Western 转膜步骤 操作方法
Western blot操作步骤及技巧
Western blot操作步骤及技巧实验器材：电泳及转膜设备、PVDF膜（0.2μM）实验试剂：SDS凝胶配制试剂盒（碧云天）、SDS电泳缓冲液、转膜液（分干转及湿转）、蛋白Loading buffer、预染蛋白Marker、甲醇、PBST/TBST、脱脂奶粉、一抗抗体、二抗抗体、碱性磷酸酶显影液或ECL化学发光显影液、BSA、PMSF、细胞蛋白裂解液实验步骤：一、配胶（具体浓度选择根据所需检测蛋白分子量大小而定，常用10%）1.将玻璃板洗净、用ddH2O冲洗、晾干；2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（AP及TEMED使用前加入），避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡；3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，可以使用ddH2O或者异丙醇封胶，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用ddH2O冲洗干净;4.灌好浓缩胶插入梳子，待胶凝固拔除梳子。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶。
若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。
30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
二、样品处理1.悬浮细胞：a) 1.5 ml EP管或离心管收集细胞，2000rpm、3min去培养液后用温的PBS洗1遍；b)离心尽量去除PBS，加入适量细胞裂解液（裂解液使用前按100-200：1加入PMSF），冰上裂解30min,期间不间断振荡EP管，使细胞裂解充分；c)4℃，12000rpm离心10min，取上清定量；2.贴壁细胞：a)去培养液后用温的PBS冲洗1遍，尽量去除残留PBS；b)加入适量的冰预冷的裂解液（6孔板细胞密度在80%左右，每孔加100-200μl裂解液,浓度在2-4μg/μl左右）后置于冰上30min，期间不断震荡培养板，使裂解充分；c)收集细胞裂解液在EP管后4℃，12000rpm离心10min，取上清定量；3.组织：a)匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
操作篇：westernblot之转膜
操作篇：westernblot之转膜转膜篇1. 转一张膜需准备 6 张 7.0～8.3 cm 的滤纸和 1 张 7.3～8.6 cm 的硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸 2 h 才可使用。
要领：（1）用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水；（2）个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok 了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
要领：（1）「用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡」，要领：一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
（2）「在上面垫一张海绵垫」要领：可三张纸先叠在一起在垫于垫子上。
个人感觉就垫 1 张滤纸也没问题。
4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。
除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。
在膜上盖3 张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
要领：（1）「要在两个边上轻轻的反复撬」要领：应该边撬边用流水缓缓冲洗（2）「直到撬去玻板」要领：撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲（3）转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
（4）最后做成的「三明治」千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教。
western转膜
Western 转膜方法及转膜仪使用说明实验前准备：转移缓冲液: 甘氨酸（MW75.07）2.9gTris（MW121.14）5.8gSDS 0.37g甲醇200ml蒸馏水至1000ml先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。
如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）。
缓冲液可室温保存，但最好保存在4度冰箱，可重复使用3～5次（最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
TBS缓冲液: 1 mol/L Tris·HCl（pH7.5）10mlNaCl 8.8g蒸馏水至1000ml（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）TBST缓冲液: 20％Tween20 1.65mlTBS 700ml混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液：BSA 0.5gTBST 100ml最好现用现配。
操作步骤：（一）SDS－PAGE电泳样品准备：取出上样样品至1.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）（二）电泳浓缩胶时用80V跑1h左右，到分离胶以后用120跑，总时间3h左右）。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（如果目的条带比较大的话，最好使用可视的蛋白marker）。
（三）转膜（1）转一张膜需准备滤纸和1张PVDF膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的PVDF膜置于水上浸10min才可使用。
（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。
献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）
献给初学者：westernblot操作步骤详解（下）上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS－PAGE 电泳，如果你还没看过，点此详见：《献给初学者：western blot 操作步骤详解（上）》。
下面就跟大家讲讲接下来的步骤。
四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。
对于转印90 kd 以下的蛋白，转膜液都不用加SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037% 的 SDS。
1.在电泳结束前20 min 开始准备转膜所需的东西。
转一张膜需准备 6 张的滤纸（长一般为 8.1~8.3 cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁 8 cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。
切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。
PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。
目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
2.将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。
除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。
也可取10 ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。
取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。
之后有两种方法供选择，一是按照marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。
在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF 膜和滤纸，平衡10 min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。
3.带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在PVDF 右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3 张浸泡过缓冲液的滤纸。
WB快速转膜液的使用方法及步骤
WB快速转膜液的使用方法及步骤NcmBlot Rapid Transfer Buffer 快速转膜液是新赛美生物研发的一种高达20 倍浓度的高效转膜液，用于Western Blot 湿转法转膜，能高效快速地将蛋白转移到印迹膜（PVDF或硝纤膜）上。
不使用甲醇，能在15-30 分钟内完成转膜过程。
操作步骤
1 1：：1X 快速转膜液的配制（1000 ml）：取50 ml 快速转膜液（20X）+850 ml 去离
子水+100 ml 无水乙醇
2 2 ：做好转印三明治结构，然后转移至电泳槽中，设定恒流400 mA，电泳时间25-30
分钟完成蛋白转膜。
注意：PVDF 膜使用前要用无水甲醇润湿0 30 秒以上。
转印电流建议设定恒流, 400mA, 一般0 25-30 分钟可以将D 150kD 以下蛋白完全转印；小于D 100kD 蛋白0 20 分钟即可完全转印；对于大于D 150kD 蛋白，建议延长0 5-10 分钟。
凝胶的浓度影响转印的效率，对于胶浓度7.5%,20 分钟即可完成转印；对于胶浓度10%,25-30 分钟即可完成转印；对于胶浓度大于10%, 建议延长0 5-10 分钟
(4)40 分钟时间内转膜不需要放冰上，转膜槽内外都不可放冰预冷，否则会影响效率。
Western Blot 操作步骤(优化后)
Western Blotting SOP一、SDS-PAGE1清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗涤剂轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
用前用酒精干燥。
2灌胶与上样：(1)、玻璃板对齐，放好胶条，然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）(2)、配分离胶：加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用枪吸取胶沿玻璃注入，待胶面升到中间线偏高时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）(3)、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了（约30min）。
胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)、配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)、去掉胶条并用水冲洗一下加样孔和胶底部，以去除未聚合的丙烯酰胺，将其放入电泳槽中。
（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块玻璃板。
）(6)、蛋白的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至0.5ml离心管中，加入一份4×SDS和3份蛋白样品。
上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
（在缓冲液中加样。
）(7)、加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时要换枪头以免交叉污染。
Western Blotting(半干转) 超级详细步骤
Western Blotting Analysis Guide（半干转）Western blotting (半干转)可分为以下9个步骤：一、蛋白的提取A．总蛋白提取1. 将收集的细胞或组织(约0.1 g)从-80°C冰箱取出，按1:10 (w:v)加入冰浴的蛋白裂解液(RIPA)；并加入1/10体积的蛋白酶抑制剂（PMSF）2. 用Dounce 手动匀浆器或电动匀浆器，匀浆细胞或组织（注意：全程冰上操作，每个样品用Dounce 上下抽动相同的次数，电动匀浆器匀浆相同的转速及时间）3. 冰上静置20 min 后，12000 rpm 离心，4 °C，15 min，取上清。
B．核蛋白提取1. 称取100 mg 肝脏冰冻组织置于Dounce 手动匀浆器，加入1 mL 冰浴的核蛋白裂解液A，上下抽动5下（注意：全程冰上操作，不同组织上下抽动需摸条件，匀浆后能看到些许小组织块）2. 将匀浆液倒入1.5 mL 离心管，瞬时离心30 s3. 上清倒入另一1.5 mL 离心管，冰浴5 min4. 3000 rpm 离心，4 °C，10 min，上清倒入另一1.5 mL 离心管收集（此为胞浆蛋白）5. 沉淀加入50 μL 核蛋白裂解液B 吹打，冰浴20 min6. 12000 rpm 离心，4 °C，20 min，将上清吸入0.5 mL 离心管收集（此为核蛋白）。
二、蛋白浓度的测定在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA 分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
1．BCA标准品和样品的准备：（BCA标准品为5mg/mL）配制1mg/mL的标准品：取10 μL原标准品+ 40 μL PBS缓冲液混匀，浓度为1mg/mL 配制0.25 mg/mL的标准品：取5 μL上述1mg/mL的标准品+ 15 μL PBS缓冲液混匀，浓度为0.25 mg/mL样品用水以1– 5倍稀释，并且将蛋白裂解液用PBS缓冲液按相同的比例稀释作为样品的空白对照（建议样品稀释2倍，不同组织使用不同稀释倍数）。
Western blotting操作流程
Western Blotting （His-tag ）一、SDS-PAGE 电泳Sample 加入5×SDS Loading ，99℃、5分钟热处理，SDS －PAGE 电泳。
使用 Marker ：M1：Precidion Plus ProteinTM Dual Color Standards 5μl （Bio_Rad Catalog 161-0374） M2：Perfect ProteinTM Makers 10-225KDa 5μl （Novagen Catalog 69079）二、转膜（Blotting ）1、裁剪SDS －PAGE 胶，使所有样品、Marker 均包含在内，量取裁剪后胶的 长×宽，并裁剪相同尺寸的转膜滤纸12张，PVDF 膜1张；2、将PVDF 膜用甲醇浸泡10秒；3、将胶、转膜滤纸、PVDF 膜分别浸泡在如下图所示的相应转膜缓冲液中3~5分钟；4、依次按照下图所示的顺序在转膜仪的下表面叠放胶、转膜滤纸、PVDF 膜，用干净面巾纸拭干滤纸周围多余的液体，将转磨仪上表面安装好，轻轻下压上盖，使其与滤纸充分接触；5、按照胶尺寸1cm 2= 1mA 设定电流， 转膜120 min 。
三、封闭（Blockin ）1、配制Blockin 溶液，一般40ml 较合适（Blockin ：10ml 、一抗：14ml 、二抗：14ml ）；2、确认转移转膜后PVDF 膜上Marker-M1清晰，此时转膜成功；3、将转印后的PVDF 膜装入干净的水煮袋中，加入10ml 1.5%BSA/TBST ，尽量将气泡排干净，封口，用铝箔纸将水煮袋覆盖，RT 、摇动1hr 或4℃、O/N 封闭。
四、一抗1、取出封闭后的PVDF 膜，转入新的水煮袋中；A 液（负 极）（正极）C液B液胶PVDF膜2、加入14ml 1.5%BSA/TBST，按照1000：1的比例加入14μl一抗——Penta-HisAntibody, BSA free(QIAGEN Code.34660)，尽量将气泡排干净，封口，用铝箔纸将水煮袋覆盖，RT、摇动1hr进行反应。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
一、实验原理。
WB实验，即Western Blot实验，是一种常用于检测蛋白质的实验方法。
它通过电泳将蛋白质分离开来，然后用特定的抗体结合目标蛋白，最后通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
在WB实验中，主要包括蛋白质电泳分离、转膜、抗体结合和检测等步骤。
下面将详细介绍WB实验的步骤及操作要点。
二、实验步骤。
1. 蛋白质电泳分离。
首先，将待测样品加入SDS-PAGE凝胶槽中，进行蛋白质电泳分离。
电泳结束后，将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
2. 蛋白质转膜。
将电泳分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通常采用湿法转膜或半干法转膜。
转膜后，将膜进行封闭处理，以防止非特异性结合。
3. 抗体结合。
将待测蛋白质与特异性一抗进行孵育结合，然后进行洗脱，接着与辣根过氧化物酶标记的二抗结合。
最后再次进行洗脱，以去除非特异性结合。
4. 检测。
通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
化学发光法是常用的检测方法之一，它通过特定底物的化学反应产生发光信号，用于检测目标蛋白的存在与表达水平。
三、实验操作要点。
1. 实验前的准备工作要做到充分，包括准备好所需试剂、仪器设备的检查和调试等。
2. 在操作过程中要严格遵守操作规程，保证实验的准确性和可靠性。
3. 注意实验中各步骤的时间控制，避免步骤之间的等待时间过长或过短。
4. 蛋白质转膜时要注意膜的完整性和均匀性，避免出现膜上蛋白质分布不均匀的情况。
5. 在抗体结合和检测过程中，要注意洗脱的次数和时间，严格控制非特异性结合的发生。
6. 实验结束后，要及时清洗和维护仪器设备，妥善保存实验结果和数据。
通过以上步骤和操作要点的介绍，相信大家对WB实验的原理和操作有了更清晰的认识。
在进行实验操作时，一定要认真细致，严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文对大家有所帮助，谢谢阅读！。
半干转膜方法
半干转膜方法
半干转膜方法是一种常用的Western blotting 技术，主要步骤如下：1. 组装转移叠层：
- 用蒸馏水清洗电极。
- 在缓冲液中平衡凝胶。
- 剪裁印迹纸和转移膜，应与胶体同等尺寸。
如果膜需要比胶更大，使用聚脂薄膜面罩。
- 准备印迹纸：每个胶，至少剪裁6张与胶差不多同等大小的印迹纸。
根据所需缓冲液的用量测量印迹纸层的厚度和数目。
用转移缓冲液浸泡至少3张印迹纸。
一张张放于下电极，除气泡。
- 准备膜：对于每个胶，剪裁1个与胶同等大小或稍小一点的膜。
用蒸馏水提前润湿硝化纤维膜或者尼龙膜。
用甲醇提前润湿PVDF 或者其他疏水膜。
然后将膜浸润在转移缓冲液中2-5分钟。
2. 完成叠层：
- 将预先润湿的膜放置在印迹纸上。
- 将胶放置在膜上。
- 用浸润过的三层印迹纸覆盖在胶上。
- 进行电转移。
请注意，在进行半干转膜时，需要严格遵守实验步骤和操作规范，以确保实验结果的准确性和可靠性。
如果你对具体的实验细节或操作步骤有疑问，建议咨询相关专业人士或查阅相关实验手册。
Western 转膜步骤 操作方法
结合到硝酸纤维素膜上主要通过疏水键。硝酸纤维素膜对于常规使用非常好。对 于小的多肽，建议使用小口径的膜。
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PVDF 比硝酸纤维素膜更疏水，在转印过程中结合蛋白更紧密，可以耐受更多的 SDS。目前，PVDF 一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件。其适用于蛋白 测序。 尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合。其 SDS 耐受度甚至高于 PVDF，但也需 要更严谨的封闭条件。主要建议用于 Northern 和 Southern。
如果凝胶在较长有狭缝的胶板上用切胶刀通过胶盒上的狭缝轻推底部凝胶将很容易从胶板分如果凝胶在较短有凹口的胶板上使用切胶刀小心松凝胶的底部使凝胶从胶板滑离
Western 转膜步骤 操作方法 Western 转膜步骤 (建议用伯乐电泳系统来操作完成)
下面的步骤适用于通过 Xcell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最 佳效果，用户的优化是必要的。
II. 规格： 转印槽尺寸： 14.5cm x 14cm x 11cm Blot Module 容积：约 200ml 下缓冲液槽容积：600ml Blot 尺寸： 约 9cm*9cm 注意：在以下步骤中，应该始终使用手套以避免凝胶和膜的污染，并防止接触电 泳和电转过程中常用的刺激物。
Ⅲ 材料制备 a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的 Towbin 缓冲液， 其中含有 20％的甲醇。使用 Xcell Ⅱ转印系统进行成功的转膜，0.5Xtowbin 缓 冲液就可以提供足够的离子强度，而不产生过多的热量。这种缓冲液可能不适合 其它的转印系统，反过来也是这样。一升的转膜缓冲液制备方法如下（ 含 20％ 甲醇的 0.5X Towbin）
使用我们的 Tris-Glycine 转膜缓冲液： 去离子水 760 ml 转膜缓冲液（Cat. No. LC3675） 40 ml (25×未稀释液) 甲醇 200 ml 总体积 1000 ml 自己制备 Tris-Glycine 转膜缓冲液： Tris 碱 (12mM) 1.45 g 甘氨酸 (96mM) 7.2 g 甲醇（20％终浓度） 200 ml
wb 70kd转湿转条件
wb 70kd转湿转条件
在蛋白质印迹（Western Blot，简称WB）中，70KD（千道尔顿）的蛋白
质转膜至湿转膜膜上通常需要以下条件：
1. 准备转膜液：根据所使用的转膜膜的规格，准备适量的转膜液。
常用的转膜液包括硝化纤维转膜液和尼龙膜转膜液。
2. 准备凝胶和膜：将凝胶放在玻璃板中，然后将湿转膜膜与凝胶紧密接触。
确保凝胶和膜之间没有气泡。
3. 转膜：将组装好的凝胶和膜放入转膜液中，确保转膜液完全覆盖凝胶和膜。
将转膜仪设置为恒流模式，设置适当的电流和时间进行转膜。
通常情况下，70KD的蛋白质转膜时间在1-2小时之间。
4. 洗膜：转膜结束后，将膜从凝胶上剥离下来，用洗膜液清洗，以去除未转印的蛋白质。
5. 封闭和抗体孵育：将清洗后的膜用适当的封闭液封闭，然后加入一抗进行孵育。
一抗的选择应根据实验目的而定。
6. 显色和检测：孵育结束后，清洗膜并加入二抗进行孵育。
最后加入显色剂进行显色反应，并使用成像系统检测蛋白质条带。
请注意，以上仅为一般性步骤和注意事项，具体操作应根据实验需求和所用试剂盒的说明书进行。
western 实验操作流程
免疫印迹实验操作流程一、培养细胞总蛋白质的提取1. 每200ul预冷的RIPA裂解液中加入2ul PMSF，混匀后置冰上备用；2. 收集细胞，用预冷PBS洗涤细胞两次，尽可能吸干上清；3. 每106个细胞加100ul预冷的RIPA裂解液，与细胞充分混匀，置4℃条件下放置30m，每间隔5分钟吹打混匀；4. 4℃，12000rpm条件下离心5m，将上清转移入另一预冷的离心管中；5. 使用蛋白定量试剂盒及酶标仪对总蛋白质进行定量测定；调整蛋白浓度；6. 依据体积加入6×蛋白上样缓冲液（如不立即使用，置于-80℃待用）；沸水浴煮沸5分钟后准备上样。
二、电泳与转膜7. 清洗玻璃板，制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%分离胶和5%积层胶）；8. 蛋白提取液与预染蛋白分子量Marker上样，100V电泳；9. 依据实验要求剪出合适大小的PVDF膜，甲醇漂洗PVDF膜10s，并使用电转液完全浸润PVDF膜、胶板、海绵、滤纸15m；10. 剥胶后，根据预染蛋白分子量Marker确定目的条带的位置并切胶；11. 按阴极至阳极：海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序将转膜板固定于装满电转液的电转槽中，90V电转；12. 电转结束后，在膜上做标记；三、封闭、一抗与二抗孵育、显色13. 将膜条置于含5%脱脂奶粉的TBST中，室温缓慢振荡封闭1h；14. 将膜条转移至含1%脱脂奶粉的TBST稀释的一抗中：抗β-actin小鼠抗人单克隆抗体（1:4000），置4℃条件下缓慢振荡过夜（或室温振荡2h以上）；TBST 液洗膜三次，每次10min；15. 将膜条转移至含1%脱脂奶粉的TBST稀释的二抗中：辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（1:4000），室温缓慢振荡1h；TBST液洗膜三次，每次10min；16. 加入配制好的化学发光试剂ECL，室温2min后，X光片曝光、显影、定影。
WB快速转膜液的使用方法及步骤
WB快速转膜液的使用方法及步骤WB（Western blot）快速转膜液主要用于Western blot实验中的蛋白电泳转膜步骤，下面是其详细的使用方法及步骤：一、实验前准备：1.将WB快速转膜液从-20℃冷冻保存条件迅速转移到4℃冷藏保存条件下，使其溶解均匀，放置2小时。
2.取出所需的PVDF或NC膜，并用TBST缓冲液浸泡20分钟，去除其中的有机溶剂。
二、电泳结束后进行转膜：1.关闭电泳仪电源，在电泳槽中小心取出胶片和蛋白质凝胶。
2.使用无菌镊子或无菌手套，将蛋白质凝胶上胶及下胶用纸快速剥离，并在电泳槽中洗净。
3.高分子量蛋白质在脱胶缓冲液中洗2次，10分钟/次；低分子量蛋白质在脱胶缓冲液中洗1次，10分钟。
4.将含有蛋白质的凝胶快速转移到已浸泡在TBST缓冲液中的PVDF（或NC）膜上。
5.如有需要，先用标尺切割PVDF（或NC）膜，使其与凝胶大小相匹配。
三、转膜条件：1.将蛋白质凝胶和膜夹在两片不含泡沫的海绵之间，并同时将其与孔板或纸张夹在一起。
2.通过应用约100V的恒定电流进行转膜。
用正极连接电源端口上的红色插孔，负极连接黑色插孔。
3.根据样品大小和此前实验数据，预计转膜时间一般为1-2小时。
如果处理过的样品非常大，转膜时间可能需要延长。
四、将洗膜：1.在转膜完成后，将膜快速从转膜装置中取出，用冷缓冲液迅速冲洗转印膜以去除残余的凝胶。
2.将膜放入含有5%脱脂奶粉的TBST中的封闭沉淀液中，封闭30-60分钟。
五、主要试剂的准备：1. 酶标仪AB染色液准备：根据需要的体积，按照1：50的稀释比例将染色缓冲液（5x）稀释成1x稀释液中。
例如，对于20ml AB染色液，需要将0.4 ml染色缓冲液稀释成20 ml 1x稀释液。
2.抗体溶液准备：将所选择的一抗或二抗按照所需体积稀释成1xTBST中的合适浓度。
六、探测步骤：1.将膜与所选择的抗体孵育，通常在4℃下过夜。
2.将膜置于摇床上，与所选择的一抗或二抗孵育30分钟。
WB快速转膜液的使用方法及步骤
WB快速转膜液的使用方法及步骤步骤1：准备实验材料首先，准备WB快速转膜液、蛋白质样品、三极板、蛋白质电泳仪、电源、聚丙烯酰胺凝胶、转膜设备（如SEMI-DRY、wet-blotting设备）、膜（如聚偏氟乙烯膜）、转膜缓冲液等。
步骤2：准备电泳仪及相应试剂将电泳仪的电解液箱填充电泳缓冲液，确保电泳仪正常工作。
同时，将聚丙烯酰胺凝胶固定在三极板上，注入足够电泳缓冲液。
步骤3：制备蛋白质样品将待测蛋白质样品按照需要的浓度稀释，加入蛋白质样品加载缓冲液，进行煮沸处理，以使蛋白质样品变性。
步骤4：进行蛋白质电泳将经过处理的蛋白质样品加载到电泳凝胶上，选择合适的电压和电流进行蛋白质电泳，直到样品离开凝胶上部分。
步骤5：转膜前的处理将转膜缓冲液加入转膜设备的两个缓冲液槽中，确保膜能够完全浸泡在缓冲液中。
然后，根据使用的转膜设备进行相应的调整和设置。
步骤6：将凝胶膜和膜的装载首先，在转膜缓冲液中润湿膜，并将膜放置在凝胶上。
确保凝胶和膜完全贴合，并确保没有气泡存在。
在装载时要小心，避免触摸凝胶和膜的中心区域，以免影响蛋白质转移的均匀性。
步骤7：进行转膜根据使用的转膜设备进行相应的调整和设置。
根据实验要求选择合适的时间和电流进行转膜。
转膜结束后，取下膜。
步骤8：膜上蛋白质的固定将转膜后的膜浸泡在PBS或TBS缓冲液中，以洗去可能残留在膜上的转膜缓冲液。
接下来，将膜放入含有印迹缓冲液和印迹酶标抗体的孵育盘中，进行印迹反应。
步骤9：进行印迹检测根据需要，可以使用染色法或荧光法进行印迹检测。
通常，染色法使用二抗和染色剂来显示蛋白质带，而荧光法使用荧光标记的二抗来检测蛋白质。
步骤10：结果分析根据印迹检测的结果，对蛋白质的表达进行定量或定性分析，可以使用图片分析软件或相应的方法。
以上是WB快速转膜液的使用方法及步骤，使用时请根据实际情况选择合适的试剂浓度和操作步骤。
同时，还需要根据具体实验要求和仪器设备进行相应的调整和设置。
western转膜
western转膜western blot转移电泳一般操作流程总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。
胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。
合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。
电转缓冲液和电转条件的选择对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。
变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。
现在实验室常用的Bio-rad 小型Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表：槽式转印半干转印Mini Trans-Blot槽Trans-Blot半干转印系统转印槽印迹区域（宽x 长）10 x 7.5 厘米24 x 16 厘米转移参数凝胶夹数 2 -缓冲液要求450ml ≤200 ml电极距离4cm 按夹层结构厚度确定转移时间（高强度）60分钟15–60 分钟冷却蓝胶冷却装置/冷却旋管-凝胶容量18.3 x 19.3 厘米- 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）16 x 20 厘米- 1 块凝胶（2块凝胶堆叠）16 x 16 厘米-13.3 x 8.7 厘米- 3 个凝胶并列8.3 x 7.3 厘米每个凝胶夹1块凝胶共2个凝胶夹（两种尺寸）4个凝胶并列8.6 x 6.8 厘米通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD 以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。
所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。
电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。
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泡。 7. 将预先浸泡过的阳极侧的滤纸放置在凝胶上，确保除去进入的气泡。 8. 将预先浸泡过的转印垫放入转印模块的阴极核心。阴极核心是两块核心中较 深的一边，其电极板为暗灰色。小心取出凝胶和膜的组装体，按同样顺序放在转 印垫上，使凝胶距离阴极最近（图 2）。 9. 加入足够的预先浸泡过的转印垫，使其比阴极核心的边缘高出 0.5cm。将阳极 核心放在转印垫的上面。凝胶/膜组装体应可以稳固在转印模块的两半部分之间， 以确保所有组件完全接触。因为转印垫使用多次后会失去弹性，所以可能需要多 一块转印垫以确保转印模块的两边完全组合。当转印垫脱色并开始失去弹性时应 进行更换。 10. 将转印模块紧紧按在一起，沿滑轨放入电泳槽中。转印模块只能以一种方式 进入，所以可以在转印模块的左上角看到阳极标志。如果放置正确，转印模块右 手边倒置的黄金柱电极正好插入电泳槽右上方黄金柱电极近邻的孔中。 11. a) 对于 Xcell SureLock™:放入张力楔（tension wedge），其垂直面顶住转印模 块， 将凸柄前压，锁定电泳槽。 b) 对于 Xcell Ⅱ™ Mini-Cell：放置前楔（无螺孔），其垂直面顶住转印模块，将 后楔滑入，向后推紧。如果放置正确，后楔将不会和电泳槽上沿平齐。在后楔和 电泳槽之间会有一个狭缝。 12. 在转印模块中倒入转印缓冲液直至凝胶/膜复合层被转印缓冲液覆盖。不要将 液面至顶，这只会增加导电性和热量。 13. 通过电泳槽前端和转印模块前端的缝隙在外槽中加入 650ml 去离子水。水面 距离电泳槽上沿大概 2cm。这是用于运行过程中的散热。 14. 在上面放上盖子 15. 在电源关闭情况下，将红色和黑色导线插入电源。 16. 使用上页的条件进行转印。
膜的类型
结合到硝酸纤维素膜上主要通过疏水键。硝酸纤维素膜对于常规使用非常好。对 于小的多肽，建议使用小口径的膜。
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PVDF 比硝酸纤维素膜更疏水，在转印过程中结合蛋白更紧密，可以耐受更多的 SDS。目前，PVDF 一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件。其适用于蛋白 测序。 尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合。其 SDS 耐受度甚至高于 PVDF，但也需 要更严谨的封闭条件。主要建议用于 Northern 和 Southern。
Ⅳ 制备凝胶及膜的夹层：
凝胶和膜的夹层以及ຫໍສະໝຸດ 印垫应放置在转印模块的阴极，使其与转印单元的底部水 平。转印垫和组装体就位后，在电极的上方应有约 1cm 的缝隙（图 1）。 图 1 Cathode core
Ⅳ-A. 转印一块凝胶 1. 在电泳后，将切胶刀的斜边楔入胶盒两块板之间的缝隙 中，撬开每边的三个粘合点。胶盒的凹口（加样孔）面应面向上。在刀柄上来回 推动以分离胶板。在胶盒的各边缘重复直至胶板完全分离。当将切胶刀插入到两 块胶板之间时必需小心，以免对凝胶压力过大。 2. 当打开胶盒时，凝胶会粘附在胶盒的一边。小心移除无凝胶的胶板，使凝胶 留存在另一块胶板上。用切胶刀切除加样孔。 3. 将一片预先浸泡过的滤纸放在凝胶顶部，刚好在凝胶底部的"底脚"的上部（不 覆盖凝胶的底脚）。使用转印缓冲液持续饱和滤纸，确保赶走了进入的气泡。可 以使用玻璃移液管作为滚筒，轻轻在表面滚动，从而很容易做到这点。 4. 将胶盒翻转 ，使凝胶和 滤纸面向 下放置在 戴手套的手 掌上或者 放有一片 Parafilm?膜的干净平面上。使用下面的一种方法将凝胶从胶板上分离： a） 如果凝胶在较长（有狭缝）的胶板上，用切胶刀通过胶盒上的狭缝轻推底部， 凝胶将很容易从胶板分离。 b) 如果凝胶在较短（有凹口）的胶板上，使用切胶刀小心松凝胶的底部，使凝 胶从胶板滑离。
图 3 Tow gel membrane sandwich
Western 转印的优化
从 SDS 凝胶中进行 Western 蛋白转印的优化需要对一系列参数进行考虑。目的是
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转印所有凝胶上的蛋白并将其定量地转移到转印膜上。进行高效转印需要一定程 度的优化，尤其是对于大分子量和小分子量蛋白。
转印后，凝胶上应不残留或残留很少的蛋白。可以在转印后进行染色进行检测。 转移出凝胶的蛋白应该仅在接触凝胶的膜的一面可见。如果有怀疑，在转印时使 用第二个"支持膜"，你可以在转膜后染色，以检查是否有穿膜的迹象。如果发现 蛋白残留在凝胶上而且膜的结合性很差，可以考虑下列因素：
SDS vs 酒精
在多数转印实验步骤中都使用 SDS 和酒精。但两者对于成功的转印有相反的作 用，需要根据欲转印蛋白的性质加以优化。
SDS 对于蛋白的迁移是必要的，尤其有助于大分子量蛋白从凝胶上的转移。但由 于膜结合需要疏水相互作用，SDS 过多会抑制结合，尤其对于硝酸纤维素膜。如 果从蛋白上剥离太多 SDS，将无法将蛋白转移出膜。作为一个一般性的规则，如 果膜的结合力有效，但蛋白仍旧残留在凝胶上，在转印缓冲液中加入 0.01％会促 进完全转印。建议的步骤在转印缓冲液中不含有 SDS，但凝胶在电泳后不需要浸 泡在转印缓冲液中；凝胶中残留的 SDS 对于有效的转印已经足够。但另一方面， 酒精通过在蛋白上剥离 SDS 促进蛋白和膜的疏水接合。一般在转印缓冲液中加 入 20％的甲醇会增加硝酸纤维素膜的接合能力。
II. 规格： 转印槽尺寸： 14.5cm x 14cm x 11cm Blot Module 容积：约 200ml 下缓冲液槽容积：600ml Blot 尺寸： 约 9cm*9cm 注意：在以下步骤中，应该始终使用手套以避免凝胶和膜的污染，并防止接触电 泳和电转过程中常用的刺激物。
Ⅲ 材料制备 a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的 Towbin 缓冲液， 其中含有 20％的甲醇。使用 Xcell Ⅱ转印系统进行成功的转膜，0.5Xtowbin 缓 冲液就可以提供足够的离子强度，而不产生过多的热量。这种缓冲液可能不适合 其它的转印系统，反过来也是这样。一升的转膜缓冲液制备方法如下（ 含 20％ 甲醇的 0.5X Towbin）
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去离子水 加至 1L 总体积 1L
请参看 invitrogen 目录 648 页制备 NuPAGE®转膜缓冲液。 b) 制备转印垫－ 用大约 700ml 的转印缓冲液浸泡转印垫至饱和，浸泡在缓冲液 中时注意挤压转印垫去除气泡，这一步骤是必需的，因为不去除气泡可能会阻碍 生物分子的转印。 c) 制备转印膜和滤纸－ 将选择的转印膜和滤纸按凝胶尺寸裁好或使用预先裁 好的膜/滤纸复合层。
Western 转膜步骤 操作方法 Western 转膜步骤 (建议用伯乐电泳系统来操作完成)
下面的步骤适用于通过 Xcell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最 佳效果，用户的优化是必要的。
I. 所需材料： • Xcell SureLock™或 Xcell Ⅱ™ Mini-Cell 以及 Blot Module（Cat. Nos. EI10001, EI9001 及 EI9051） • 电泳后的迷你胶（mini- gel）（最大的尺寸 9cm*9cm） • 预先切割好的印记膜： 硝酸纤维素（Cat. no. LC2000 或 LC2001）， PVDF（Cat. No. LC2002）或 Nylon+（Cat. No. LC2003） • 转印垫（Cat. No. EI9052） • 甲醇 • 去离子水 • 转移缓冲液（配方见下文） • 用于平衡膜，滤纸和转移垫的浅盘
• PVDF 膜－预先将 PVDF 膜在甲醇，乙醇或异丙醇中湿润。在去离子水中稍事 润洗后，将膜放入含 50-100ml 转膜缓冲液的浅盘中放置数分钟。 • 硝酸纤维素膜/尼龙膜－直接放入转膜缓冲液中数分钟。 • 滤纸－在临使用前在转膜缓冲液中简单浸泡一下。 • 凝胶－凝胶应在跑完后立刻使用，讨论见下文。不要将凝胶浸泡在转膜缓冲液 中。
凝胶浓度
丙烯酰胺浓度越低，蛋白越容易转移下来。选择可以分离蛋白的浓度最低的凝胶。 梯度胶适用于转印一系列不同大小的蛋白，因为凝胶的孔与不同大小的蛋白匹配 良好。
凝胶厚度
蛋白比较易于从薄胶上转移下来，所以上样体积允许，使用 1.0mm 厚的胶取代 1.5mm 的胶。
电场（电压×时间）
如果电压过低而且转印时间过短，部分蛋白会残留在凝胶上。如果电压过高，小 蛋白会在结合到膜上前透膜而出。如果按建议的条件转印后有蛋白残留在胶上， 增加电压可能会有帮助，但不要超过 5V。但注意，一旦 SDS 从蛋白剥离，增加 转印时间或提高电压就无效果。一旦结合，即使延长转印时间，大部分蛋白也会 保持在膜上。
使用我们的 Tris-Glycine 转膜缓冲液： 去离子水 760 ml 转膜缓冲液（Cat. No. LC3675） 40 ml (25×未稀释液) 甲醇 200 ml 总体积 1000 ml 自己制备 Tris-Glycine 转膜缓冲液： Tris 碱 (12mM) 1.45 g 甘氨酸 (96mM) 7.2 g 甲醇（20％终浓度） 200 ml
图 2 Single gel membrane sandwich
Ⅳ-B 转印两块凝胶 1. 重复步骤 1-6（Ⅳ-A）两次，制作两个凝胶-膜组装体。 2. 将两个预浸泡过的转印垫放在转印模块的阴极外壳上。将第一个凝胶-膜组装 体按正确的方向放在转印垫上，使凝胶离阴极板最近（图 3）。 3. 将另一块预浸泡过的转印垫放在第一块膜复合体上。 4. 将第二个凝胶-膜组装体按正确的方向放在转印垫上，使凝胶离阴极板最近。 5. 进行"转印一块凝胶"中的 8-13 步。