【CN109735479A】一种合成2’岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用【专利】

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2’-岩藻糖基乳糖 hplc

2’-岩藻糖基乳糖（2'-Fucosyllactose）是一种重要的人乳中寡糖，其在婴儿发育和免疫系统健康方面扮演着至关重要的角色。

近年来，随着人们对婴儿配方奶粉和母乳替代品的需求增加，对2’-岩藻糖基乳糖的研究和生产也变得愈发重要。

在这篇文章中，我们将以从简到繁的方式，深入探讨2’-岩藻糖基乳糖这一主题。

首先从其基本概念和结构特点开始，逐步展开到其在婴儿营养和健康方面的重要作用，最后将讨论其在分析检测中的应用及其在食品工业中的意义。

1. 2’-岩藻糖基乳糖的基本概念2’-岩藻糖基乳糖，简称2’-FL，是一种存在于人乳中且含量较高的寡糖成分。

它的化学结构中包含岩藻糖和乳糖两个部分，具有独特的生物功能和生理活性。

在人体内，2’-FL可以被婴儿的盲肠中的盲肠杆菌特有的酶所分解，产生短链脂肪酸等对肠道健康有益的代谢产物。

2. 2’-岩藻糖基乳糖在婴儿发育中的作用研究表明，2’-岩藻糖基乳糖不仅可以预防婴儿腹泻和呼吸道感染，还能够促进正常的肠道菌群组成和免疫系统的发育。

2’-FL还具有抗菌和抗病毒的作用，帮助婴儿建立健康的免疫系统。

3. 2’-岩藻糖基乳糖的分析检测和食品工业应用从分析检测的角度来看，高效液相色谱（HPLC）是目前常用的分离和检测2’-岩藻糖基乳糖的方法之一。

在食品工业中，添加2’-FL到婴儿配方奶粉和其他营养品中，可以模拟母乳的营养成分，促进婴儿的健康成长。

总结：2’-岩藻糖基乳糖作为一种重要的寡糖成分，不仅在婴儿发育和免疫系统健康方面发挥着重要作用，还具有广阔的应用前景。

通过HPLC等分析方法的检测和分离，能够更好地理解和应用2’-FL，从而更好地满足婴儿和儿童的营养需求，促进其健康成长。

个人观点：对于2’-岩藻糖基乳糖这一寡糖成分，我认为我们需要更多的科研投入和生产技术的发展，以满足日益增长的市场需求，并为婴儿和儿童的健康提供更好的保障。

在接下来的内容中，我们将进一步探讨2’-岩藻糖基乳糖的制备、生产工艺和应用前景，以及其在人体内的生物学机制和作用方式。

一种高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用[发明专利]

专利名称：一种高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
专利类型：发明专利
发明人：刘龙,邓洁莹,陈春梅,吕雪芹,李江华,堵国成,陈坚
申请号：CN201910093694.0
申请日：20190130
公开号：CN109749976B
公开日：
20220401
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，所述重组芽孢杆菌是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达鸟苷酸激酶和核苷二磷酸激酶基因，并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。

本发明通过改造枯草芽孢杆菌168获得了可高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖的菌株，其胞内积累量高达196.15g/L。

本发明通过强化表达鸟苷酸激酶和核苷二磷酸激酶基因，强化胞内GDP‑L‑fucose合成辅因子GTP的供应，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的合成。

本发明重组枯草芽孢杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

申请人：光明乳业股份有限公司
地址：201103 上海市闵行区吴中路578号
国籍：CN
代理机构：北京东正专利代理事务所(普通合伙)
代理人：蔡仲德
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2’-岩藻糖基乳糖生物合成

2’-岩藻糖基乳糖生物合成
2'-岩藻糖基乳糖是一种生物合成产物，是由岩藻糖基转移酶
催化的反应在乳糖基上加入一个岩藻糖基团。

生物合成过程中，岩藻糖基转移酶通过将底物中的乳糖基与岩藻糖底物进行酯化反应，催化形成2'-岩藻糖基乳糖。

岩藻糖基转移酶通常存在于一些具有钙离子等金属离子依赖的微生物中。

这些酶通过催化反应在乳糖基上加入一个岩藻糖基团，形成2'-岩藻糖基乳糖。

这个反应过程是一个酯化反应，
需要底物中的乳糖基与岩藻糖底物进行酯化反应。

2'-岩藻糖基乳糖在食品、医药和生物工程等领域有着广泛的
应用。

它具有良好的保湿、抗氧化和抗菌等生理活性，可以用作食品添加剂、保健品和药物等。

2'-岩藻糖基乳糖意见稿标准

2'-岩藻糖基乳糖意见稿标准2'-岩藻糖基乳糖是一种新型的食品添加剂，具有较强的保健功能和应用前景。

为了促进该产品的发展和应用，制定2'-岩藻糖基乳糖的意见稿标准是非常必要的。

本文将从产品定义、质量要求、检测方法等方面进行详细讨论。

首先，对于2'-岩藻糖基乳糖的定义，意见稿标准应明确规定其成分、特性和用途。

2'-岩藻糖基乳糖是由乳糖和岩藻糖通过特定的反应制得的一种复合食品添加剂，具有促进肠道健康、增强免疫力等功能。

该添加剂可以广泛应用于乳制品、保健品、婴幼儿食品等领域。

其次，意见稿标准应对2'-岩藻糖基乳糖的质量要求进行明确规定。

质量要求包括成分含量、外观特征、致病菌及重金属残留、添加物含量等方面。

通过对这些质量要求的规范，可以保证产品的安全性和可靠性，为消费者提供高品质的食品。

第三，关于2'-岩藻糖基乳糖的检测方法，意见稿标准应提供详细的检测方法和要求。

例如，可以引用国际标准方法、行业标准方法或自行研发的方法进行检测。

检测方法涉及到成分含量、外观特征、微生物指标、重金属残留、添加物含量等多个方面，必须确保检测结果准确可靠。

此外，意见稿标准还应规定2'-岩藻糖基乳糖的使用范围和限制。

例如，规定2'-岩藻糖基乳糖的最大使用量、适用的食品类别、使用方法等，以避免对人体健康产生不良影响。

最后，意见稿标准还应对2'-岩藻糖基乳糖的包装、储存和运输进行规范。

包装要求应符合相关法规和标准，以确保产品的品质和安全。

储存和运输要求应包括温度、湿度等条件，以保证产品在整个供应链的质量稳定性。

综上所述，制定2'-岩藻糖基乳糖的意见稿标准对于促进该产品的发展和应用具有重要意义。

通过明确产品的定义、质量要求、检测方法、使用范围和限制，可以确保产品的安全性和可靠性，推动食品行业的可持续发展。

2’-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010449420.3(22)申请日 2020.05.25(71)申请人江南大学地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号(72)发明人刘龙　陈坚　堵国成　李江华　吕雪芹　邓洁莹　刘克　(74)专利代理机构苏州市中南伟业知识产权代理事务所(普通合伙) 32257代理人王玉仙(51)Int.Cl.C12N 1/21(2006.01)C12N 15/75(2006.01)C12N 15/62(2006.01)C12P 19/00(2006.01)C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称2’-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法(57)摘要本发明公开了一种2'‑岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，属于代谢工程技术领域。

本发明通过融合表达重组枯草芽孢杆菌BSGL ‑FF中的岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因获得了可高效合成2’‑岩藻糖基乳糖的菌株，其发酵上清液中积累量高达1.62g/L，比对照菌株高了55％。

本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

权利要求书1页说明书5页序列表2页附图3页CN 112111437 A 2020.12.22C N 112111437A1.一种2'-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGL中过表达岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶与岩藻糖基转移酶的融合蛋白得到，其中，所述的枯草芽孢杆菌BSGL是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因得到。

2.根据权利要求1所述的重组芽孢杆菌，其特征在于，所述的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶与岩藻糖基转移酶之间通过linker连接。

一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110134041.X(22)申请日 2021.02.01(71)申请人天津科技大学地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发区第十三大街29号(72)发明人李庆刚　李玉　卫鑫慧　路福平　王凤华　秦慧民　(74)专利代理机构北京瑞盛铭杰知识产权代理事务所(普通合伙) 11617代理人栗华楠(51)Int.Cl.C12N 1/21(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12P 19/00(2006.01)C12R 1/19(2006.01)(54)发明名称一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其应用(57)摘要本发明涉及一种生产2’‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其应用，属于微生物代谢工程领域。

本发明提供的2’‑岩藻糖基乳糖从头合成途径关键酶表达水平的调控策略，通过将不同的酶分别进行基因组过表达或者质粒过表达的调控，能够大幅提高代谢通路的效率，利用相关策略构建的基因工程菌株，与现有技术相比提高13倍以上，为2’‑岩藻糖基乳糖的工业生产奠定了基础。

权利要求书1页说明书8页序列表7页附图7页CN 112501106 A 2021.03.16C N 112501106A1.一种生产2’‑岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，是在宿主细胞基因组上插入单拷贝磷酸甘露糖异构酶ManA、磷酸甘露糖变位酶ManB，GDP ‑甘露糖‑4,6‑脱水酶Gmd和GDP ‑岩藻糖合成酶WcaG，在质粒上多拷贝过表达甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC和2’‑岩藻糖基乳糖合成酶FutC，敲除β‑半乳糖苷酶LacZ，过表达β‑半乳糖苷透性酶LacY获得的；所述宿主细胞为大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的一种生产2’‑岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，还包括在质粒上多拷贝过表达糖外排转运蛋白SetA。

大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖基因组整合型菌株构建及发酵优化

大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖基因组整合型菌株构建及发酵优化劳才文;吴金勇;李忠奎;廖迎雪;王纪;袁丽霞;陈祥松;姚建铭【期刊名称】《安徽农业大学学报》【年(卷),期】2024(51)1【摘要】2’-岩藻糖基乳糖(2’-Fucosyllactose,2’-FL)是一种岩藻糖化人乳低聚糖,具有预防肠道疾病、提高免疫力、促进大脑发育等重要生理功能。

基于基因组水平,通过敲除大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中2’-FL合成前体物质相关代谢基因,如β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase,lac Z)、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因(undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase,wca J)和GDP-甘露糖基水解酶基因(GDP-mannose mannosyl hydrolase,nud D),构建2’-FL合成底盘细胞;在此基础上,将外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因(α-1,2-Fucosyltransferase,wbg L)和磷酸甘露糖变位酶基因(phosphomannomutase,man B)、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因(annose-1-phosphate guanylyltransferas,man C)、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶基因(GDP-mannose 4,6-dehydratase,gmd)和GDP-岩藻糖合酶基因(GDP-L-fucose synthase,wca G)引入到大肠杆菌基因组中,探究在基因组水平过表达2’-FL合成基因对2’-FL产量的影响。

结果表明,2’-FL在所构建菌株B-05的摇瓶含量达到了1.99 g·L^(-1)。

进一步通过摇瓶发酵优化确定了最优发酵条件:IPTG诱导浓度为0.4 mmol·L^(-1)、诱导时OD600为2.4,诱导温度为28℃。

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(2)构建包含岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的重组质粒，将构建好的重组质粒转化步骤(1)的重组枯草芽孢杆菌，通过验证，确认岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌。
5 .根据权利要求4所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，替换框的序列如SEQ ID NO .1所示。
(10)申请公布号 CN 109735479 A (43)申请公布日 2019.05.10
权利要求书1页说明书5页序列表7页附图1页
CN 109735479 A
CN 109735479 A
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1 .一种合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。
4 .一种权利要求1所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：
(1) 构建包含淀粉酶基因amyE位点的上下游序列、乳糖运输酶基因、P43 启动子和博来霉素抗性基因序列的替换框，将构建好的替换框转化枯草芽孢杆菌168，通过验证，确认乳糖运输酶基因强化表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌；
说明书
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一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
技术领域 [0001] 本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。
背景技术 [0002] 母乳中含有重要营养成分，生物活性物质，刺激肠道菌群生长的因子。其中，母乳寡糖(Human Milk Oligosacchrides ,hMOs)在许多生理功能上起到了关键的作用，例如促进双歧杆菌生长，病原体感染的抑制作用，和提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖 (FOSs)由于其生理功能如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和减少炎症的能力，已经获得了极大的关注。因为藻糖基化的寡糖是由岩藻糖基转移酶催化进行糖类岩藻糖基化而成，这就需要鸟苷二磷酸盐藻糖(GDP-L-fucose)作为岩藻糖基的供体。再经过岩藻糖基转移酶的催化，将岩藻糖作为活化基团转移到乳糖上，岩藻糖通过α-1 , 2糖苷键与半乳糖相连，形成2 '-岩藻糖基乳糖。 [0003] 随着岩藻糖基化的寡糖的热度越来越高，许多制药公司试图通过化学方法和生物方法合成充足的GDP-L-fucose。在化学合成中，GDP-L-fucose以 L-岩藻吡喃糖基四乙酸为起始原料，由HBr、Ag2CO3、N-四丁铵磷酸二甲苯酯等物质引发的化学反应。GDP-L-fucose是可拉酸的前体，可拉酸是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，因此，一些肠道细菌如大肠杆菌和沙门氏菌能在体内合成GDP-L-岩藻糖。在生物中发现了两种合成GDP-L-fucose的代谢途径：补救途径和从头途径。两种途径都需要乳糖作为底物，但是枯草芽孢杆菌对乳糖的利用能力有限。 [0004] 因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过生物方法高效合成2 '-岩藻糖基乳糖，仍是本领域亟待解决的问题。
杆菌及其构建方法与应用 ( 57 )摘要
本发明提供了一种合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，所述重组芽孢杆菌是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因，并表达外源岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。本发明通过在基因组上强化表达乳糖运输酶基因，有效强化了乳糖运输酶的表达，提高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细胞质中乳糖的浓度，促进了2 '-岩藻糖基乳糖的合成。本发明重组枯草芽孢杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
8 .根据权利要求4所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，重组质粒的序列如SEQ ID NO .2所示。
9 .权利要求1所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，使用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生成2 '-岩藻糖基乳糖。
2
CN 109735479 A
2 .根据权利要求1所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将 P43启动子和乳糖运输酶基因替换枯草芽孢杆菌168的淀粉酶基因amyE位点，来强化表达枯草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因。
3 .根据权利要求1或2所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因来源于脆弱拟杆菌，岩藻糖基转移酶来源于幽门螺旋杆菌。
6 .根据权利要求4所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤 (1) 中，将构建好的替换框电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，替换框的添加量为100-300ng。
7 .根据权利要求4所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤 (2) 中，将脆弱拟杆菌中的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因序列，幽门螺旋杆菌中的岩藻糖基转移酶基因序列和质粒pP43NMK进行克隆连接。
( 19 )中华人民共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请

(21)申请号 201910093684 .7
(22)申请日 2019 .01 .30
(71)申请人光明乳业股份有限公司地址 201103 上海市闵行区吴中路578号
(72)发明人刘龙邓洁莹陈春梅吕雪芹李江华堵国成陈坚
(74)专利代理机构北京东正专利代理事务所 (普通合伙) 11312
代理人蔡仲德
(51)Int .Cl . C12N 1/21(2006 .01) C12N 15/75(2006 .01) C12P 19/12(2006 .01) C12R 1/125(2006 .01)
( 54 )发明名称一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢