从科研级到临床级慢病毒载体制备详解

从科研级到临床级慢病毒载体制备详解

慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内长期的表达。慢病毒载体(LV)在基础科学研究、细胞治疗和基因治疗中的应用越来越广泛，本次综述从病毒载体的选择、科研级慢病毒制备、临床级慢病毒生产等方面进行了详实的介绍。

病毒载体选择

•慢病毒载体

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体（RNA类病毒）。可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。慢病毒介导的基因过表达，可以实现目的基因在细胞内的长期稳定表达。

•构建稳定细胞株的必选载体；

•CAR-T细胞治疗中主要使用的病毒载体；

•病毒包装周期，2~3周内完成；

•慢病毒感染细胞多数需要polybrene辅助。

•感染细胞后2-~4天后呈现表达丰度。

腺病毒

腺病毒载体（adenovirus）是以腺病毒为原型进行基因功能改造而成的，无外壳的双链DNA病毒，病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100%的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶

细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体，在细胞培养物中重组病毒滴度可达11次方；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。

•基因瞬时表达首选载体；

•高浓度浓缩，可用于动物实验；

•病毒包装周期：6~8周；

•腺病毒可以直接感染细胞无需polybrene辅助。

•感染细胞后24H后呈现表达丰度。

•毒种可在HEK293A细胞中反复扩增。

•腺相关病毒

腺相关病毒（AAV）是一种复制缺陷型细小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长，具有明显的组织噬性等特点，这使rAAV成为用于基因转移和基因治疗的一个非常有吸引力的工具载体。

•体内能长时间表达外源基因；

•低免疫原性，良好的基因治疗载体；

•较高的生物安全级别

•病毒包装周期：6~8周；

•组织噬性——组织靶向

AAV组织噬性

AAV1：骨骼肌嗜性（包括心肌），神经组织也可以感染；AAV2：有效转导肌肉，肝脏，脑组织，视网膜;

AAV5：视网膜、神经系统、关节滑膜嗜性、肺；

AAV8：肝嗜性，视网膜、神经组织也可以感染；

AAV9：心肌嗜性，可穿过血脑屏障；

AAV-DJ：广谱性侵染各种细胞，可做细胞实验。

慢病毒包装细胞

293T细胞，慢病毒包装专用细胞，以及在此细胞基础上进行改造的可以提高病毒产量的细胞，如：293FT，293T-Fubio（复百澳专利细胞）等。

实验KPI点：

I. 尽量使用低代数的细胞用于病毒包装；

II. 无支原体等微生物污染；

III. 细胞传代后24H用于病毒包装；

IV. 包装时细胞密度80%左右；

V. 转染后使用低浓度血清进行产毒培养。

补充知识：293细胞是转染了腺病毒E1A基因的人肾胚胎上皮系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293T细胞是亚三倍体人细胞系。染色体众数为64，30%的细胞有64 条染色体。多数细胞der⑴t （1;15）(q42;q13），der⒆t（3;19）(q12;q13），der⑿t（8;12）(q22;p13），还有四条标记染色体，有的细胞另有5条标记染色体。der⑴与M8 (or Xq+）常常成对出现。N17 与N22各有四条。值得注意的是多数细胞有三条X染色体，两条Xq+，一条Xp+。

慢病毒包装质粒系统

目前，通用的慢病毒包装系统有三质粒和四质粒系统，四质粒系

统在的安全性上更好点，而经典的三质粒系统的在操作性及病毒滴度上更胜一筹。

实验中的KPI点：

I. 转移质粒：包装质粒：包膜质粒的转染用量：3:1:1；

II. 包装质粒、包膜质粒质粒很重要，建议花点本钱用点好柱子抽提。基本要求无内毒素，260/280:1.80~1.90之间，电泳条带清晰。

III. 转染效率质控（非常重要），转染后24H细胞形态变圆（如图），48H后部分细胞脱落，如果无此现象，后续的病毒将很难获得高滴度。

补充知识：

三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中，包装质粒在CMV启动子的控制下，表达HIV复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白(VSVG)，应用 VSVG包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留350 bp的gag和RRE，并在其中插入目的基因或标志基因(绿色荧光蛋白GFP)。将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生RCV的可能性。通过三质粒共转染293T 细胞，超速离心后病毒滴度可达10^9TU /ml。

四质粒表达系统,为了减少HIV包装结构的序列同源性，进一步减少重组成RCV的可能性，Dull等人将辅助基因去除。但由于gag，pol的转运需要rev，因此，在上述的三质粒系统的基础上，构建成四质粒表达系统，该系统加上含rev的质粒减少了产生RCV的可能性。

科研级别慢病毒纯化

细胞状态和质粒转染过程决定了病毒的产量，而病毒的纯化方法则决定了病毒的得率和病毒的质量，不同的实验室可根据自身的硬件条件及实验需求选择合适的纯化方案。

I. 超滤柱浓缩法

超滤浓缩分离技术，是根据分子的大小来分离溶液中大分子和小分子物质，超滤离心管通过离心力，使溶液中的小分子溶液和溶剂通过滤膜，而大分子溶质则被截留在样品管中。

基本流程：将含慢病毒上清液转移至超速离心管中，4℃离心5000rpm*30min，浓缩至1ml或更少体积，收集后过滤除菌用于后续实验。

该纯化方法的特点：设备要求低，实验成本低，病毒纯度较差，毒性较高。