细胞冷冻保存技术共30页文档
细胞的冻存
细胞的冻存•在体外培养工作中，为了保留种子和长期保存培养物的活性，常须将培养物进行冷冻保存，并在需要的时候重新复苏和培养。
细胞的冻存•目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。
如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
•因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
采用甘油或二甲基亚砜作为保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。
•目前， DMSO(二甲基亚枫) 的应用更为广泛。
但要注意的是， DMSO 在常温下对细胞的毒副作用较大。
而在4℃时，其毒副作用大为减弱，且仍能以较快的速度渗到细胞内。
所以，冻存时 DMSO 平衡多在 4℃下进行，一般需要 40 ～ 60 min 。
故在细胞复温融解后要及时洗除冷冻保护剂。
冻存的方法：•主要材料：•仪器设备：普通4℃冰箱,－20℃低温冰箱和70℃～－80 ℃超低温冰箱，液氮罐,高速离心机等；•试剂与物品：PBS,0.25% 胰酶消化液,含10%血清细胞培养液，冻存液 (一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成),冻存管(容量为1ml或1.5ml)；•待冻存细胞。
冻存的步骤：•用 PBS 清洗培养瓶内的残留培养液,弃掉；•加0.25%胰酶消化液，37℃1～2min；•倒置显微镜观察:细胞间隙增大,细胞形态变为圆形,有大部分细胞漂浮即可进行终止；加含10%血清DMEM培养液中和,液体量同胰酶量等量中和；•收集离心,800 ～ 1000 r/最小离心6 min ；•制备成单细胞悬液，细胞计数,使细胞密度达到 1×106～1×107个/毫升,分装于冻存管内，做好标记(细胞类型，代数，细胞密度，冻存日期,经手人)分级冷冻：•有四种方法可以使用。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院风湿科李晶一、细胞冷冻保存生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Si gma D-2 6 5 0).无菌塑料冷冻保存管(Na I gene 5 0 0 0 -00 20)、0、4 % (w/ v)try pan blue(GibcoBRLI 5 250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYOlOSeri esl 1 )2、冷冻保存方法:(1)------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 传统方法：冷存管直于4°C 1 0分钟一一＞-20匸3 0分钟一一＞-80r 1 6'18小时(或隔夜) --------------------- 〉液氮槽V a P orph a s e长期储存.-209不可超过I小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死匚亦可跳过此步骤直接放入一8crc冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降温:利用已设定程序得等速降温机以一1〜-3・C/分钟之速度由室温降至(一8(rC以下)-12 (TC. 再放在液氮槽V a P orpha s e长期储存「适用于悬浮型细胞^hybridoma之保存。
3、步骤:(1)冷冻前24 -48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砚(DMS0)至 20%浓度，即制成双倍得冻存液，置于室温下待用.(3)离心收集培养之细胞，用加血淸得培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0、Inil)计数细胞浓度及冻前存活率。
(4)取与细胞悬液等量得冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5〜10%),使细胞浓度为1〜5X lo^cells/ml,混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，广2m I/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测•严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。
细胞冷冻保存方法、复苏经验总结
细胞冷冻保存方法、注意事项1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 –90 ％致密度。
2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
3、注意冷冻保护剂之品质。
DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron F GLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。
Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
4、冷冻保存之细胞浓度：（1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml（2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。
（3）adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。
Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
（4）other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 10 6cells/ml。
5、冷冻保护剂浓度为5 或10 ％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
6、冷冻方法：（1）传统方法: 4 oC 10 分钟---> -20 oC 30 分钟---> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜)---> 液氮槽vapor phase 长期储存。
（2）程序降温：利用等速降温机以–1 ～-3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC，放在液氮槽vapor phase 长期储存。
细胞冻存技术
细胞冻存技术
细胞冻存技术是一种将细胞保存在极低温度下的技术。
通过这种技术，细胞可以在未来重新恢复生命活动。
这种技术可以用于细胞的长期保存、研究和临床应用。
细胞冻存技术的步骤包括细胞的准备、加入保护剂、冷冻和解冻。
保护剂可以防止细胞在冷冻和解冻过程中受到损伤。
在冷冻过程中，细胞需要逐渐降温，以避免细胞内外的压力差异造成细胞损伤。
在解冻时，需要逐渐升温，并将细胞从保护剂中移除以恢复其正常状态。
细胞冻存技术在生物学、医学和农业等领域有着广泛的应用。
它可以用于保存珍稀濒危的生物种类，用于制备疫苗和药物，以及用于治疗癌症等疾病。
同时，这种技术也可以用于细胞学和遗传学的研究，以及人类和动物的生殖医学。
尽管细胞冻存技术已经被广泛应用，但是仍然存在一些挑战和限制。
其中最主要的问题是细胞在冻存和解冻过程中可能会受到损伤。
此外，需要对每种细胞类型进行不同的处理和优化，以保证成功的冻存和解冻。
因此，细胞冻存技术需要不断的改进和优化，以提高其应用的可靠性和效率。
- 1 -。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗一、细胞冷冻保存1.材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法：（1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase 长期储存。
-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。
适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。
然后进行冻存。
4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。
细胞冷冻保存方法实验方案
细胞冷冻保存方法实验方案ECACC实验室手册（第4版）默克带你走进细胞培养实验室。
目标图 1.细胞系冻存下述实验方案描述了细胞冷冻保存方法，包括采用-80°C冷冻电冰箱冷冻保存细胞系。
ECACC 通常使用可编程速率可控冰柜。
这是最可靠、最具可重现性的细胞冻存方法，但由于此类设备的成本超出了大多数研究实验室所能承受的范围，因此下文将详细描述其他一些方法。
如果需要定期冷冻大量细胞培养物，则建议使用可编程速率可控冰柜。
材料•冷冻培养基（通常为90% FBS、10% DMSO (C6164)或甘油(C6039)）•70％ (v/v) 乙醇无菌水溶液(793213)•PBS，不含Ca2+ / Mg2+(D8537)•0.05% 胰蛋白酶 / EDTA，溶于HBSS中，不含Ca2+/Mg2+(T3924)•DMSO (D2650)设备•个人防护装备（无菌手套、实验室工作服）•全脸保护面罩 / 护目镜•设置为37°C的水浴•适当密封水平的微生物安全柜•离心机•细胞计数板•预先贴好标签的安瓿瓶 / 冷冻管•细胞冷冻装置要点1. 最常用的细胞冷冻保护剂是二甲基亚砜（DMSO），然而，它并不适用于所有细胞系，例如HL60，因为DMSO会诱导这种细胞分化。
在这种情况下，应使用甘油等替代品（有关正确的细胞冷冻保护剂详情，请参阅ECACC数据表）。
2. 上面推荐的ECACC冷冻培养基已被证明是适合大多数细胞类型的良好的通用培养基。
另一种常用的细胞冷冻培养基配方是：70％基础培养基、20％ FBS、10％ DMSO，但可能不适用于所有细胞类型。
在定期使用之前，请确认是否适用于自身细胞。
3. 至关重要的是，培养物必须是健康的，并处于生长的对数阶段。
用预先汇合的培养物（低于其最大细胞密度的培养物），在细胞冷冻之前24小时更换培养基，即可实现这种条件。
4. 冷却速率可以改变，但一般原则是，每分钟降低1℃至3℃经证适合于大多数细胞培养物。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗一、细胞冷冻保存１、材料:生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSＯ(Ｓigma Ｄ—２６50)、无菌塑料冷冻保存管(Nalｇｅne 5０００-002０)、０.4%(ｗ/v)tｒypan blｕe(GibｃｏＢＲＬ15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KＲYO10SeriesII)2、冷冻保存方法:(1)传统方法: 冷存管置于４℃1０分钟---〉-２0℃30分钟-－—＞-８0℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaｐｏrpｈａｓｅ长期储存。
—２0℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-8０℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降温:利用已设定程序得等速降温机以－1~—3℃／分钟之速度由室温降至(-8０℃以下)－120℃,再放在液氮槽vapoｒphase长期储存。
适用于悬浮型细胞与hyｂrｉdｏmａ之保存。
3、步骤:(1)冷冻前２4—4８小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DＭSO)至２０％浓度,即制成双倍得冻存液,置于室温下待用、(３)离心收集培养之细胞,用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0、1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
(4)取与细胞悬液等量得冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为５～1０％),使细胞浓度为１～5×1０6ｃells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1～2ml／vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。
严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。
然后进行冻存、4、注意事项:(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphａｓｅ)且存活率高之状态,约为80～90％致密度。
冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如ｈybｒidｏｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗一、细胞冷冻保存1.材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法：（1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase 长期储存。
-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。
适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。
然后进行冻存。
4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗一、细胞冷冻保存1.材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法：（1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase 长期储存。
-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。
适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。
然后进行冻存。
4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。
细胞冻存的方法
一、液氮冷冻保存法细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
注意：细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。
如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。
胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。
如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
细胞培养方法,细胞培养管理,细胞培养技术,细胞培养原理,原代细胞,细胞永生化,生物科技,生物技术支持,细胞冻存,无血清细胞冻存液。
因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
通常采用甘油或二甲基亚砜（DMSO）作保护剂（渗透型），这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。
对于一些原代细胞（皮肤细胞），除渗透型保护剂外，还会适当添加表面型保护剂（海藻糖），以提高细胞存活率。
二、程序冻存步骤（需梯度降温）1、配置冻存液，冻存液推荐配比：55%（基础培养基）+40%(血清)+5%（DMSO）或90%胎牛血清+10%DMSO；推荐使用Procell通用血清型程序冻存液，货号PB180436；2、制备好的细胞悬液计数，计算总细胞量；3、细胞离心后尽量吸干净上清，离心转速1200rpm（250g）3min；4、加入配置好的冻存液重悬，调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL；5、分装入冻存管，一个冻存管分装1~1.5毫升；6、推荐使用程序降温盒，分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放入-80℃冰箱过夜；7、如没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化；8、从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。
细胞冷冻保存方法介绍
细胞冷冻保存方法介绍！1. 注意事项：1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 –90 ％致密度。
1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
1.3. 注意冷冻保护剂之品质。
DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。
Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
1.4. 冷冻保存之细胞浓度：1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。
Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106 cells/ml。
1.5. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
1.6. 冷冻方法：1.6.1. 传统方法: 4 oC 10 分钟- -20 oC 30 分钟- -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜) - 液氮槽vapor phase 长期储存。
1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以–1 ～-3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC，放在液氮槽vapor phase 长期储存。
冷冻保存细胞的技术研究与应用
冷冻保存细胞的技术研究与应用细胞是生命的基本单位，对于许多科学研究和医学应用来说，细胞的保存至关重要。
冷冻保存细胞的技术被广泛应用于细胞学、生物医学和生物工程等领域，为科学家们提供了便利和可能性。
本文将探讨冷冻保存细胞的技术研究与应用，以及其中的挑战和前景。
一、冷冻保存细胞的原理冷冻保存细胞的原理是通过将细胞置于极低温环境下，使其代谢减缓，达到长期保存的目的。
冷冻保存细胞的关键是避免细胞在冷冻和解冻过程中受到损害。
冷冻前，细胞需要进行预处理，包括添加保护剂和调整温度等，以提高其抗冻能力。
解冻时，需要逐步回温，避免快速温度变化对细胞造成的伤害。
二、冷冻保存细胞的技术研究1. 低温冷冻技术低温冷冻技术是冷冻保存细胞的基础，其主要应用于细胞的长期保存。
常用的低温冷冻技术包括液氮冷冻和液氮气相冷冻。
液氮冷冻是将细胞置于液氮中，使其温度降至零下196摄氏度，以达到长期保存的目的。
液氮气相冷冻则是将细胞暴露在液氮蒸汽中，通过快速冷冻和快速解冻的方式，减少细胞受损的风险。
2. 冷冻保护剂的研究冷冻保护剂是冷冻保存细胞过程中的关键因素之一。
目前常用的冷冻保护剂包括甘油、二甲基亚砜和聚乙二醇等。
这些保护剂可以在冷冻过程中降低细胞的渗透压，减少冰晶对细胞的损伤。
此外，一些新型的冷冻保护剂也在不断研究和开发中，以提高细胞的冷冻保存效果。
三、冷冻保存细胞的应用1. 细胞学研究冷冻保存细胞为细胞学研究提供了便利。
科学家们可以将细胞冷冻保存，以备后续的实验和研究。
这不仅可以节省时间和资源，还可以避免细胞的变异和污染。
冷冻保存细胞还可以用于细胞的传代和分化，为细胞学研究提供了更多可能性。
2. 医学应用冷冻保存细胞在医学应用中具有广泛的前景。
例如，冷冻保存胚胎细胞可以用于辅助生殖技术，帮助不孕不育患者实现生育愿望。
此外，冷冻保存造血干细胞可以用于骨髓移植，治疗血液系统疾病。
冷冻保存细胞还可以用于组织工程和再生医学研究，为治疗组织损伤和疾病提供新的治疗方法。
细胞冻存
（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二）细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心，1000rpm，5min；4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。
1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。
在冻存前一天最好换一次培养液；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
细胞冻存操作步骤与细胞复苏细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。
细胞冻存操作步骤：细胞1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。
细胞冻存技术
细胞冻存技术细胞冻存技术概述细胞培养技术自1907年开创以来，历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。
在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天，细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。
低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。
冷冻保存一般是指在0～196℃进行保存，就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。
主要有-20～40℃ 冰箱保存、-60～80℃深低温冰箱和液氮（-196℃）超低温保存等。
应用方向1. 医学方面近年来干细胞的研究越来越被人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞。
根据发育阶段和取材来源，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。
骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。
骨髓干细胞在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。
而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。
而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。
2. 生物学方面细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。
在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天，更是尤为关键，虽然不是治本的方法，但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。
发展历史1. 1776年，Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。
2. 十九世纪中后叶，许多早期的工作者（Prevost，1840；de Quatrefages，1853；Mantegazza，1866；Scheuk，1870）重复研究了低温处理对精子活动的影响，得出了和Spallanzani相似的结论。
即“冷不能杀死精子”。
3. 1900年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。
4. 二十世纪50年代，Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基本结论是。