【CN109735479A】一种合成2’岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用【专利】
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6 .根据权利要求4所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特 征在于 ，步骤 (1) 中 ，将构建好的替换框电 转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞 ，替换框的添 加量为100-300ng。
7 .根据权利要求4所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特 征在于 ，步骤 (2) 中 ，将脆弱拟杆菌中的 岩藻糖激酶 和磷酸鸟嘌呤 基转移酶基因序列 ，幽门 螺旋杆菌中的岩藻糖基转移酶基因序列和质粒pP43NMK进行克隆连接。
(10)申请公布号 CN 109735479 A (43)申请公布日 2019.05.10
权利要求书1页 说明书5页 序列表7页 附图1页
CN 109735479 A
CN 109735479 A
权 利 要 求 书
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1 .一种合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌是 通过在枯草芽孢杆菌168的 基因组中强化表达乳糖运输酶基因 ，并表达外源岩藻糖基转移 酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。
2 .根据权利要求1所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将 P43启动子和乳糖运输酶基因替换枯草芽孢杆菌168的淀粉酶基因amyE位点，来强化表达枯 草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因。
3 .根据权利要求1或2所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于， 岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因来源于脆弱拟杆菌，岩藻糖基转移酶来源于幽门螺 旋杆菌。
说 明 书
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一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方 法与应用
技术领域 [0001] 本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯 草芽孢杆菌及其构建方法与应用。
背景技术 [0002] 母乳中含有重要营养成分，生物活性物质，刺激肠道菌群生长的因子。其中，母乳 寡糖(Human Milk Oligosacchrides ,hMOs)在许多生理功能上起到了关键的作用，例如促 进双歧杆菌生长，病原体感染的抑制作用，和提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖 (FOSs)由于其生理功能如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和 减少炎症的能力，已经获得了极大的关注。因为藻糖基化的寡糖是由岩藻糖基转移酶催化 进行糖类岩藻糖基化而成，这就需要鸟苷二磷酸盐藻糖(GDP-L-fucose)作为岩藻糖基的供 体。再经过岩藻糖基转移酶的催化，将岩藻糖作为活化基团转移到乳糖上，岩藻糖通过α-1 , 2糖苷键与半乳糖相连，形成2 '-岩藻糖基乳糖。 [0003] 随着岩藻糖基化的寡糖的热度越来越高，许多制药公司试图通过化学方法和生物 方法合成充足的GDP-L-fucose。在化学合成中 ，GDP-L-fucose以 L-岩藻吡喃糖基四乙酸为 起始原料，由HBr、Ag2CO3、N-四丁铵磷酸二甲苯酯等物质引发的化学反应。GDP-L-fucose是 可拉酸的前体，可拉酸是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，因此，一些肠道细菌如大肠杆菌 和沙门氏菌能在体内合成GDP-L-岩藻糖。在生物中发现了两种合成GDP-L-fucose的代谢途 径：补救途径和从头途径。两种途径都需要乳糖作为底物，但是枯草芽孢杆菌对乳糖的利用 能力有限。 [0004] 因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过生物方法高效合成2 '-岩藻糖基乳糖，仍是本 领域亟待解决的问题。
4 .一种权利要求1所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特 征在于，该构建方法包括以下步骤：
(1) 构建包含淀粉酶基因amyE位点的 上下游序列、乳糖运输酶基因 、P43 启动子 和博来 霉素抗性基因序列的替换框，将构建好的替换框转化枯草芽孢杆菌168，通过验证，确认乳 糖运输酶基因强化表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌；
(74)专利代理机构 北京东正专利代理事务所 (普通合伙) 11312
代理人 蔡仲德
(51)Int .Cl . C12N 1/21(2006 .01) C12N 15/75(2006 .01) C12P 19/12(2006 .01) C12R 1/125(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢
(2)构建包含岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的重组质粒，将 构建好的重组质粒转化步骤(1)的重组枯草芽孢杆菌，通过验证，确认岩藻糖基转移酶、岩 藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌。
5 .根据权利要求4所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特 征在于，步骤(1)中，替换框的序列如SEQ ID NO .1所示。
8 .根据权利要求4所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特 征在于，步骤(2)中，重组质粒的序列如SEQ ID NO .2所示。
9 .权利要求1所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于， 使用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生成2 '-岩藻糖基乳糖。
2
CN 109735479 A
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910093684 .7
(22)申请日 2019 .01 .30
(71)申Hale Waihona Puke Baidu人 光明乳业股份有限公司 地址 201103 上海市闵行区吴中路578号
(72)发明人 刘龙 邓洁莹 陈春梅 吕雪芹 李江华 堵国成 陈坚
杆菌及其构建方法与应用 ( 57 )摘要
本发明提供了一种合成2 '-岩藻糖基乳糖的 重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，所述重 组芽孢杆菌是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组 中强化表达乳糖运输酶基因 ，并表达外源岩藻糖 基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基 因得到的。本发明通过在基因组上强化表达乳糖 运输酶基因 ，有效强化了乳糖运输酶的 表达 ，提 高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细 胞质中乳糖的浓度，促进了2 '-岩藻糖基乳糖的 合 成 。本 发 明 重 组 枯 草 芽 孢 杆 菌的 构 建 方 法 简 单，便于使用，具有很好的应用前景。
7 .根据权利要求4所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特 征在于 ，步骤 (2) 中 ，将脆弱拟杆菌中的 岩藻糖激酶 和磷酸鸟嘌呤 基转移酶基因序列 ，幽门 螺旋杆菌中的岩藻糖基转移酶基因序列和质粒pP43NMK进行克隆连接。
(10)申请公布号 CN 109735479 A (43)申请公布日 2019.05.10
权利要求书1页 说明书5页 序列表7页 附图1页
CN 109735479 A
CN 109735479 A
权 利 要 求 书
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1 .一种合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌是 通过在枯草芽孢杆菌168的 基因组中强化表达乳糖运输酶基因 ，并表达外源岩藻糖基转移 酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。
2 .根据权利要求1所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将 P43启动子和乳糖运输酶基因替换枯草芽孢杆菌168的淀粉酶基因amyE位点，来强化表达枯 草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因。
3 .根据权利要求1或2所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于， 岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因来源于脆弱拟杆菌，岩藻糖基转移酶来源于幽门螺 旋杆菌。
说 明 书
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一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方 法与应用
技术领域 [0001] 本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯 草芽孢杆菌及其构建方法与应用。
背景技术 [0002] 母乳中含有重要营养成分，生物活性物质，刺激肠道菌群生长的因子。其中，母乳 寡糖(Human Milk Oligosacchrides ,hMOs)在许多生理功能上起到了关键的作用，例如促 进双歧杆菌生长，病原体感染的抑制作用，和提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖 (FOSs)由于其生理功能如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和 减少炎症的能力，已经获得了极大的关注。因为藻糖基化的寡糖是由岩藻糖基转移酶催化 进行糖类岩藻糖基化而成，这就需要鸟苷二磷酸盐藻糖(GDP-L-fucose)作为岩藻糖基的供 体。再经过岩藻糖基转移酶的催化，将岩藻糖作为活化基团转移到乳糖上，岩藻糖通过α-1 , 2糖苷键与半乳糖相连，形成2 '-岩藻糖基乳糖。 [0003] 随着岩藻糖基化的寡糖的热度越来越高，许多制药公司试图通过化学方法和生物 方法合成充足的GDP-L-fucose。在化学合成中 ，GDP-L-fucose以 L-岩藻吡喃糖基四乙酸为 起始原料，由HBr、Ag2CO3、N-四丁铵磷酸二甲苯酯等物质引发的化学反应。GDP-L-fucose是 可拉酸的前体，可拉酸是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，因此，一些肠道细菌如大肠杆菌 和沙门氏菌能在体内合成GDP-L-岩藻糖。在生物中发现了两种合成GDP-L-fucose的代谢途 径：补救途径和从头途径。两种途径都需要乳糖作为底物，但是枯草芽孢杆菌对乳糖的利用 能力有限。 [0004] 因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过生物方法高效合成2 '-岩藻糖基乳糖，仍是本 领域亟待解决的问题。
4 .一种权利要求1所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特 征在于，该构建方法包括以下步骤：
(1) 构建包含淀粉酶基因amyE位点的 上下游序列、乳糖运输酶基因 、P43 启动子 和博来 霉素抗性基因序列的替换框，将构建好的替换框转化枯草芽孢杆菌168，通过验证，确认乳 糖运输酶基因强化表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌；
(74)专利代理机构 北京东正专利代理事务所 (普通合伙) 11312
代理人 蔡仲德
(51)Int .Cl . C12N 1/21(2006 .01) C12N 15/75(2006 .01) C12P 19/12(2006 .01) C12R 1/125(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢
(2)构建包含岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的重组质粒，将 构建好的重组质粒转化步骤(1)的重组枯草芽孢杆菌，通过验证，确认岩藻糖基转移酶、岩 藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌。
5 .根据权利要求4所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特 征在于，步骤(1)中，替换框的序列如SEQ ID NO .1所示。
8 .根据权利要求4所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特 征在于，步骤(2)中，重组质粒的序列如SEQ ID NO .2所示。
9 .权利要求1所述的合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于， 使用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生成2 '-岩藻糖基乳糖。
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CN 109735479 A
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910093684 .7
(22)申请日 2019 .01 .30
(71)申Hale Waihona Puke Baidu人 光明乳业股份有限公司 地址 201103 上海市闵行区吴中路578号
(72)发明人 刘龙 邓洁莹 陈春梅 吕雪芹 李江华 堵国成 陈坚
杆菌及其构建方法与应用 ( 57 )摘要
本发明提供了一种合成2 '-岩藻糖基乳糖的 重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，所述重 组芽孢杆菌是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组 中强化表达乳糖运输酶基因 ，并表达外源岩藻糖 基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基 因得到的。本发明通过在基因组上强化表达乳糖 运输酶基因 ，有效强化了乳糖运输酶的 表达 ，提 高了外源乳糖转移至细胞质中的效率，增加了细 胞质中乳糖的浓度，促进了2 '-岩藻糖基乳糖的 合 成 。本 发 明 重 组 枯 草 芽 孢 杆 菌的 构 建 方 法 简 单，便于使用，具有很好的应用前景。