红景天内生放线菌Hj3发酵条件及其发酵产物抑菌活性初探

红景天内生放线菌Hj3发酵条件及其发酵产物抑菌活性初探史晓晶;于春艳;韩佳音;王华杰【摘要】[目的]探究红景天内生放线菌—变异链霉菌Hj3 (Streptomyces variabilis)的发酵条件、抑菌机制及对采后番茄早疫病的防治效果,为该潜在生防菌的开发利用奠定重要的理论与实践基础.[方法]采用菌丝生长速率法筛选Hj3抑菌物质产生的最佳培养液、接种量,利用正交试验设计探讨培养温度、培养转速、培养液初始pH值等条件,测定Hj3的生长曲线、抑菌物质产生曲线、Hj3抑菌物质对番茄早疫病菌产孢和孢子萌发的影响及对采后番茄早疫病的防治效果.[结果]在4号培养液(乳糖15 g、玉米粉4 g、K2HPO4 0.8 g、KC1 0.2 g、CaCO4 1.6 g、水1 000 mL、pH7)中接人8％ Hj3种子液,28℃150 r/min震荡培养,在第4天时培养液中的活菌数最大,在第5天时Hj3发酵液的抑菌率达到最高;Hj3抑菌物质可明显抑制番茄早疫病菌孢子的产生和萌发,对采后番茄早疫病的防治也有一定效果.[结论]探讨出的发酵条件有利于H j3抑菌物质的后续研究及应用,进一步明确其抑菌机制为H j3的实际应用提供了更加充分的理论支持.【期刊名称】《云南农业大学学报》【年(卷),期】2018(033)003【总页数】6页(P422-427)【关键词】红景天内生放线菌;番茄早疫病菌;发酵条件;抑菌活性【作者】史晓晶;于春艳;韩佳音;王华杰【作者单位】忻州师范学院生物系,山西忻州034000;忻州师范学院生物系,山西忻州034000;忻州师范学院生物系,山西忻州034000;忻州市食品药品监督管理局,山西忻州034000【正文语种】中文【中图分类】S476.91化学农药在长期使用后会带来农药残留、环境污染、植物病原菌产生抗性及药效下降等问题；因此，生物因子作为新的防治角色在农业生产上发挥着越来越重要的作用。

逐步用安全、无毒的生物防治代替化学防治是植物病虫害防治的目标之一，寻找合适的生防菌株投入防治就显得尤为重要[1]。

目前，许多植物内生菌可作为潜在的生物防治菌株[2-3]，植物内生放线菌是重要的类群之一。

由于放线菌本身可产生许多具有抑菌活性的次级代谢产物，故在生物防治中植物内生放线菌有着独特的优势[4]，在抑菌、杀虫等方面都发挥着重要的作用[5-7]。

红景天内生放线菌——变异链霉菌Hj3 (Streptomyces variabilis)对番茄早疫病菌具有较强的抑制作用，作为生防因子投入生产实践具有一定的可行性[8]，但对于Hj3的抑菌机制、防治效果尚未进行探究。

赵淑莉等[9]在分离出玉米大斑病的生防放线菌后，进一步筛选出了该菌的最佳发酵培养液；魏松红等[10]筛选出了具除草活性放线菌DN5的最佳发酵培养液；张红丹等[11]不但筛选了放线菌769的最佳培养液，还研究了该菌的生长规律及产抑菌物质的规律，为放线菌769的开发利用提供了理论指导。

可见，生防菌在投入生产实践前需要探究其最佳发酵培养液、了解其生长规律及产生抑菌物质的规律等问题，为生防菌高效产生抑菌物质提供保障。

因此，本研究以变异链霉菌Hj3作为研究对象，探究其抑菌物质发酵条件、抑菌机制及对采后番茄早疫病的防治效果，为Hj3的开发利用奠定重要的理论与实践基础。

1 材料与方法1.1 供试菌种变异链霉菌Hj3 (S.variabilis)和番茄早疫病菌(Alternaria solani)由忻州师范学院生物系微生物实验室提供。

1.2 菌株的培养及种子液的制备Hj3的培养：采用平板划线法将Hj3接种在高氏一号培养基上，28 ℃培养5 d后，制备直径5 mm的菌碟，备用。

种子液的制备：在50 mL种子培养液(葡萄糖5 g，可溶性淀粉24 g，酵母膏5 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3g，玉米面4g，CoCl2 0.002 g，CaCO33g，蒸馏水1 000 mL)中接入2块Hj3菌碟，28℃ 160 r/min培养5 d，备用。

番茄早疫病菌的培养：在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上接种番茄早疫病菌，25 ℃下培养5 d，在近菌落边缘1/3处用打孔器制备直径5 mm的菌碟，备用。

1.3 Hj3产抑菌物质的最佳培养液的筛选将1～5号培养液(表1)与种子液分别按照9：1的体积比混合，28℃ 160 r/min振荡培养5 d，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，即得发酵液，4℃下保存备用。

按照9：1的体积比将PDA与发酵液混合，制成平板；以相同体积的1～5号培养液替代发酵液为对照。

在平板上接种番茄早疫病菌菌碟，25 ℃培养4 d，采用十字交叉法测量菌落直径，依据下式计算抑制率，试验重复3次。

抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌碟直径)×100%。

1.4 接种量对Hj3抑菌物质产生的影响分别以2%、4%、6%、8%、10%的接种量将Hj3种子液接种于最佳培养液中，28 ℃ 160 r/min振荡培养5 d，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分别测定各过滤液对番茄早疫病菌的抑制率。

试验重复3次。

表1 培养液成分Tab.1 Component of fluid mediums序号code成分component1 淀粉 (starch)：14 g，乳糖 (lactose)：16 g，黄豆粉 (soybean meal)：10 g，KH2PO4：3 g，KCl：0.4 g，水 (water)：1 000 mL2 玉米粉(corn meal)：35 g，黄豆粉 (soybean meal)：20 g，KNO3：5 g，CaCO3：4 g，水 (water)：1 000 mL3 玉米粉(corn meal)：30 g，淀粉(starch)：10 g，葡萄糖(glucose)：20 g，黄豆粉(soybean meal)：20 g，酵母粉(yeast meal)：1 g，NaCl：2 g，MgSO4：0.3 g，(NH4)2SO4：2 g，CaCO3：6 g，KH2PO4：0.2 g，水 (water)：1 000 mL4 乳糖(lactose)：15 g，玉米粉(corn meal)：4 g，K2HPO4 0.8 g，KCl 0.2 g，CaCO4 1.6 g，水(water)：1 000 mL5 蛋白胨(peptone)：5 g，蔗糖 (cane sugar)：30 g，MgSO4：0.5 g，K2HPO4：1 g，FeSO4 0.01 g，水 (water)：1 000 mL1.5 温度、转速、初始pH值对Hj3抑菌物质产生的影响以温度、转速、初始pH值3因素为变量，设计三因素三水平正交试验(表2)。

按照最佳接种量将Hj3种子液接种于最佳培养液中，按表2中的条件培养5 d后测量抑制率，分析并确定3因素的最佳组合。

试验重复3次。

表2 发酵条件的正交试验设计Tab.2 Elements and levels of orthogonal experiment水平levels初始pH initial pH126 130 6228 150 7330 170 8温度/℃temperature转速/(r·min-1)revolving speed1.6 Hj3生长曲线及抑菌物质产生曲线的测定准备若干份最佳培养液与种子液(1.4中得到的最佳接种量)的混合液，采用1.5节中得到的最优培养条件培养，每隔1 d取10 mL培养液进行梯度稀释，采用平板菌落计数法测定菌密度(cfu/mL)。

将剩余的培养液用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，测定滤液对番茄早疫病菌的抑制率，然后绘制Hj3的生长曲线和抑菌物质产生曲线。

试验重复3次。

1.7 Hj3发酵液对番茄早疫病菌产孢和孢子萌发的影响将0.2、1、2 mL发酵液分别与9.8、9、8 mL PDA混合，制平板，然后接种番茄早疫病菌菌碟，25 ℃培养，待菌丝长满后继续培养至产生大量分生孢子，以加入相应体积无菌水为对照。

在每皿中加入5 mL相应稀释倍数(50倍、10倍和5倍)的发酵液，对照中则加入5 mL无菌水，用涂布器轻擦菌落表面，4层纱布过滤后定容至5 mL。

采用血球记计数法测定分生孢子悬浮液的密度(mL-1)，试验重复3次。

将以上孢子悬浮液稀释至显微镜下每视野50～100个孢子，取50 μL置于凹玻片上，并置于铺有湿润滤纸的培养皿中，25 ℃培养10 h，观察并记录孢子萌发的情况，试验重复3次。

孢子萌发率=萌发的孢子数/孢子总数×100%。

1.8 Hj3发酵液对采后番茄早疫病的防治采用段军娜等[12]的方法。

将健康的番茄用75%酒精消毒处理，用接种针在果实腰部刺1个直径为3 mm、深4 mm的伤口，然后将伤口晾干。

预防作用：在伤口中加入10 μL Hj3除菌发酵液，以无菌培养液为对照，自然晾干，24 h后接种105 mL-1番茄早疫病菌孢子悬浮液10 μL。

治疗作用：在伤口加入10 μL密度为105 mL-1番茄早疫病菌孢子悬浮液，24 h后加入10 μL Hj3除菌发酵液，以无菌培养液为对照。

果实晾干后置于25 ℃ 95%相对湿度下培养。

每处理20个番茄，3次重复。

5 d后测定番茄上的病斑面积，分析Hj3发酵液对采后番茄早疫病的预防和治疗作用。

防治效果=(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积×100%。

1.9 数据分析数据采用SPSS 16.0软件进行处理，差异显著性采用Duncan氏新复极差检验法分析。

2 结果与分析2.1 Hj3抑菌物质产生的最佳培养液筛选5种不同成分的培养液培养Hj3后所产的发酵产物对番茄早疫病菌的抑制作用存在一定差异，其中4号培养液的抑制率最高，为82.18% (P＜0.05，图1)。

故选4号培养液作为Hj3的最佳发酵培养液进行后续试验。

图1 Hj3产抑菌物质的培养液的筛选Fig.1 Screening of fluid medium for antifungal substance produced by Hj32.2 接种量对Hj3抑菌物质产生的影响将2%、4%、6%、8%和10% Hj3种子液分别接种在4号培养液培养后，测定Hj3抑菌物质对番茄早疫病菌的抑制率发现：接种量为8%时较为合适(P＜0.05)，抑制率为84.37%，且再加大接种量对Hj3抑菌物质的产生并无显著提高(图2)。

图2 接种量对抑菌物质产生的影响Fig.2 Effect of inoculation dose on antifungal substance produced by Hj32.3 温度、转速、初始pH对Hj3抑菌物质产生的影响通过对温度、转速和初始pH3因素进行正交分析发现：温度均值(2)、转速均值(2)和初始pH值均值(2)最高，因此当温度为28℃，转速为150 r/min，初始pH为7时对Hj3抑菌物质的产生最有利。