• 单个碱基的置换 (base substitution) • 简单的插入或缺失 (insertion or deletion) • 系统的缺失、插入或成串碱基的置换
第一节 寡核苷酸介导的诱变
oligonucleotide-mediated mutagenesis
70年代初 ×174 DNA(ss DNA 5386bp), 当 用带琥珀突变的 ss DNA与变性的野生型DNA片段
一、Kunkel 法 或称“U”法
一、Kunkel 法 或称“U”法 1．背景知识
dutdUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转
化为dUMP, 因此细胞内dUTP的含量大为增加， 其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸 苷嘧啶占据的位置
一、Kunkel 法 或称“U”法 1．背景知识
(2) ligase
3U/13l 可有可无，有则效率高
(3) T4 gene 32 protein 提高含二级结构的ssDNA的突变率
4. primers
要求5’端磷酸化
引物的终极条件： 与靶DNA正确配对 特异性地与靶DNA序列退火
A. 单核苷酸置换插入 or 缺失
• •
5’端完全配对，使得上游(引物)起始的DNA合成 不容易将诱变寡核苷酸取代，约需8-10bp 3’端所形成的杂交体足以引导DNA合成。如果 错配核苷酸太靠近3’端，3’端将不能形成稳定的 杂交体，易被外切活性降解。所以3’端需有79bp完全配对;
突变区域大, 效率越低(两侧形成稳定杂交体
的能力是突变区长度的函数→ 越低）
5. 模板/结果
靶DNA尽可能短，应测序确定其突变
二、Altered Sites ® II in vitro mutagenesis system
位点选择定点诱变法
三、Transformer SiteDirected mutagenesis
ATG
ATG
ATG
ATG
BamHI
ATG
ATG
EcoRI
PCR
PCR
BamHI
ATG
ATG
EcoRI
PCR
重叠延伸
BamHI ATG EcoRI
第二节 嵌套缺失
第二节 嵌套缺失
1. 外切核酸酶III的消化
Exonuclease III
5‘ 3‘ 5‘ 3‘
5‘ 3‘
2. BAL 31的消化
E.coli (dut- / ung- )
合成的 DNA含有尿嘧啶，M13噬菌体 DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基