新生儿溶血病检测标准操作规程

新生儿溶血病检测标准操作规程

1.检验原理：本试验为将排阻层析和抗人球蛋白试验（COonIbS试验）相结合，即在微柱凝胶介质中，红细胞抗原与相应的不完全抗体在抗人球蛋白的作用下发生凝集反应，形成红细胞免疫复合物，在一定离心力下，该复合物不能通过凝胶间隙而浮于胶表面或悬于胶中；如无相应的不完全抗体结合，则不能形成红细胞免疫复合物，在一定离心力下，分散的红细胞可以通过凝胶间隙沉于微柱腔底部。

2.主要组成部分：本品系在聚丙烯塑料透明卡片上的六支微柱型管中填充葡聚糖凝胶和抗人球蛋白（多抗），制成抗人球蛋白检测卡，凝胶微管分为反应腔和凝胶分离柱两部分。

3.样本要求：

3.1红细胞样本：采集被检对象静脉血，用EDTA抗凝，配制成红细胞悬液（直接抗人球蛋白试验配制成红细胞生理盐水悬液，间接抗人球蛋白试验配制成红细胞低离子溶液悬液（只适用于交叉配血和不规则抗体筛检）），红细胞最终浓度0.5%-0.8%o

3.2血清样本：采集被检对象静脉血，放入含有兔脑粉或者其他促凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或者37℃放置2小时后离心，20OrPmlO分钟，取上清该上清不得有絮状物或沉淀。

血清标本必须充分去蛋白，否则标本中析出的或红细胞悬液中残余的纤维蛋白可阻碍红细胞沉降，使非凝集细胞离心后在胶表面形成一条红线，呈假阳性反应。

4.检验方法

4.1.准备工作

1）微柱凝胶检测卡的准备：观察外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡平衡至室温（18—25℃）,再用专用离心机离心5分钟。

2）标本采集：用EDTA抗凝管采集被检对象脐带血或静脉血，制备成红细胞标本和血浆标本。

3）红细胞悬液的制备：将被检者红细胞标本至少洗涤4次，取被检者压积红细胞10微升，加入1毫升红细胞稀释液或生理盐水，外观应为均匀淡红色,无絮状物和血块。

4）血浆标本的处理:将被检者血浆标本进行离心,采用3000r∕min离心3min或3500r∕min离心2min（不得有絮状物或沉淀）。

5）放散液制备：

a.热放散：充分洗涤红细胞至少4次，取洗涤后的压积红细胞和等体积的6%牛人

血白蛋白（或生理盐水）混匀，置于56C孵育10分钟，其间不断摇动，离心IOoOg,2—3分钟，取上清即放散液。

b.酸放散：取4体积的A液与1体积的B液混合均匀为AB液。将压积红细胞至少洗涤4次，与等量的AB液混合均匀，室温孵育Imin,300OrPnI离心1—2min o立即将上清移到另一

支干净试管中，并加入紫红色中和液调至肉色或水粉色（500微升上请加入中和液80—85微升），此时PH酸碱度近中性。300OrPln离心取上清即放散液。

4.2操作步骤

4.1.1、新生儿ABO、RhD血型检测卡（微柱凝胶）：

①取新生儿红细胞悬液50微升分别加入检测卡中的1—6孔中。

②使用专用离心机离心5分钟（90OrPm2分钟，1500rpm3分钟）。

③取出检测卡，肉眼判读结果。

4.1.2、抗人球蛋白检测卡（新生儿溶血病胎（婴）儿不完全抗体检测）：

①在第1、4孔分别加入A型红细胞悬液各50微升；在第2、5孔分别加入B型红细胞悬液各50微升；在第3、6孔分别加入0型红细胞悬液各50微升；

②1—3孔分别加入50微升新生儿血浆，4—6孔分别加入50微升新生儿红细胞放散液。

③将检测卡置于37℃孵育器孵育15分钟。

④使用专用离心机离心5分钟（90OrPm2分钟，1500rpm3分钟）,取出检测卡，判读结果。

5.结果判定

阳性结果：红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或悬于胶中，表明被检者血清中含有对应其抗原的抗体或红细胞

阴性结果：红细胞完全沉降到微柱管尖底部，表明血清中无相应抗原免疫的抗体或红细胞没有被致敏。

反应强度：特异性红细胞抗原抗体复合物完全位于胶表面，为强阳性反应；愈靠近胶底部颗粒愈小，反应愈弱。

直抗试验已出现凝集为阳性，游离和放散试验均以检出可以和新生儿红细胞反应的抗体为阳性。

6.检验方法的局限性：

6.1、上腔部分或封口处有气泡或滴滴的卡，必须在使用前离心

6.2浓度过高或过低的红细胞悬液会引起异常结果。

7.产品性能指标：抗人球蛋白抗体效价三32。

8、注意事项

8.1应用抗人球蛋白微柱凝胶免疫试验检测病人红细胞时，一定要用适量EDTA的试管采集血液标本，该标本不能放入4-10℃冰箱保存，以避免红细胞在病人体外致敏所致假阳性反应。

8.2红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。如不得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本试验。

8.3如在微柱凝胶中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体强阳性反应,也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员多报告并讨论。

8.4洗出尽量多红细胞进行放散；注意放散的时间不宜多长，以防溶血；天冷时放散液注意保温;吸出尽可能多的放散液;注意除去放散液中残留的红细胞；放散前红细胞要充分洗涤，至少四次。

8.5每日试验前，先取出微柱凝胶卡放置至室温。

8.6检测卡应放在2-25℃储存，如若长期放在4℃冰箱，建议每1—2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。

9.临床意义

9.1.直接抗人球蛋白试验是用抗人球蛋白血清检测不完全抗体或补体质敏的红细胞，直接抗人球蛋白试验阳性说明受检新生儿红细胞已被血型抗体物质致

9.2.游离试验是检测新生儿血清中不配合的血型抗体物质，是否致敏新生儿的红细胞，要靠直接抗人球蛋白试验和放散试验来证实，因此该试验阳性仅表明可能受害。

值得注意的是，当新生儿血清中不配合的血型抗体物质含量偏低时，相应的致敏红细胞上的抗体含量也极低，此时放散试验由于其灵敏度的限制，放散试验可能会出现假阴性。单一游离试验阳性，应结合临床症状加以判断。

9.3.放散试验是用已知的红细胞抗原，检测从新生儿致敏红细胞上释放出的抗体，放散试验阳性，诊断即可成立。

9.4.直接抗人球蛋白试验为多抗试验，单一的直抗试验阳性，可能由于以下原因：（1）受检者红细胞存在单抗补体C3,或者是补体依赖性抗体，如JK系统抗体；（2）受检者红细胞洗涤不彻底引起的假阳性；（3）药物引起的抗药物抗体；（4）实验操作失误。