从科研级到临床级慢病毒载体制备详解
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。
慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。
慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。
在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。
2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。
通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。
3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。
4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。
通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。
总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体是一种常用于基因转染和基因治疗研究的工具，其构建原理主要包括载体选择、基因插入、包装和转染等几个关键步骤。
下面将分别对这些步骤进行详细介绍。
首先，载体选择是慢病毒构建的第一步。
常用的慢病毒载体包括pLenti、pSico、pRetro等，这些载体通常具有较高的转染效率和稳定性。
在选择载体时，需要考虑载体的大小、复制能力、转染效率以及转染细胞类型等因素，以确保最终构建的慢病毒载体能够满足实验需求。
其次，基因插入是慢病毒构建的关键步骤之一。
一般来说，可以利用限制性内切酶切割载体，然后将待插入的基因片段与载体连接，形成重组载体。
在进行基因插入时，需要注意选择合适的限制性内切酶，控制酶切的时间和温度，以确保基因能够正确插入到载体中。
接下来是包装步骤。
包装是指将重组载体导入到包装细胞中，通过包装细胞的辅助，使其产生慢病毒颗粒。
常用的包装细胞包括293T细胞、HEK293细胞等。
在包装过程中，需要利用辅助载体，如
pMD2.G和psPAX2等，通过三质体共转染的方式，使包装细胞产生
慢病毒颗粒。
最后是转染步骤。
转染是将包装好的慢病毒颗粒导入到目标细
胞中，实现基因的转染。
在进行转染时，需要根据目标细胞的特性
选择合适的转染方法，如离体转染、体内转染等，以确保慢病毒能
够有效地转染目标细胞，并表达目标基因。
总的来说，慢病毒载体构建的原理涉及到载体选择、基因插入、包装和转染等关键步骤。
通过合理的实验设计和操作，可以构建出
稳定、高效的慢病毒载体，为基因转染和基因治疗研究提供有力的
工具支持。
慢病毒载体的构建
慢
慢病毒载体是一种常用的基因转移工具，其安全性评估主要 包括对病毒的毒力、致病性和传播性的评估。在构建慢病毒 载体时，应确保所选用的慢病毒毒株无致病性，且不具有传 播性。
慢病毒载体的生物安全性
在构建慢病毒载体时，应确保载体无外源污染，如细菌、真 菌、支原体等污染。同时，应进行逆转录酶活性检测，以确 保载体无逆转录酶活性，从而避免潜在的基因重组和插入突 变风险。
慢病毒载体的构建流程
01
02
03
04
目的基因的克隆
将目的基因克隆到慢病毒载体 中，常用的克隆方法包括限制
性酶切、连接和转化等。
慢病毒载体的包装
将目的基因与包装信号共同转 染包装细胞，包装细胞能够产 生具有感染力的慢病毒颗粒。
慢病毒的纯化
通过离心、过滤等方法将慢病 毒颗粒从包装细胞中分离出来
，并进行纯化。
生物学功能分析
对目的基因进行生物学功能分析， 如报告基因实验、细胞活性实验、 动物模型实验等，以评估慢病毒 载体对目的基因功能的改善效果。
安全性评估
对慢病毒载体进行安全性评估， 包括对宿主细胞的毒性、免疫反 应、致瘤性等方面进行检测，以 确保慢病毒载体的应用安全可靠。
05
慢病毒载体的安全性与伦理问题
慢病毒的滴度测定
测定纯化后慢病毒的滴度，即 每毫升或每毫克病毒颗粒的数
量。
02
慢病毒载体的设计
包装元件的选择
01
02
03
包装元件
选择合适的包装元件是构 建慢病毒载体的关键步骤， 包括病毒的复制酶、转录 酶和整合酶等。
安全性
确保所选的包装元件无致 病性，不会对宿主细胞造 成不良影响。
兼容性
确保所选的包装元件与载 体的其他元件兼容，能够 实现有效转导和表达。
USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定
USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定目的构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。
方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列，序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和XhoⅠ。
寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，5′端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。
连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定，鉴定正确的质粒进行测序。
构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA與包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。
通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。
结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。
与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107 TU/ml。
结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。
标签：USP22；慢病毒载体；构建；鉴定肿瘤细胞中基因表达具有组织特异性，USP22泛素水解酶属去泛素化酶DUB基因家族成员，其普遍表达表明其功能的保守性，因此，USP22被归类为肿瘤干细胞的标记基因而引起高度关注[1]。
国内外学者研究发现，USP22基因过表达与结直肠癌[2]、肺癌[3]、胃癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]等恶性肿瘤的浸润、转移和预后差高度相关。
沉默USP22基因表达，能显著抑制膀胱癌[7]、结直肠癌[8]细胞增殖，由此推测USP22基因可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。
本研究通过基因工程技术构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制提供实验基础。
1 材料与方法1.1 实验材料、试剂及仪器pLL3.7慢病毒表达载体及包装载体质粒购自广州永诺生物科技有限公司。
细胞治疗工艺人必读慢病毒生产详解
细胞治疗工艺人必读慢病毒生产详解摘要慢病毒载体(LV)在获得性及遗传性疾病的基因治疗中的应用越来越广泛。
这篇综述介绍了生产这些载体最前沿的技术，尤其是涉及到临床应用的大规模生产技术。
相比较于在稳定细胞系生产的逆转录病毒载体，临床级别的慢病毒大多是通过在细胞工厂瞬时转染293或293T细胞生产的。
然而，最近的进展倾向于采用中空纤维管反应器、悬浮培养及改进的稳定细胞系生产。
正如生物技术行业的惯例一样，慢病毒生产已经建立了比较复杂的下有处理规程，包括去除任何过程来源的污染如质粒、宿主细胞DNA或蛋白。
这篇综述比较了已发表的慢病毒大规模生产和纯化工艺并介绍了它们的优缺点。
此外，稳定细胞系领域的进展及它们作为临床材料生产载体的进展也一并介绍。
前言随着欧洲第一个批准AAV1载体用于治疗脂蛋白脂酶缺乏(Glybera)，基于病毒载体的基因治疗将会越来越多地应用到罕见、获得性疾病的治疗。
根据治疗的目的及靶向细胞或组织的不同，会优先选择一种质粒系统。
如果应用在分裂的细胞或组织中，为了达到转基因的长效表达一般需要用整合型载体。
传统上，逆转录病毒载体是很好的选择，因为它们可以将基因稳定整合到细胞中。
目前开发的逆转录病毒载体系统主要有两种：来源于猫白血病病毒的γ-逆转录病毒(MLV)和主要来源于HIV-1的慢病毒载体(LV)。
过去很多成功的临床实验采用的是基于MLV的载体，虽然现在这个载体还在用，但是趋势是倾向于采用慢病毒载体。
这种转变的原因由很多：(i)与γ逆转录病毒相比，慢病毒因为可以跨过细胞膜所以可以转染非分裂细胞。
(ii)慢病毒的整合模式有别于MLV载体，在引入插入突变方面似乎比MLV安全。
(iii)慢病毒可以获得比较高的滴度。
这些就是逐渐由MLV转向LV的主要原因，只是目前LV载体整体的生产条件还没有达到最大潜能及MLV载体的水平。
LV载体已经成功地应用于临床实验，尤其是免疫缺陷、神经退行性贮藏疾病等罕见病的治疗。
慢病毒载体构建 Protocol
慢病毒载体构建是一种用于基因治疗和基因转导的重要工具，其用于将外源基因或shRNA等插入到慢病毒载体中，从而实现对特定基因的表达调控。
下面是慢病毒载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、所需试剂和耗材1.慢病毒载体：用于包装目的基因的包装细胞系，如HepG2.2.15等。
2.目的基因或shRNA：需要插入慢病毒载体的DNA或RNA片段。
3.质粒DNA：用于构建慢病毒载体，包括表达盒质粒和包装质粒等。
4.DNA聚合酶：用于DNA扩增和连接。
5.限制性内切酶：用于DNA切割。
6.DNA连接酶：用于DNA连接。
7.缓冲液：维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。
8.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
9.细胞培养基：用于细胞培养。
10.胎牛血清：提供细胞生长所需的营养物质。
11.抗生素：用于防止细胞污染。
12.其他细胞生物学试剂：如胰蛋白酶、无血清培养基等。
二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。
2.离心机：用于离心管和细胞培养瓶等。
3.水浴锅：用于保温反应液。
4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。
5.细胞培养箱：用于细胞培养。
6.倒置显微镜：观察细胞生长状态和感染情况。
7.紫外线分光光度计：用于测量DNA浓度。
8.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。
9.定量PCR仪：用于定量分析目的基因的转导效率。
三、准备工作1.了解慢病毒载体构建的基本原理和步骤。
2.设计并合成目的基因或shRNA序列，并确认其正确性。
3.准备所有所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
4.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
5.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。
6.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
7.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
8.设置细胞培养箱的温度和湿度等参数。
慢病毒载体的构建讲解
pWXLd : psPAX2 : pMD2G =20:15:6
三 .滴度测定：稀释计数法 滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒 数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表
示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天 细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔 板，100µl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱
重组酶（Gateway® LR Clonase™ II） 293FT细胞（＜16代） 293FT细胞的培养基及其添加成分（Non-Essential Amino Acids，L-Glutamine，pyeuvate solution and G418） 制备感受态用的试剂
我们用的慢病毒载体的2个包装载体
第三天 追加培养液
在每个孔再加入100µl完全培养液，利于细胞的生长。 第五天 观察结果并计算滴度
在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。 假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒
Cytoskeletal anchoring of GLAST determines susceptibility to brain
damage: an identified role for GFAP.
(J Biol Chem,
2007, Oct.)
慢病毒载体介导人IL-12基因修饰树突状细胞体外抗肺癌作用的研究 （邸军，吉林大学博士学位论文，2009年5月）
shRNA : psPAX2 : pMD2G = 20:15:5
Duox1 is the main source of hydrogen peroxide in the rat thyroid cell line
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够长期潜伏在宿主细胞内，并且在细胞分裂时能够传递给子细胞的病毒。
慢病毒的研究和应用在基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域具有重要意义。
慢病毒载体构建是慢病毒研究的关键环节，下面将介绍慢病毒载体构建的原理。
首先，慢病毒载体构建的关键是选择合适的病毒骨架。
常用的慢病毒载体包括HIV-1、HIV-2和SIV等。
这些病毒骨架具有较高的转导效率和稳定性，能够有效地将外源基因导入宿主细胞中。
在选择病毒骨架时，需要考虑到载体的稳定性、毒性和转导效率等因素，以确保慢病毒载体能够在宿主细胞中稳定表达外源基因。
其次，慢病毒载体构建需要将外源基因整合到病毒基因组中。
一般来说，外源基因会被整合到病毒的长末端重复序列（LTR）之间，这样可以确保外源基因能够稳定地表达。
在整合外源基因时，需要使用逆转录酶将外源基因的RNA转录成DNA，并将其整合到病毒基因组中。
整合外源基因的位置和数量会影响慢病毒载体的稳定性和表达水平，因此需要对整合位点和整合数量进行精确控制。
另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的包装限制。
在病毒的生命周期中，病毒颗粒的组装和包装需要依赖于病毒的包装信号。
因此，在构建慢病毒载体时，需要确保外源基因的整合不会影响到病毒的包装信号，否则会影响病毒的组装和包装，从而降低病毒的转导效率和稳定性。
最后，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。
在构建慢病毒载体时，需要对病毒的毒性进行改造，以降低其对宿主细胞的损害。
同时，还需要对病毒的复制和传播进行限制，以确保慢病毒载体在宿主细胞中稳定表达外源基因，同时不会对宿主细胞造成不良影响。
综上所述，慢病毒载体构建是慢病毒研究和应用的重要环节。
通过选择合适的病毒骨架、整合外源基因、考虑病毒的包装限制和确保病毒的安全性和稳定性，可以构建出稳定、高效的慢病毒载体，为基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域的研究和应用提供重要支持。
慢病毒（Lentivirus）载体构步骤和方法
慢病毒（Lentivirus）载体构步骤和方法一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。
病毒液足够用于一般的动物活体实验。
三、重组质粒构建流程1.基因的获得:shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增)2.回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够引起慢性感染的病毒，其特点是在宿主细胞内复制速度较慢，病程较长。
慢病毒载体是一种用于基因转移和基因治疗的工具，其构建原理是通过将外源基因插入慢病毒基因组中，利用慢病毒的复制和转录机制将外源基因稳定地表达在宿主细胞中。
本文将介绍慢病毒载体构建的原理及相关技术要点。
首先，慢病毒载体构建的基本原理是利用慢病毒的基因组和复制机制来稳定表达外源基因。
慢病毒基因组包括基因组RNA和反转录酶，而慢病毒的复制过程主要依赖于反转录酶的活性。
因此，构建慢病毒载体的关键是将外源基因插入到慢病毒基因组中，并确保其在宿主细胞中的稳定表达。
其次，慢病毒载体构建的技术要点包括选择合适的慢病毒载体和外源基因插入位点。
常用的慢病毒载体包括逆转录病毒和伞状病毒，它们具有较高的基因载荷能力和稳定的表达特性。
而外源基因的插入位点则需要选择在慢病毒基因组中不影响病毒复制和转录的区域，通常选择在非编码区域或非必需基因上进行插入。
另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。
为了确保慢病毒载体在宿主细胞中的稳定表达，需要对其进行适当的改造和优化，例如加入启动子和终止子来调控外源基因的表达水平，或者利用基因编辑技术来增强慢病毒的复制和转录能力。
此外，为了降低慢病毒载体的致病性和提高其安全性，还可以通过删除病毒基因组中的致病基因或关键复制基因来实现。
总之，慢病毒载体构建是一项复杂而关键的技术工作，其成功与否直接影响到基因转移和基因治疗的效果。
通过深入理解慢病毒的复制机制和基因组结构，合理选择慢病毒载体和外源基因插入位点，以及优化病毒的表达和安全性，才能够成功构建出稳定、高效、安全的慢病毒载体，为基因治疗和基因转移研究提供有力的工具支持。
慢病毒载体的构建
慢病毒载体的构建一．构建原理：慢病毒属于逆转录病毒科, 但其基因组结构复杂, 除gag 、po l 和env 这3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外, 还包括4 个辅助基因, vif 、vp r 、 nef 、vpu 和2 个调节基因tat 和rev 。
H IV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒, 第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。
慢病毒载体的构建原理就是将H IV 21 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。
载体系统包括包装成分和载体成分: 包装成分由H IV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建, 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; 载体成分与包装成分互补, 含有包装、逆转录和整合所需的H IV 21 顺式作用序列。
同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV ) 的可能性, 将包装成分的5′ L TR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′ L TR 换成SV 40 po lyA 位点等。
将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达gag 和po l 、另一个表达env 。
二．实验操作举例：一）磷酸钙法转染HEK293T 细胞1. 试剂配制:无菌水ddw: 高温灭菌; 分装;2XHBS: 280mM NaCl10mM KCl1.5 mM Na2HPO412 mM glucose50 mM HEPESAdjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;2M CaCl2: 过滤灭菌,分装.2. 实验过程:1. 铺细胞: 选择状态良好的293T 细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish.2. 20-24h 后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染.下面就35mm dish 为例,采用以下转染体系:ddw: 105ulplasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)2M CaCl2: 16.5ul2XHBS: 125ul按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂.先将前三者混匀,最后加2XHBS.一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入,吹打至微现乳白色,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.另一种方法是,加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定,建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打),之后步骤同上,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.二）转染方法2-Fugene转染病毒包装1．传293T细胞，将T75用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，置于37度培养箱10min。
慢病毒载体构建及结构优化
高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中 除含有包装、逆转录及整台所需的顺式序列．还保留
３５０
ｂｐ的ｇａｇ和ＲＲＥ，并在其中插入目的基因或标
志基因（绿色荧光蛋白ＧＦＰ）。将载体系统分成三个 质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减 少载体重组过程中产生ＲＣＶ的可能性。通过三质 粒共转染２９３Ｔ细胞。超速离心后病毒滴度可达１０９
起源于ＨＩＶ ｌ的载体在人ＣＤ。。＋造血细胞中转基因
ＷＵ”１等将ｇａｇ／ｇａｇ—ｐｏｌ表达框分成两个部分， 即ｇａｇ／ｇａｇ蛋白酶框和ｐｏｌ表达框，将ＨＩＶ—ｌ的ｐｏｌ 和ｖｐｒ融台使ｐｏｌ基因产物（逆转录酶和整合酶）能 通过ｖｐｒ与Ｐ６的相互作用而有效地掺台到载体颗 粒中去。井进一步证实此系统完全阻止了载体将功 能性ｇａｇ—ｐｏｌ基因组传递到靶细胞中．而ｇａｇ ｐｏｌ结 构对逆转录病毒ＤＮＡ的激活和ＲＣＶ的产生是绝 对需要的。因此，有可能将慢病毒载体系统分成５个 组成部分。即ｇａｇ氇ｉ白酶、ｖｐｒ—ｐｏｌ、ｒｅｖ、ＶＳＶ一（；包膜 蛋白和载体表达框，以期进一步减少产生ＲＣＶ的 可能性。
１慢病毒载体的构建
１．１构建原理ｏｏ
慢病毒属于逆转录病毒科，但其基因组结构复 杂，除ｇａｇ、ｐｏｌ和ｅｎｖ这３个和单纯逆转录病毒相 似的结构基因外，还包括４个辅助基因，ｖｉｆ、ｖｐｒ、 ｎｅｆ、ｖｐｕ和２个调节基因ｔａｔ和ｒｅｖ［３］。ＨＩＶ・ｌ是慢 病毒中最具特征性的病毒，第一个慢病毒载体系统 即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建 原理就是将ＨＩＶ一１基因组中的顺式作用元件（如包 装信号、长末端重复序列）和编码反式作用蛋白的序 列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包 装成分由ＨＩＶ一１基因组去除了包装、逆转录和整合 所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒 颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包 装、逆转录和整合所需的ＨＩＶ一１顺式作用序列。同 时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点 插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有 复制能力的病毒（ＲＣＶ）的可能性，将包装成分的５’ Ｉ。ＴＲ换成巨细胞病毒（ｃＭＶ）立即早期启动子，３’ Ｉ．ＴＲ换成ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ位点等。将包装成分分别构 建在两个质粒上，即一个表达ｇａｇ和ｐｏｌ、另一个表 达ｅｎｖ。根据这个原理，Ｎａｌｄｉｎｉ和Ｋａｆｒｉ等构建了三 质粒表达系统“’“。 １．２三质粒表达系统 三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒 和转移质粒。其中包装质粒在ＣＭＶ启动子的控制 下，表达ＨＩＶ—ｌ复制所需的全部反式激活蛋白，但 不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白ｖｐｕ；包膜蛋白质 粒编码水泡性口炎病毒Ｇ蛋白（ＶＳＶ—Ｇ），应用 ＶＳＶ—Ｇ包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶 细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。
携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。
慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。
包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。
将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程原理:慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果.在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体,能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率,且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
概念:慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒—1 (H IV—1）来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。
携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织,实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系.慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
基本原理:慢病毒载体系统由两部分组成,即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。
包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能.将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞），即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒.载体成分:与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
慢病毒载体构建及包装操作手册
慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
6)实验完毕用香皂清洗双手。
➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。
该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。
慢病毒载体的构建共26页
谢谢！
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53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
慢病毒载体的构建
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35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
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从科研级到临床级慢病毒载体制备详解慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内长期的表达。
慢病毒载体(LV)在基础科学研究、细胞治疗和基因治疗中的应用越来越广泛，本次综述从病毒载体的选择、科研级慢病毒制备、临床级慢病毒生产等方面进行了详实的介绍。
病毒载体选择•慢病毒载体慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体（RNA类病毒）。
可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。
慢病毒介导的基因过表达，可以实现目的基因在细胞内的长期稳定表达。
•构建稳定细胞株的必选载体；•CAR-T细胞治疗中主要使用的病毒载体；•病毒包装周期，2~3周内完成；•慢病毒感染细胞多数需要polybrene辅助。
•感染细胞后2-~4天后呈现表达丰度。
腺病毒腺病毒载体（adenovirus）是以腺病毒为原型进行基因功能改造而成的，无外壳的双链DNA病毒，病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100%的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体，在细胞培养物中重组病毒滴度可达11次方；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。
•基因瞬时表达首选载体；•高浓度浓缩，可用于动物实验；•病毒包装周期：6~8周；•腺病毒可以直接感染细胞无需polybrene辅助。
•感染细胞后24H后呈现表达丰度。
•毒种可在HEK293A细胞中反复扩增。
•腺相关病毒腺相关病毒（AAV）是一种复制缺陷型细小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长，具有明显的组织噬性等特点，这使rAAV成为用于基因转移和基因治疗的一个非常有吸引力的工具载体。
•体内能长时间表达外源基因；•低免疫原性，良好的基因治疗载体；•较高的生物安全级别•病毒包装周期：6~8周；•组织噬性——组织靶向AAV组织噬性AAV1：骨骼肌嗜性（包括心肌），神经组织也可以感染；AAV2：有效转导肌肉，肝脏，脑组织，视网膜;AAV5：视网膜、神经系统、关节滑膜嗜性、肺；AAV8：肝嗜性，视网膜、神经组织也可以感染；AAV9：心肌嗜性，可穿过血脑屏障；AAV-DJ：广谱性侵染各种细胞，可做细胞实验。
慢病毒包装细胞293T细胞，慢病毒包装专用细胞，以及在此细胞基础上进行改造的可以提高病毒产量的细胞，如：293FT，293T-Fubio（复百澳专利细胞）等。
实验KPI点：I. 尽量使用低代数的细胞用于病毒包装；II. 无支原体等微生物污染；III. 细胞传代后24H用于病毒包装；IV. 包装时细胞密度80%左右；V. 转染后使用低浓度血清进行产毒培养。
补充知识：293细胞是转染了腺病毒E1A基因的人肾胚胎上皮系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。
293T细胞是亚三倍体人细胞系。
染色体众数为64，30%的细胞有64 条染色体。
多数细胞der⑴t （1;15）(q42;q13），der⒆t（3;19）(q12;q13），der⑿t（8;12）(q22;p13），还有四条标记染色体，有的细胞另有5条标记染色体。
der⑴与M8 (or Xq+）常常成对出现。
N17 与N22各有四条。
值得注意的是多数细胞有三条X染色体，两条Xq+，一条Xp+。
慢病毒包装质粒系统目前，通用的慢病毒包装系统有三质粒和四质粒系统，四质粒系统在的安全性上更好点，而经典的三质粒系统的在操作性及病毒滴度上更胜一筹。
实验中的KPI点：I. 转移质粒：包装质粒：包膜质粒的转染用量：3:1:1；II. 包装质粒、包膜质粒质粒很重要，建议花点本钱用点好柱子抽提。
基本要求无内毒素，260/280:1.80~1.90之间，电泳条带清晰。
III. 转染效率质控（非常重要），转染后24H细胞形态变圆（如图），48H后部分细胞脱落，如果无此现象，后续的病毒将很难获得高滴度。
补充知识：三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。
其中，包装质粒在CMV启动子的控制下，表达HIV复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白(VSVG)，应用 VSVG包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留350 bp的gag和RRE，并在其中插入目的基因或标志基因(绿色荧光蛋白GFP)。
将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生RCV的可能性。
通过三质粒共转染293T 细胞，超速离心后病毒滴度可达10^9TU /ml。
四质粒表达系统,为了减少HIV包装结构的序列同源性，进一步减少重组成RCV的可能性，Dull等人将辅助基因去除。
但由于gag，pol的转运需要rev，因此，在上述的三质粒系统的基础上，构建成四质粒表达系统，该系统加上含rev的质粒减少了产生RCV的可能性。
科研级别慢病毒纯化细胞状态和质粒转染过程决定了病毒的产量，而病毒的纯化方法则决定了病毒的得率和病毒的质量，不同的实验室可根据自身的硬件条件及实验需求选择合适的纯化方案。
I. 超滤柱浓缩法超滤浓缩分离技术，是根据分子的大小来分离溶液中大分子和小分子物质，超滤离心管通过离心力，使溶液中的小分子溶液和溶剂通过滤膜，而大分子溶质则被截留在样品管中。
基本流程：将含慢病毒上清液转移至超速离心管中，4℃离心5000rpm*30min，浓缩至1ml或更少体积，收集后过滤除菌用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求低，实验成本低，病毒纯度较差，毒性较高。
II. PEG浓缩法聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种无电荷的线性分子结构的多糖，为乙二醇的聚合物，有较强的脱水作用，其能够破坏蛋白质分子表面的水化层而使蛋白发生沉淀，PEG单独使用时非特异结合高，加入终浓度0.5mol/L的NaCl有助于病毒的沉淀。
基本流程：将含慢病毒上清液和PEG8000（或者4000,6000）按比例充分混合。
4℃离心5000rpm*20min，用1mL或更少体积的病毒存储液重悬沉淀，浓缩至1ml或更少体积。
收集后过滤除菌用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求低，操作简便，非特异结合，PEG 残留易至细胞融合甚至死亡。
III. 超速离心法超速离心法是借助超速离心机根据物质的沉降系数，质量、密度等的不同，应用强大的离心力使病毒分离、浓缩和提纯的方法。
基本流程：将含慢病毒的上清液10000rpm*10min除去细胞碎片，上清液用0.22um的滤膜过滤除菌后转移至超速离心管中，4℃离心30000rpm*2H，用1mL或更少体积的病毒存储液重悬沉淀，再用0.22um滤膜过滤除菌，用于后续实验。
该纯化方法的特点：设备要求高，病毒纯度高，毒性小，病毒回收率相对较低。
这种方法纯化的病毒市场价格相对较高。
大规模慢病毒制备当转向临床实验时会需要大量的慢病毒载体，而将生产工艺放大则显得极为重要。
本文着重介绍以下两种方式的大规模制备：贴壁细胞扩展法(增加生产单元)和悬浮细胞发酵法。
采用贴壁细胞大规模生产慢病毒大多数大规模生产都是小规模生产的直接放大，即通过增加培养/生产单元来实现。
生产基本上采用大量的多层培养系统(Cell Factories(CF)(CF-10)(Figure 2))或者Cell Stacks(CS)。
因为易于操作，10叠层装置(CS-10)是首选，虽然原则上40叠层装置同样也可以用，但是因为它重量增加的原因所以需要特殊的处理系统。
此外，每层平板的气体交换及培养基层不可能一致，因此用显微镜控制40叠层装置细胞的生长很困难。
生产要么采用放在层流工作台的开放模式，要么采用半封闭模式，后者对操作人员、环境及终产品的安全性更高。
收获是通过简单的培养基置换完成的，在某些情况下，通过增加收获次数来提高最终慢病毒的质量。
然而，在临床前及临床级大规模生产时，频繁收获是不现实的，因此在大多数时候只是收获1-3次。
根据10叠层培养设备的数量及收获次数的多少，传统上采用10-24个CF-10设备一次生产周期可以收获的体积介于20-52升之间，基本上可以满足现在的CAR-T细胞治疗的病毒量需求。
采用悬浮培养生产慢病毒虽然转染贴壁细胞是生产慢病毒的金标准方法，但是这个方法在扩大规模上受限。
对工业化生产来说，在大的生物反应器中培养细胞通常是最便捷的方式。
在生物反应器中生产需要对悬浮的生产细胞扩大培养。
多个用于生产慢病毒的细胞系(293T、293FT、293SF-3F6)被报道易于在化学成分限定的培养基中适应悬浮培养。
这些细胞可以在没有贴壁载体的情况下迅速悬浮生长，这使得它们的培养和扩大比贴壁培养的细胞容易很多。
此外，培养基中没有牛血清及其他动物来源的组分是临床生产最合适的情况，它可以降低被外源物质污染的风险。
在悬浮培养模式下，细胞可以通过不同的容器进行扩大：摇瓶、玻璃生物反应器、不锈钢生物反应器、培养袋及一次性搅拌容器。
有报道采用HEK293T 细胞进行扩增、转染、慢病毒生产可以用一次性的生物反应器实现50L的规模。
用磷酸钙沉淀的DNA转染悬浮细胞由于持续的搅拌而被认为效率低下。
因此，大多数时候采用其它的转染试剂如阳离子聚合物。
线性25kDa的PEI可以在293T及293-EBNA1中诱导最高的转染效率，用GFP质粒作为报告质粒可以达到75%的转染效率。
总之，利用悬浮细胞瞬时转染大规模生产慢病毒是可行的，并且显示出良好的产量。
但是，在转移到工业生产之前，该技术还需要进一步完善。
优化的主要瓶颈是转染过程本身，它需要大量质粒DNA，从而使生产过程极其昂贵。
一种工业友好、减少DNA的消耗、提高生产细胞的百分比的转染技术是使这一过程在未来工业中有利可图的关键因素。
大规模慢病毒纯化考虑到工业应用，在生物技术行业传统上使用的工艺步骤已经开发出用于慢病毒纯化技术，它们基本上都是是基于膜或色谱的技术。
基于膜的技术如：过滤/澄清，利用切向流过滤进行浓缩/渗滤；基于色谱的技术如：离子交换色谱，亲和色谱，体积排阻色谱。
这些不同的过程步骤的组合是可变的，在某些情况下，不同的净化原则可以用于相同的目的。
原则上可以区分三个阶段:I. 从粗病毒产品或澄清的细胞培养基中将靶分子捕获是纯化的第一步；II. 中间纯化包括在捕获和优化阶段对澄清的粗产品进行的步骤，这些步骤去除特定的杂质；III. 抛光是最后的步骤，目的是去除微量杂质和杂质，使活性和安全的产品以适合配方或包装的形式存在。