冠心病患者外周血循环内皮微粒水平检测及意义

冠心病患者外周血循环内皮微粒水平检测及意义

李南;王小敏;钟昌宝;龙邦盛;张美萃

【摘要】目的检测冠心病患者(CHD)外周血循环内皮微粒(EMPs)的水平及分析其临床意义.方法选择CHD患者120例,按世界卫生组织分类标准分为:稳定性心绞痛43例(SA),不稳定心绞痛35例(UA)和急性心肌梗死42例(AMI),以20例健康人作为对照组.收集健康人和CHD患者外周血,并检测EMPs水平、凝血状态、C反应蛋白(CRP)和肌酸激酶(CK)水平,并分析EMPs水平与凝血状态和CRP和CK之前的相关性.结果 CHD患者循环EMPs水平明显高于健康人,CHD患者循环EMPs与CHD患者的高凝状态和上调的CRP和CK含量密切相关.结论 CHD患者循环EMPs可能参与调节CHD患者的凝血状态和CRP以及CK含量.

【期刊名称】《实用医学杂志》

【年(卷),期】2018(034)023

【总页数】7页(P3979-3985)

【关键词】冠心病;循环内皮微粒;凝血状态;药物治疗

【作者】李南;王小敏;钟昌宝;龙邦盛;张美萃

【作者单位】海口市中医医院检验科海口570216;海口市中医医院检验科海口570216;海口市中医医院检验科海口570216;海口市中医医院重症医学科海口570216;海口市中医医院肺病心病科海口570216

【正文语种】中文

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病（coronary heart disease，CHD），是

冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病［1-2］。CHD及其心血管后遗症仍然是全世界死亡的

首要原因，且CHD发生率与死亡率呈现逐年上升的趋势［3］。因此研究CHD发病机制、早期诊断和治疗具有重要的显示意义。内皮细胞源性微粒（endothelial cell-derived microparticles，EMPs）是内皮细胞在激活、损伤或凋亡时经出芽

方式释放的一类直径介于100～1 000 nm的膜性囊泡［4-5］。本研研究主要检

测CHD患者外周血中循环EMPs水平和分析EMPs与CHD患者凝血状态之间的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料本研究选取2015年2月1日至2017年8月1日海口市中医医院CHD患者120例。所有患者均经冠状动脉造影、心电图等检测确诊。男性85例，女性35例，年龄45～79岁，平均（59±8.1）岁。120例患者按世界卫生组织分类标准分为：稳定性心绞痛（SA）43例，男32例，女11例，平均（55±5.4）岁；不稳定心绞痛（UA）35例，男22例，女14例，平均（58±7.3）岁和急性心肌梗死（AMI）42例，男31例，女11例，平均（57± 6.8）岁。所有纳入研究的患者均为非血缘关系个体，并排除其他系统疾病，如急性/慢性炎症、创伤、

脑梗、周围血管栓塞、恶性肿瘤及严重肝肾疾病等。排除陈旧性心肌梗死（病程6个月以上）。同期体检健康患者20例纳入对照组，其中男12例，女8例，年龄44～76岁，平均（56±6.3）岁。

1.2 仪器及设备台式离心机（Centrifuge 5810R，Eppendorf，德国）；流式细

胞仪（FACS AriaⅢ，BD，美国）；CD31（1∶200）和Annexin V（1∶200）

单克隆抗体购自武汉博士德（武汉），标注珠（碧云天，上海），生化分析仪（日

本东芝生化分析仪，南京）。

1.3 方法

1.3.1 循环微粒的收集（1）用含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管收集CHD患者5 mL静脉血样品；（2）将样品转移至离心管中，4℃条件下，1 550 g离心20 min，取上清；（3）重复步骤（2），取上清，加入上清体积3倍的微粒提取液（锐博生物，广州），充分混匀；（4）4 ℃条件下10 000 g离心10 min，以无菌PBS重悬管底沉淀；（5）重复步骤（4），以150 μL无菌PBS重悬沉淀，即

获得CHD患者循环微囊泡。

1.3.2 流式细胞术（1）收集循环微粒：自外周血中收集的微粒垂悬于适量PBS中；（2）向微粒垂悬液中加入CD31（1∶200）和CD41（1∶200）单克隆抗体，室温孵育30 min；（3）离心去除多余抗体后以PBS垂悬微粒；（4）加入荧光标

记二抗（1∶200），37℃孵育30 min，PBS洗涤5 min×2次；（5）以400 μL PBS重悬微粒，流式细胞仪检测。

1.3.3 总胆固醇（TCHO）、低脂密度脂蛋白（LDL）血脂、血糖、肌酸激酶（CK）和C反应蛋白（CRP）检测采集受试者外周血5 mL，分别检测TCHO、LDL、血脂、血糖、CK和CRP检测等指标检测。

1.4 统计学方法应用SPSS 20.0统计软件，计量资料采用均数±标准差表示，采用t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冠心病患者基本资料纳入研究的120例CHD患者和20名健康人一般情况见表1。各组患者TCHO、LDL和血糖分析结果显示，健康人、SA、UA、AMI组之间差异无统计学意义。检测正常人和CHD患者外周血CK和CRP的水平后发现，SA、UA和AMI组患者CK和CRP水平明显高于正常人，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1A、1B）。

表1 纳入研究的健康人和CHD患者一般情况Tab.1 General condition of healthy subjects and CHD patients ± s注：与健康人比较，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001组别健康人SA UA AMI例数20 43 35 42年龄（岁）

56±6.3 55±5.4 58±7.3 57±6.8男性［例（%）］12（60.0）32（74.4）22（62.9）31（73.8）TCHO（mmoL）5.2±0.5 5.3±0.3 5.6±0.8 5.7±0.7 LDL （mmoL）2.2±0.5 2.5±±0.7 2.6±0.4 2.7±0.9血糖（mmoL）5.3±0.6 5.8±0.6 5.7±0.5 5.5±0.4

图1 正常人和CHD患者外周血CRP和CK水平检测Fig.1 The levels of CRP and CK in normal subjects and CHD patients

2.2 循环微粒分离与鉴定收集健康人和CHD患者外周血，以试剂盒结合离心法分离外周血中总的循环微粒。向分离所得的微粒悬液中加入直径为1 μm标准珠，流式细胞术分析结果显示，微粒粒径与标准珠接近（图2A），与文献报道的微粒分布范围（100 nm～1 μm）相吻合［6-7］。随后，我们检测了微粒表面特征性分子，如Annexin V和磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）［8］。结果发现，分离所得的微粒表面高表达上述两种标志分子（图2B）。以上结果证明，本研究成功的从健康人和CHD外周血中分离得到了循环微粒。

图2 循环微粒分离与鉴定Fig.2 The isolation and identification of circulation MPs

2.3 冠心病患者循环EMPs水平及临床意义利用流式细胞仪检测了健康人和CHD 患者循环EMPs的水平。本研究采用CD31和Annexin V作为内皮微粒的标志分子。结果发现健康人外周血循环微粒中EMP所占比例为70.02%，而SA、UA和AMI型CHD患者外周血中EMPs比例分别为78.25%、84.57%和95.36%，明显高于健康人，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图3A、3B）。进一步分析健康人和CHD患者外周血中EMPs浓度后发现，SA、UA和AMI型CHD患者EMPs