大肠杆菌基因工程(2)

2. 以包涵体形式表达目的蛋白的操作
如果未进行特殊设计(如分泌型表达或融合型表达),外 源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以 上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。
因此，以包涵体形式表达目的基因的操作关键就是选择 高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长 处所在。
3. 以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式的优点：
效果好。
HS
HS
B S-S-R
Байду номын сангаас+ R-S-S-R
HS
S
S
2R-SH
（二）分泌型异源蛋白的表达
在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分 为两种形式：
➢即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中； ➢或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外
膜进入培养基中。
蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。
能简化外源基因表达产物的分离操作
包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分， 菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋 白从细菌裂解物中分离出来。
能在一定程度上保持表达产物的结构稳定
在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异 源重组蛋白的稳定性已不再构成威胁。
包涵体表达形式的缺点：
A
AA
蛋白质不能进入复性过程，因此，成为无活性的蛋白质。
❖包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进
行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）和复性操作。
2）包涵体的溶解与变性：
包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键 在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。
能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：
清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化 促溶剂 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发
形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应
极端pH 廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应 混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强
5. 包涵体的复性与重折叠（refolding）：
二、大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
（一）包涵体型异源蛋白的表达
1. 包涵体及其性质
包涵体(Inclusion Bodies，IB)：在某些生长条件下， 大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地 集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露的水不溶 性结构。
以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必 须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构 象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操 作的效率对目标产物的收率至关重要。
然而，这也是一个技术难题,尤其当目标蛋白分子中的Cys 残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不 超过30%。
富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的 大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧 失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。
由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同 源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细 菌细胞内。
除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋 白分子。
细菌不仅在基因重组技术的诞生和技术进步中起到了举 足轻重的作用，而且细菌的遗传改造也是基因工程中历史 最早、研究最广泛、取得实际应用成果最多的领域。
7-1. 大肠杆菌基因工程
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
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基因工程
7. 基因工程的应用
大肠杆菌基因工程 酵母菌基因工程 高等植物基因工程 哺乳动物基因工程
细菌与基因工程密不可分。1973年，Boyer和Cohen首次 完成外源基因在大肠杆菌中的表达，在实验室里实现了基 因转移，为基因工程开启了通向现实应用的大门。
几年后，第一个基因工程产品—利用构建基因的基因工 程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的 产业时代。
形成二硫键的方式主要有：
➢ 化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空 气，二硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸 残基的蛋白质的重折叠。
HS A S
HS
S
2e + 2H+
➢ 二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和
GSSG），二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠
4. 包涵体的变性与复性操作
1）蛋白质变性复性的动力学原理： C1
C2
Cn C
U 变性状态的蛋白质 N 天然状态的蛋白质
U
I1
In N
C 共价修饰的蛋白质 A 集聚状态的蛋白质
I 有效变复性过程中的中间状态
X1 X2 Xn X
X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态
❖在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的 A
1. 蛋白质的分泌机制
原核细菌周质中含有多 种分子伴侣可阻止分泌蛋 白的随机折叠，分泌在细 胞周质或培养基中的重组 蛋白很少形成分子间的二 硫键交联；
因此与包涵体相比，分 泌型重组蛋白具有较高比 例的正确构象，生物活性 的回收率增加，且对蛋白 酶不敏感。
包涵体的复性与重折叠的主要任务是： 将多肽链中被拆开的游离巯基重新形成二硫键， 多肽链重新折叠 通过次级键的形成使蛋白质复性
包涵体的复性与重折叠(refolding)：二硫键形成
在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽 链中的巯基保持还原状态，防止二硫键错配导致严重 的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须 重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。