重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选

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重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选

重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选作者：徐腾飞, 张文卿, 于红, 李丹【摘要】目的: 构建人表皮生长因子受体（HER2）胞外区（1 896 bp）基因的真核表达质粒（pcDNA6/v5his HER2）, 转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）, 获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2)。

方法: 用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列; 经酶切、连接构建pcDNA6/v5his HER2; 转化大肠杆菌DH5α, 筛选阳性克隆, 对其进行酶切及测序鉴定; 以PEI法将pcDNA6/v5his HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞, 经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周, 获得抗性克隆EMT6/HER2; 用RT PCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA, 免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。

结果: PCR产物与预期片段大小一致; pcDNA6/v5his HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后, 可见与PCR产物大小相同的片段; DNA测序结果显示, pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确; 用RT PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA, 免疫组化法证实, EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。

结论: 成功地构建了HER2胞外区真核表达载体, 获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株, 为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。

【关键词】HER2; 真核表达; 转染［Abstract］AIM: To construct an eukaryotic vector encoding extracellular domain of human epidermal growth factor receptors (HER2), pcDNA6/v5his HER2, and to screen HER2 positive clones from mouse breast cancer cell line EMT6. METHODS: The extracellular domain of HER2 was amplified from pcDNA3.1HER2 by PCR. pcDNA6/v5 his HER2 was prepared by inserting the fragment into the plasmid pcDNA6/v5his. Then the recombinant vector was identified by restriction enzyme and sequencing. Next, pcDNA6/v5his HER2 was transfected into the EMT6 cell line and the positive clones (EMT6/HER2) were screened with blasticidin. Finally, the expression of HER2 in EMT6/HER2 was detected by RT PCR and immunohistochemistry. RESULTS: The fragment of HER2 was amplified and pcDNA6/v5his HER2 was prepared successfully. No errors were found both in the sequence and ORF of the acquired fragment. The expected fragment of HER2 (1896 bp) was amplified from EMT6/HER2 by RT PCR and positive signals of HER2 were detected in EMT6/HER2 by immunohistochemistry. CONCLUSION: An eukaryotic plasmid encoding HER2 (pcDNA6/v5 his HER2) has been constructed and a cell line expressing HER2 stably has been prepared successfully.［Keywords］HER2 ; eukaryotic expression; transfection人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptors, HER2)属于表皮细胞生长因子受体(EGFR)家族成员, 是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的单链跨膜糖蛋白, 相对分子质量(Mr)为185 000。

tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立帅丽芳;赵勇;张若霜;银涛;唐博恒【摘要】为了构建tTS真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系,采用PCR方法,以质粒pTet-tTS为模板扩增tTS基因的编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pApoE-rtTA-Neo,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用RT-PCR、Western blot法检年测tTS的表达,成功构建了pApoE-rtTA-tTS-Neo真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的基因.真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究tTS 的功能奠定良好的实验基础.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(030)004【总页数】4页(P336-339)【关键词】tTS;基因表达;真核表达载体;HepG2细胞系【作者】帅丽芳;赵勇;张若霜;银涛;唐博恒【作者单位】广州军区疾病预防控制中心,广东,广州,510507;中山大学,实验动物中心,广东,广州,510080;中山大学,实验动物中心,广东,广州,510080;广州军区疾病预防控制中心,广东,广州,510507;广州军区疾病预防控制中心,广东,广州,510507【正文语种】中文【中图分类】Q785动物模型研究是疾病研究中的重要手段,合适的动物模型对于人类疾病的研究意义尤其重大。

但是由于转基因技术是一种基因全表达或不表达的技术,基因表达常不局限在一个器官,一个组织,简单的转基因技术无法回答基因功能的细节问题。

此外,转基因动物转入的外源基因常常由于某些基因表达产物使细胞或胚胎不耐受,从而妨碍了转基因动物的建立。

故目的基因表达在时序和水平上的有效调控,将有益于基因功能的研究、动物模型发育期间基因表达的分析以及基因治疗过程中基因的运载。

重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响

重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响目的构建针对慢性粒细胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的双表达逆转录病毒载体,初步探讨其对K562细胞表型的影响.方法以逆转录病毒载体pMSCV-neo为骨架,构建eGFP及针对bcr-abl b3a2型mRNA的反义RNA双表达载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同时构建对照载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40S和pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL80AS,酶切及测序鉴定各重组载体;以脂质体法转染各载体到PT67包装细胞后,G418筛选稳定的病毒产生细胞株,再以NIH3T3细胞测定病毒滴度并感染K562细胞,计数细胞数绘制细胞生长曲线,FCM检测细胞凋亡情况、并用Western blot检测PKR激活情况.结果酶切及测序结果证实各重组载体构建完全正确;G418筛选到高滴度重组逆转录病毒生产细胞株:PT67-MSCV/GFP、PT67-40as、PT67-40s和PT67-80as,且PT67-40as上清感染组K562细胞生长受抑制,其24 h 时早期细胞凋亡率为22.54±3.19%,与除PT67-80as组外的其余各组相比有显著差异(P＜0.05);PT67-40as和PT67-80as处理组细胞PKR 磷酸化水平分别增高了59.20%和60.33%,2AP能抑制PT67-40as的作用.结论成功构建重组逆转录病毒双表达载体,并发现其能抑制K562细胞生长并引起细胞凋亡,通过激活PKR抗肿瘤可望成为肿瘤新的靶向治疗策略.作者：曾建明冯文莉王小中赵世巧白卫君罗云萍温健萍涂植光黄宗干 ZENG Jian-ming FENG Wen-li WANG Xiao-zhong ZHAO Shi-qiao BAI Wei-jun LUO Yun-ping WEN Jian-ping TU Zhi-guang HUANG Zong-gan 作者单位：曾建明,冯文莉,王小中,赵世巧,白卫君,罗云萍,ZENG Jian-ming,FENG Wen-li,WANG Xiao-zhong,ZHAO Shi-qiao,BAI Wei-jun,LUO Yun-ping(重庆医科大学临床血液学教研室,临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室,重庆,400016)温健萍,WEN Jian-ping(Canadian Blood Services,Hamilton,ON L8S 1H8 Canada)涂植光,TU Zhi-guang(重庆医科大学临床生物化学教研室,重庆,400016)黄宗干,HUANG Zong-gan(重庆医科大学临床学院血液科,重庆,400016)刊名：第三军医大学学报ISTIC PKU英文刊名：ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE 年，卷(期)：2006 28(21) 分类号：Q782 R329.28 R733.722 关键词：慢性粒细胞白血病 PKR 反义RNA 逆转录病毒载体基因克隆。

HER2基因真核表达载体的构建及其抑瘤效应研究

HER2基因真核表达载体的构建及其抑瘤效应研究贺丽清张存李维娜张路张英起(第四军医大学生物技术中心，陕西西安710033)【摘要】目的构建HER2基因真核表达载体，研究其对肿瘤生长的抑制作用。

方法通过RT-PCR方法从HER-2+SKBR3细胞株中获得HER-2基因胞外段编码区cDNA，构建pRC-CMV-信号肽-hHER2-ECD真核载体，于大肠杆菌DH5α中进行扩增；用获得的质粒免疫小鼠，ELISA法和ELISPOT法分别检测体液及细胞免疫情况，然后用EMT-6细胞接种肿瘤，观察肿瘤生长情况。

结果构建的pRC-CMV-信号肽-hHER2-ECD真核载体经酶切和DNA测序分析，结果表明该基因的序列与设计的序列完全相同。

pRC-CMV-信号肽-HER2真核表达质粒转染细胞后，目的基因在mRNA水平的表达与预期结果一致。

获得的质粒能够引起较低的体液免疫，但其可诱导较高的T细胞反应，并且可明显降低小鼠成瘤率。

结论构建的HER2基因真核表达载体可在细胞中表达且对小鼠实体瘤的生长具有一定的抑制作用。

【关键词】真核表达载体HER2转染肿瘤Construction and antitumor effect of HER2 DNA eukaryotic expression vector He li-qing Zhang cun（The department of biotechnology center，The Fourth Military MedicalUniversity，Xi’an 710033，China）【Abstract】AIM: To construct an eukaryotic expressing vector of HER2 and investigate the inhibitory effect on the growth of tumor by the expression of the plasmid in vivo．．Methods：The cDNA of HER2 extracellular domain was prepared through RT-PCR from HER-2+SKBR cell line, then it was cloned into pRC-CMV vector and DH5α,the immunocompetence of the plasmid was study by ELISA and ELISPOT. Incubated mice with EMT-6 and the tumor growth was observed. RESULTS: DNA sequencing and restriction enzyme digestion proved that HER-2 gene was correctly connected.After transfection with plasmid pRC-CMV-signal peptide-HER2,293 cells could produce HER2 mRNA. The plasmid can induce low immune but high T cell response and it can restrain the growth of tumor obviously. CONCLUSION: P1asmid can express in cells,The plasmid Can inhibit the growth of solid tumor．【Key words】eukaryotic expressing vector ; HER-2; transfection; tumorHER2/neu基因编码分子量为185kDa的受体酪氨酸激酶HER2/neu蛋白，它与细胞恶性转化有关，是癌症病因学中的一种生物学相关蛋白。

PCV2真核表达载体的构建及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达

PCV2真核表达载体的构建及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2, PCV2）作为一种病毒感染引起的猪病，给养猪业造成了重大损失。

为了进一步探究PCV2的致病机制及开展疫苗研发，需要构建PCV2的真核表达载体，并在哺乳动物体内表达，以模拟自然感染状况。

一、PCV2真核表达载体的构建1.1 PCV2基因组的测序和分析起首对PCV2的基因组进行测序和分析，确定其中的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）和调控序列。

通过该基因组信息，设计并合成了PCV2 Cap的全长基因。

Cap基因是编码PCV2的结构蛋白的基因，对病毒的感染和复制起着重要作用。

1.2 载体的选择与构建为了在哺乳动物细胞中表达PCV2的Cap基因，需要选择合适的真核表达载体。

依据需要，选择了pCDNA3.1(+)作为基本载体。

将合成的PCV2 Cap基因与pCDNA3.1(+)载体进行酶切后，接受毗连酶的作用将两者毗连起来，并通过转化大肠杆菌获得重组质粒。

通过测序确认质粒重组成功，得到了PCV2真核表达载体。

1.3 转染与表达：将PCV2真核表达载体转染到奶山羊胎儿成纤维细胞中，利用Western blot和实时荧光定量PCR检测Cap蛋白或Cap mRNA 的表达状况。

结果显示，Cap蛋白和Cap mRNA的表达量在转染24小时后逐渐增加。

二、奶山羊胎儿成纤维细胞中表达PCV2的意义2.1 模拟真实感染通过在奶山羊胎儿成纤维细胞中表达PCV2，可以模拟自然感染的过程，更好地理解PCV2对细胞的感染和复制机制。

2.2 探究PCV2致病性机制通过观察PCV2在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达状况，可以揭示PCV2感染的潜在机制，例如病毒如何进入细胞、如何复制等，为进一步阐明其致病性机制提供线索。

2.3 疫苗研发的依据奶山羊胎儿成纤维细胞中表达PCV2不仅可以探究病毒感染机制，也为疫苗研发提供了依据。

突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达

突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达赵四敏;陈旭东;赵国强;董子明【摘要】Objective To construct mutant polβeukaryotic expression vector and to transfect it into EC9706 cell of polβ gene targeting. Methods To design a primer pair (primer 1/ primer 2) for amplifying polβ,the gene containing BamH I and Apa I was amplified by PCR, then was coloned into T-vector. Recombinant was identified by PCR and by DNA sequencing. After that,it was sub-cloned into pcDNA4-C plasmid. The eukaryotic expressing vector pcDNA4-C-polβ was obtained. It w as transfected into EC9706 cells of pol (3 gene targeting. The EC9706 cell lasting transfected with pcDNA4-C-pol β was obtained by G-418 screening. Results The eukaryotic expressing vector pcDNA4-C-polβ was obtained by PCR and sequencing, polβ protion was obtained from EC9706 cells which were screened by HislinkTM protion purification system,the result was identified by SDS-PAGE. Conclusion Mutant polβeukaryotic expression vector pcDNA4-C-polβ is successfully constructed and polβprotion is purified, which l ays a solid foundation for further studying polβfunction.%目的构建含食管癌突变型DNA聚合酶β基因(DNA polymerase β,polβ)的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706细胞中表达.方法根据食管癌突变型polβ基因序列,设计并合成一对特异性引物(引物1、引物2),通过PCR扩增获得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,将其克隆入T载体,PCR及测序鉴定无误后,将其插入真核表达载体pcDNA4-C,从而构建了含突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ.将重组质粒以脂质体包裹的方式转染入polβ基因敲除的EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.结果经过PCR筛选及 DNA测序鉴定,证实真核表达载体pcDNA4-C-polβ构建成功.筛选后的EC 9706细胞经HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化,仅在39 kD位置有一条带,证明蛋白表达及纯化成功.结论成功构建了食管癌突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,并纯化出polβ蛋白,为进一步研究polβ的功能奠定坚实的基础.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2012(041)017【总页数】3页(P1716-1718)【关键词】突变型DNA聚合酶β;pcDNA4-C真核表达载体;EC 9706细胞【作者】赵四敏;陈旭东;赵国强;董子明【作者单位】漯河医学高等专科学校,病理生理学教研室,河南漯河,462002;漯河医学高等专科学校,微生物学与免疫学教研室,河南漯河,462002;郑州大学基础医学院,微生物学与免疫学教研室,郑州,450001;郑州大学基础医学院,病理生理学教研室,郑州,450001【正文语种】中文DNA 聚合酶β（DNA polymeraseβ，polβ）是真核细胞DNA聚合酶家族的一员，为一看家基因，基因全长35kb，位于第8号染色体近着丝点处，有14个外显子及13个内含子，转录1.4kb mRNA，其启动子位于主要转录起始点的上游115bp内［1］。

重组人IL-12真核表达载体稳定转染EMT6细胞株及表达鉴定

【ｂｔｃ】ＯｊｃｖＴｓｂｓａｄｄｎｆＩ一２ｔｌｔｓｃｄｅｎＭ６Ｉ一１、ｔｏｓｅｏｂａｔｕａｏｅｌｍｄＡｓａｔｒｂｔｅｏｔｌｈｎｅｔ１ａｙｒｆｔｌｉＥＴ／Ｌ２ＭｅｄＲｃｉｋｒｔａｉｅｉｅａｉｉｉＬｙｓｂａｅｅｃｌｅｎｌｈｍｎｅｙｉｐｓｎ
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பைடு நூலகம்
临床和实验区学杂志
２００８年４月弟７卷弟４期
・ｌ・９
重组人ＩＬ一１２真核表达载体稳定转染Ｅ６细胞株ＭＴ
及表达鉴定
李丹张文卿于红吕锐徐腾飞２６７）６０１
人Ｉ２基因在小鼠乳腺癌细胞系中的稳定转染为进一步研究Ｌ一１
人ＩＬ一１肿瘤的分子机制及潜在的应用奠定了基础。２抗
基因表达
ＩｅｔｉａｏｆｔａｓｅｔｎａｘｒｓｉｎｏｕａｅｋｒｏｉｘｒｓｉｎｖｃｏｒＩ一１ｄｆｄｃｌｌｅＥＭＴ６．ＩＤａｄｎｉｃｔｎｏｒｎｆｃｉｎｄｅｐｅｓｏｆｈｍｎｕａｙｔｃｅｐｅｓｏｅｔＬｆｉｏ２ｍｏｉｉｅｌｉｅｎＬｎ，ＺＨＡＮＧ
ｅｃｄｎｎｏｉｇＩＬ一１ｅｅ（ｃＮ６一ｐ０ａａｓｅｅｔＥＴ．ＴｅｐｓｉｌｅｅｅｓｌｔｄｂｌｔｉｉＣ。ａｄｔｅｅｅｉｅｔ２ｇｎｐＤＡ７）ｗｓｔｎｆｔｉｏＭ６ｈｏｉｖｃｎｓｗｒｅｅｅｙＢａｉｄｎＳＨ１ｎｈｙｗｒｄｎｉｒｅｄｎｔｅｏｃｓｃ —

重组HBsAg真核表达载体的构建及其稳定转染H22细胞的筛选

ＨＢｓｏｉｖｌｎｓｆｏｍｏｓｅａｉａｃｒｃｌｌｎ２．ｅｈｄＴｈＡｇｐｓｔｅｃｏｅｒｍｕｅｈｐｔｃｃｎｅｅｌｉｅＨ２ＭｔｏｓｉｅＨＢｓｅｅｗａａｌｅｒｍＵＣ１一ＡｇｇｎｓｍｐｉｄｆｏＰｉｆ８ＨＢＶｙｂＰＣＲ．ＣＤＮＡ３一ｐＨＢｓｓｐｅｒｄｂｎｅｔｇｔｅｆａｍｅｎｏｔｅｐａｍｉｃＡｇｗａｒｐａｅｙｉｓｒｉｈｇｎｔｔｈｌｓｄｐＤＮＡ３．ｈｅｈｅｏｉａｔｖｃｏｓｄｎｉｅｙｎｒｉＴｎｔｅｒｃｍｂｎｅｔｒＷａｉｅｔｄｂｎｉｆ
Ｋｅｒｓ：ｙｗｏｄＨＢｓＡｇ；ｕｅｈｐｔａｃｒｃｌ；ｒｓｅｔｏｍｏｓｅａｉｃｎｅｅｌｔｍ￣ｆｅｉｎｃ
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基金项目：林大学研究生创新基 Байду номын сангаас 资助项目（０９０１吉２０１３）＊通讯作者
（）：４．７２６１
ｇｎｓｄｉｉｒＶｓｓｔＪ．ｅｅｈｒ２０，：２７ｅｅｓｈａｔ，ａｏｔｉ］ＧｎＴｅ，０２９１０．ｉｂｏａｎ［
（稿日期：００—０ —１）收２１３６
文章编号：０４８（０１０ —０１ —０１７— ２７２１）１０４３０
ＰＲ［］吉林大学学报（ＣＪ．医学版）２０，０５：１．，０４３（）７３
［］６温进坤，郭庆，韩梅，．组人ＥＯ真核表达质粒在大鼠骨等重Ｐ

sTRAIL真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞增殖影响的体外实验研究

ＣｏｓｒｃｉｎｆｅｋｒｏｃｒｃｍｂｎｎＴＲＡＩｅｐｅｓｏｅｔｒａｄｓｕｙｏｔｎ —Ｃ６— ｌｍａｎｔｕｔｏｕａｙｔｅｏｉａｔｓｏｉＬｘｒｓｉｎｖｃｏｎｔｄｎｉａｔ－ｓｉ－ｉｇｏ
ａａｎｔＣｌｍａｃｌｌｅＭｅｈｄＡｆｒｃｎｔｃｉｎｏｕａｙｔｅｏｉａｔＴｇｉｓ６ｇｉｅ１ｉ．ｏｎｔｏｓｔｏｓｔｆｋｒｏｉｒｃｍｂｎｎＲＡＩｘｒｓｉｎｖｃｏ一ｅｕｒｏｅｃｓＬｅｐｅｓｏｅｔｒ一ｃＰＤＮＡ— ＴＲＡＬｂａｓｏＣＲａｄｄｒｃｅｌｎｎ．ｔｅＣｌｍａｃｌ１ｅｗａｒｎｆｃｅｙｃｔｎｃｓＩｙｍｅｎｆＰｎｉｔｄｃｏｉｇｈ６ｇｉｅｏｅ１ｉｓｔａｓｅｔｄｂａｉｉｎｏｌｏｏａｄｈｐｏｉｒｔｎｎａｏｔｓｓｆｃｌｗｓｅｅｔｄｙＣｉｓｍｅｎｔｅｒｌｅａｉａｄｐｐｏｉｏｅｌａｄｔｃｅｂＦＭ．ＲｅｕｔＴｈｃｎｔｃｉｎｏｐｆｏｓｓｌｓｅｏｓｕｒｔｆｏｅｋｒｏｉｒｃｍｂｎｎＴｕａｙｔｅｏｉａｔｓＲＡＩｘｒｓｉｎｖｃｏ－ —ＰＤｃＬｅｐｅｓｏｅｔｒ — ｃＮＡ— Ｔ — ＲＡＩｏｆｍｅｕｃｓｙｇｎｅｕｎｉｇａｄｓＬｃｎｒｄａＳｃｅｓｂｅｅｓｑｅｃｎｎｉ

人雌激素受体β绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

人雌激素受体β绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达李慧;安莲效;郭静;顾月清【摘要】目的构建人雌激素受体β(EBβ)绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体,并稳定转染乳腺癌MCF-7细胞.方法通过双酶切将pCMV5-hERβ中的人ERβ cDNA克隆到pEGFP-C3中,构建并鉴定重组质粒pEGFP-hERβ,然后转染乳腺癌MCF-7细胞,采用G418(500 μg/mL)筛选出稳定转染的细胞系,在荧光显微镜下观察融合蛋白质在真核细胞内的表达分布,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ERβ的mRNA转录水平.结果成功构建重组表达载体pEGFP-hERβ,有效转染并筛选出稳定转染ERβ基因的MCF-7细胞系,外源性ERβ基因在MCF-7细胞中获得了有效转录,并在细胞质和细胞核中均广泛分布.结论建立了稳定表达ERβ的MCF-7细胞系,为筛选ERβ调节荆和进一步研究ERβ在乳腺癌中的作用及其机制奠定基础.%Purpose To construct a es trogen receptor β (ERβ) green fluorescent protein eukaryotic expression vector and to transfect stably MCF-7 breast cancer cells.Methods The cDNA of human ERβgene was cloned into pEGFP-C3 from pCMV5-hERβ by double digestion to create recombinant plasmid pEGFP-hERβ.The recombinant plasmid was identified and transfected into MCF-7 cells.Then stable transfectants were selected byG418.The expression and localization of ERβ in MCF-7 cells were assayed by fluorescence microscopy.The transcription of ERβ in the s tably transfected cells was also examined by RT-PCR.Results The ERβ green fluorescent protein eukaryotic expressio vector was successfully constructed and effectively transfected into MCF-7 cells.Then the stably ERβ-transfected MCF-7 cell line was screened.The transcription ofexogenous ERβ in transfected cells was confirmed, and the ERβ was abroad distributed in the cytoplasm and nucleus.Conclusion The stably ERβ-transfected MCF-7 cell line was established.It has provided an important basis for screening E Rβ modulators and furtherly investigating the involvement of ERβ in breast cancer as well as its mechanism.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2011(032)001【总页数】4页(P18-21)【关键词】雌激素受体β;载体构建;转染;MCF-7细胞【作者】李慧;安莲效;郭静;顾月清【作者单位】中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009;中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009;中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009;中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009【正文语种】中文【中图分类】Q78乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%。

抗阿尔茨海默病重组真核表达载体的构建

抗阿尔茨海默病重组真核表达载体的构建何颖;黄力;章亚男;黎怀星;陈蕊雯;孙树汉【期刊名称】《第二军医大学学报》【年(卷),期】2004(25)1【摘要】目的 :将淀粉样蛋白 N端的抗原表位基因以 4种不同的组合与小鼠 Ig G 重链区基因融合 ,构建抗阿尔茨海默病的重组质粒。

方法 :通过 RT- PCR技术从小鼠脾组织中克隆 Ig G重链区 c DNA,将柔性接头与抗原表位基因序列设计在5′端引物中 ,然后以克隆出的小鼠 Ig G重链区 c DNA为模板 ,用 PCR法克隆出由柔性接头将抗原表位和 Ig G重链区基因融合在一起的序列 ,并插入到 p VAX质粒载体中。

结果 :扩增出来的 4种不同组合的抗原表位基因和 Ig G重链区基因融合序列大小分别为 999、1 0 2 0、1 0 0 5、1 0 2 6 bp,均与 Gen Bank上登录的相符 ;p VAX重组质粒酶切结果表明融合基因正确地插入到 p VAX载体中 ,全自动测序亦显示抗原表位基因和 Ig G重链区基因为所需基因 ,接头序列也完全正确。

结论 :成功构建了抗阿尔茨海默病的 4种表位基因 - Ig G重链区融合表达的重组质粒。

【总页数】3页(P55-57)【关键词】阿尔茨海默病;重组真核表达载体;抗原;基因序列;基因表达【作者】何颖;黄力;章亚男;黎怀星;陈蕊雯;孙树汉【作者单位】第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室【正文语种】中文【中图分类】R749.16;R394【相关文献】1.抗血液肿瘤的反义VEGF基因序列及其重组真核表达载体 [J], 韩忠朝;何睿2.鸡Prox1基因重组真核表达载体的构建及其表达特征分析 [J], 袁超;高洪波;周磊;韩一帆;胡焱;段志强3.利用同源重组技术构建Hoxa5、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达[J], 李晶;张梦瑶;刘开东;柳楠;贺建宁4.利用同源重组构建Chordin、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究 [J], 荣恒;李晶;柳楠;张梦瑶;贺建宁5.重组LBP真核表达载体免疫制备兔抗人LBP抗体的研究 [J], 李永旺;麻莉;张德明;毛宝龄;钱桂生;徐剑铖;侯一峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

HER-2基因特异性核酶设计与体外转录载体构建

HER-2基因特异性核酶设计与体外转录载体构建姜锐;罗速;樊丽【期刊名称】《北华大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2008(009)005【摘要】目的构建人表皮生长因子受体-2(HER-2)特异性核酶(ribozyme,RZ)及其底物基因的体外转录载体.方法设计合成RZ基因,将该RZ克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,测序鉴定.应用Trizol试剂提取MDA-MB-453细胞总RNA,RT-PCR扩增靶基因HER-2 cDNA片段,同样插入载体pcDNA3.1(+),测序鉴定.结果经DNA测序分别证实合成的RZ基因序列和通过RT-PCR扩增的HER-2 cDNA 序列克隆入pcDNA3.1(+)中.结论构建HER-2特异性RZ真核表达载体及含有HER-2 cDNA的载体,有助于进一步研究RZ对靶基因切割作用及雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER-2信号转导通路.【总页数】3页(P417-419)【作者】姜锐;罗速;樊丽【作者单位】北华大学,基础医学院,吉林,吉林,132013;北华大学,基础医学院,吉林,吉林,132013;北华大学,基础医学院,吉林,吉林,132013;齐齐哈尔医学院,黑龙江,齐齐哈尔,161042【正文语种】中文【中图分类】R737.9【相关文献】1.c—erbB—2特异性核酶基因体外转录载体的构建与快速鉴定 [J], 毕锋;惠宏襄2.慢性粒细胞白血病特异性bcr—abl三核酶体外转录载体的构建及鉴定 [J], 冯琦;赵永同3.Her-2基因特异性核酶体外表达载体的建立 [J], 麻馨月;赵雪4.犬贾第虫病毒转染载体介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体切割效果的研究 [J], 陈丽凤;李建华;邹亚学;赵月平;曹利利;张西臣5.碱基切除修复基因HOGG1特异性锤头状核酶表达载体的构建及其功能的初步研究(英文) [J], 张遵真;张勤;吴媚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立论著文章编号:100025404(2007)0120032204人M CHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立袁成福,杨俊霞,魏丽丽,石华,陈济,宋方洲 (重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,教育部临床检验诊断学重点实验室,重庆400016)提要:目的构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系。

方法采用PCR方法,以人胎脑c DNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长c DNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO 细胞系,用RT2PCR、W estern bl ot及免疫荧光法检测MCHR2的表达。

结果成功构建了pc DNA3.1(+)/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因。

结论真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础。

关键词:MCHR2;真核表达载体;稳定转染的CHO细胞系;基因表达中图法分类号:R338.2;R394233;R394.3 文献标识码:ACon structi on of eukaryoti c expressi on vector of hu man M CHR2and est ablish m en t of its stable tran sfected CHO cell li n eY UAN Cheng2fu,Y ANG Jun2xia,W E IL i2li,SH IHua,CHEN J i,S ONG Fang2zhou(Depart m ent of B i oche m istry and Molec2 ular B i ol ogy,ChongqingM edical University,Chongqing400016,China)Abstract:O b j ec ti ve T o construct eukaryotic ex p ressi on vect or of human melanin2concentrating hor mone recep t or2(MCHR2)and transfect CHO cells t o establish stable CHO cellline.M e tho d s The full2length MCHR2c DNA frag ment was a mp lified by PCR fr om the human fetal brain c DNA library and was inserted int o eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+),after the identificati on by digesti on and sequencing on the recom2 binant eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+)/MCHR2,the recombinant was transfected int o CHO cell by li pofecta m ine T M2000.After screening culture by G418,stable transfected CHO cell line was established, and the transcri p ti on and exp ressi on ofMCHR2were identified by RT2PCR,W estern bl otting and i m munofluo2 rescence.R e su lts The eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+)/MCHR2was constructed successfully.The stable transfected CHO cell line was established.The MCHR2p r otein was exp ressed successfully.Co nc lu2 s i o n The constructi on of the eukaryotic exp ressi on vect or pc DNA3.1(+)/MCHR2and the establish ment of stable transfected CHO cell line p r ovide s olid f oundati on for further experi m ental studies on the functi on of MCHR2.Key words:MCHR2;eukaryotic exp ressi on vect or;stable transfected CHO cell line;gene exp ressi on肥胖是现代社会中常见的营养障碍性疾病,其发病率在发达国家和发展中国家逐年上升,已成为一个全球性的健康问题。

tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

ＪＳ．ＨＡＮＸＩＡＧＲＩＣ．ＵＮｌ（ｔｒｇｉｎｅＥｄｉｉｎ）Ｖ．ＮａｌｉｌｇＳｆｅｃｔｏ
ｔＳ真核表达载体构建及稳定转染ＨｅＧＴｐ２细胞系的建立
帅丽芳赵勇张若霜银涛唐博恒，，，，
（．广州军区疾病预防控制中心，东广州５００；２１广１５７．中山大学实验动物中心，东广州５０８）广１００
经酶切和测序鉴定后，脂质体转染法转染ＨｅＧ２细胞，过Ｇ４８筛选，立稳定转染的ＨｅＧ２细胞系，ＲＴ－用ｐ通１建ｐ用
ＰＲ、ｓｅｎｂｏＣＷｅｔｒｌｔ法检年测ｔＴＳ的表达，功构建了ｐｏ —ｔＡｔＳＮｏ真核表达载体，建立了稳定转染的成ＡｐＥｒＴ —Ｔ — ｅ并ＨｅＧ２细胞系，功地表达目的基因。真核表达载体成功构建和稳定转染ＨｅＧ２细胞系的建立为进一步研究ｔＳｐ成ｐＴ
ＳＥＮｉｒｉｙ，ｕｇｚｕＧｕＵｎｖｅｓｔＧａｎｈｏａｎｇｄｏｇ１０８０，ｎ５０Ｃｈｉｎａ）ＡｂｔａｔＩｒｅＯｃｓｒｃｕｋｙｉｘｐｅｓｉｃｏｒｏｆｔｅｒｃｃｉｅｏｒｌｄｔａｃｉｉｎａｉｅｅ（ＴＳ），ｓｒｃ：ｎｏｄｒｔｏｎｔｕｔｅａｒｏｔｃｅｒｓｏｎｖｅｔｈｅｔｔａｙｌｎｃｎｔｏｌｅｒｎｓｒｐｔｏ１ｓｌｎｃｒｔａｒｎｆｃｅＧ２ｃｌｓｔｓａｉｈｓａｅＨｅＧ２ｃｌｌｎｅｔｕｌｌｎｈｔＳｎｄｔａｓｅｔＨｐｅｌｏｅｔｂｌｓｔｂｌｐｅｌｉ．ｈｅｆｌｅｇｔＴＤＮＡｒｇｅｓａｐｌｉｄｂｙＰＣＲｆａｍｎｔｗａｍｉｅｆ

HBV preS2真核载体的构建及其表达

HBV preS2真核载体的构建及其表达陈熙;李金丽;王鑫;张明;詹利生;万艳平【期刊名称】《医学临床研究》【年(卷),期】2006(023)011【摘要】[目的]扩增乙型肝炎病毒(HBV)前S2基因(preS2),并构建其真核表达载体,为研究HBV树突状细胞疫苗奠定实验基础.[方法]从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,用聚合酶链反应技术扩增全长preS2基因,将其克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定筛选阳性克隆,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-preS2,并将其转染巨噬细胞48 h后,ELISA检测细胞裂解液中preS2的表达.[结果]从慢性乙型肝炎患者血清抽提的DNA中扩增得到约860bp 大小的目的片段,preS2基因片段正确插入pcDNA3.1(+)载体,得到HBV preS2真核表达载体pcDNA3.1(+)-pre2.[结论]成功地构建了含preS2基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-preS2,并能在巨噬细胞中表达目的蛋白HBV preS2.【总页数】3页(P1709-1711)【作者】陈熙;李金丽;王鑫;张明;詹利生;万艳平【作者单位】南华大学病原生物学研究所,湖南,衡阳,421001;南华大学解剖学教研室,湖南,衡阳,421001;南华大学病原生物学研究所,湖南,衡阳,421001;南华大学病原生物学研究所,湖南,衡阳,421001;南华大学病原生物学研究所,湖南,衡阳,421001;南华大学病原生物学研究所,湖南,衡阳,421001;南华大学病原生物学研究所,湖南,衡阳,421001【正文语种】中文【中图分类】R342.4【相关文献】1.HBVS基因、PreS2/S基因真核重组载体的构建与鉴定 [J], 李志刚;江元森;杨林;庄鹏;凌小强;李刚;姚集鲁2.HBV S基因、PreS2／S基因真核重组载体的构建与鉴定 [J], 李志刚;江元森;杨林;庄鹏;凌小强;李刚;姚集鲁3.HBV前C区启动子的克隆和HBV.CP-β-IFN真核表达载体的构建 [J], 万谟彬;张斌;李成忠;陈志辉;张迁;陈姬秀4.HBV PreS2S/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达 [J], 陈红梅;白雪帆;黄长形;李光玉;洪沙5.以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建 [J], 田泽维;董文其;李明;王萍;黄建生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

TFAP2A基因重组真核表达载体的构建及鉴定

TFAP2A基因重组真核表达载体的构建及鉴定郭宇琪;王亚丽;张智源;高玉婧【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2024(46)1【摘要】目的构建转录因子增强子结合蛋白-2α的真核表达载体并进行鉴定,为TFAP2A的后续研究提供有效工具。

方法采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对真核表达载体CV702质粒进行酶切获得线性化载体;通过PCR扩增制备TFAP2A的cDNA片段,将线性化载体和TFAP2A的cDNA扩增产物进行体外环化连接,构建CV702-TFAP2A重组质粒。

将连接产物进行细菌转化,挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定,对阳性克隆进行测序及结果分析。

将CV702-TFAP2A重组真核表达载体转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,通过Western blot检测TFAP2A的表达效率。

结果菌落PCR扩增和测序结果显示,CV702-TFAP2A重组真核表达载体构建成功;Western blot结果与Image J灰度值分析结果显示,与CV702对照载体相比,转染CV702-TFAP2A重组质粒的MDA-MB-231中的Flag-TFAP2A蛋白相对表达量更高(P<0.05)。

结论成功构建CV702-TFAP2A的重组真核表达载体,证实转染CV702-TFAP2A的细胞中Flag-TFAP2A的表达水平升高。

【总页数】6页(P26-31)【作者】郭宇琪;王亚丽;张智源;高玉婧【作者单位】宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室;宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系【正文语种】中文【中图分类】R739.41【相关文献】1.山羊痘病毒P32基因重组真核表达载体的构建与鉴定2.HEV ORF3真核表达载体的构建、鉴定和真核表达3.小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定4.绿色荧光蛋白报告基因与ZNF580基因重组真核表达载体的构建与鉴定5.SEA 和喉癌MAGE-A3基因重组真核共表达载体的构建和鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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HER2作为跨膜蛋白, 由胞外结构域(ECD)、跨膜结构域和胞内结构域(ICD)三部分组成。

ECD主要是由两个配体结合区(RLD) 与两个富含半胱氨酸区构成［1］。

HER2 RLD可与EGFR受体家族的其他成员及配体形成复合物, 参与细胞增殖信号的转导［2］。

HER2 基因主要是在人体的胚胎发育时期表达, 它参与多种组织器官的生长发育, 而在成人正常组织中此基因常以单拷贝存在, 表达水平较低; 研究表明, HER2 基因异常扩增或过表达与多种肿瘤的发生、发展及预后有密切相关, 其中以乳腺癌最为密切, 已成为乳腺癌复发、患者生存期判断的一个独立指标［3］。

研究显示, HER2 ECD阳性乳腺癌患者对内分泌治疗及化疗的反应性降低、预后差、肿瘤呈进行性生长、总生存和无疾病生存期短及肿瘤复发率高［4］。

因此, 构建重组HER2表达载体并获得稳定转染乳腺癌细胞株可为深入研究HER2基因过表达与乳腺癌的关系及其基因治疗奠定基础。

由于全长HER2 基因有导致正常细胞转化的潜在风险, 而且, 其胞内区具有激酶活性的结构域与其他激酶有较高的同源性［5］。

因此, 本研究我们选取HER2 的ECD构建真核表达质粒（pcDNA6/v5 his HER2）; 将其转入HER2阴性的小鼠乳腺癌细胞(EMT6)中, 以获得稳定表达HER2 ECD的EMT6细胞株（EMT6/HER2）。

1 材料和方法1.1 材料带有HER2全长基因的重组质粒（pcDNA3.1HER2）由北京医药技术研究所林亚军博士惠赠; EMT6细胞购自第四军医大学实验动物研究中心。

PCR试剂购自上海生工公司; 质粒pcDNA6/v5 his、TRIzol 及杀稻瘟菌素(Blasticidin)购自Invitrogen公司; AMV反转录酶购自Promega公司; DL 2 000 DNA marker购自TaKaRa; T4 DNA 连接酶、Hind Ⅲ和Nhe Ⅰ内切酶购自Fermentas。

质粒小提试剂盒购自TIANGEN; RPMI1640完全培养基购自Gbico公司; 胎牛血清购自杭州四季青; 胰酶购自Amersco; 多聚乙烯酰胺(PEI)购自Sigma公司; HER2检测免疫组化广谱试剂盒购自迈新生物技术公司。

1.2 方法1.2.1 HER2 ECD基因的扩增以GenBank中NM_004448的ORIGIN为参考序列设计引物, 引物序列上游: 5′ctaaccatggagctggcggccttgt3′（起自第237 bp）, 下游: 5′ccatcaactgcacccacggg3′(第2 133 bp终止), 上下游引物5′端分别加入Hind Ⅲ和NheⅠ酶切位点。

拟扩增的HER2胞外区长度为1 896 bp, 加酶切位点后产物总长度为1 914 bp。

以pcDNA3.1 HER2为模板进行PCR扩增。

反应循环参数: 94℃5 min, 94℃1 min, 62℃1 min, 72℃1 min, 30个循环, 72℃延伸10 min。

1.2.2 pcDNA6/v5his HER2的构建回收并纯化PCR 产物; 用Nhe I和Hind Ⅲ分别对PCR产物、pcDNA6/v5his进行双酶切、纯化; T4 DNA连接酶16℃水浴过夜连接; 连接产物转化DH5α感受态细菌, 并于含50 mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基37℃培养过夜; 挑取阳性克隆, 扩大培养, 按质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒; 用PCR、双酶切对重组质粒进行鉴定无误后, 送TaKaRa公司测序。

1.2.3 pcDNA6/v5hisHER2转染EMT6细胞分别以pcDNA6/v5his HER2（实验组）及pcDNA6/v5 his（空质粒对照组）用PEI法转染EMT6细胞, 以未转染正常EMT6细胞作为空白组。

转染方法参照文献［6］进行。

1.2.4 EMT6细胞中HER2 mRNA的检测用TRIzol RNA提取试剂盒, 分别提取正常EMT6、对照组和实验组抗性细胞中的总RNA, 溶于DEPC水。

用HER2 ECD的上下游引物进行PCR扩增。

扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.5 HER2在EMT6中表达产物检测(1)细胞爬片制备: 用胰酶消化抗性克隆细胞, 将无菌洁净的盖玻片放入培养瓶中, 加入适量培养液, 待细胞达90%汇合时, 取出盖玻片; 用100 g/L甲醛固定30 min, 置-20℃保存。

(2)用免疫组化方法检测细胞中HER2基因的表达, 具体参照试剂盒说明书。

2 结果2.1 HER2胞外区基因的PCR扩增以pcDNA3.1HER2为模板, 用PCR扩增HER2 ECD基因, 琼脂糖凝胶电泳结果显示, PCR产物为长度为1 896 bp, 与预期PCR产物大小一致（图1）。

2.2 pcDNA6/v5his HER2 的鉴定pcDNA6/v5his HER2转化DH5α宿主菌后获得大量阳性克隆, 分别用菌液PCR、双酶切及测序对重组克隆进行鉴定。

(1)随机挑取8个菌落于ALB液体培养中扩增; 做菌液PCR初步鉴定, 获得预期的结果（图2）。

(2)将阳性菌落扩增后行质粒小提, 用Hind Ⅲ和NheⅠ进行双酶切, 电泳结果显示, 标本1切出与PCR产物大小一致的片段（3、5可能为不完全酶切, 图3）。

⑶标本1送TaKaRa公司测序, 结果显示pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确。

2.3 质粒转染和克隆筛选转染细胞经Blasticidin (终浓度为10 mg/L)持续筛选10 d后可观察到单克隆形成, 再以含维持量的Blasticidin(终浓度为2 mg/L)培养液进行克隆扩增, 得到EMT6/HER2（实验组）和EMT6/pcDNA6/v5 his(对照组）两种细胞株。