GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察
一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010609570.6(22)申请日 2020.06.29(71)申请人 贵州省水稻研究所地址 550006 贵州省贵阳市花溪区贵州省农科院水稻研究所(72)发明人 闫志强 王晓雪 邓茹月 朱诉讼 尹燕斌 夏忠敏 宫彦龙 王忠妮 (74)专利代理机构 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262代理人 陈丹 张奎燕(51)Int.Cl.G01N 21/64(2006.01)C12N 15/82(2006.01)C12N 15/65(2006.01)A01G 7/00(2006.01)(54)发明名称一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法(57)摘要本发明公开了一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括将荧光蛋白基因和目标基因片段插入到双元载体中，随后转化农杆菌；用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。
该方法简化了筛选步骤、缩短了筛选周期、提高了筛选效率。
权利要求书1页 说明书11页序列表6页 附图11页CN 111896506 A 2020.11.06C N 111896506A1.一种筛选转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括：步骤1：将荧光蛋白基因插入到双元载体中，形成经改造的双元载体；步骤2：将目标基因片段插入到所述经改造的双元载体中；步骤3：用步骤2制备的双元载体转化农杆菌；步骤4：用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；步骤5：将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；步骤6：出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。
绿色荧光蛋白GFP的显微观察及其在转基因研究中的应用
报告基因的特点
已被克隆和全序列已测定； 表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细 胞中无相似的内源性表达产物；
其表达产物容易观察或能进行定量测定
常用的报告基因
基因名称 GUS 基因编码蛋白
β-D-glucuronidase（β-D葡萄糖苷酶）
检测方法
催化底物形成β-D-葡萄糖苷 酸，它在植物体中几乎无背 景，组织化学检测很稳定
实验仪器：荧光显微镜
实验步骤：
1. 2. 3.
取部分转基因幼苗放入IAA溶液中处理5-10分钟 。 无IAA处理的作为对照。 PI 染色 将植物根部浸泡在1XPI工作液中10秒左右。 用水冲洗30秒。
4. 制片 用擦镜纸擦载玻片 滴一滴水 用镊子取一棵幼苗，将根部在水中展开（可以将叶 片切除） 用镊子夹取盖玻片，从一侧轻轻盖上 5.显微镜观察 放下载物台，将载玻片放上载物台，旋转20X物镜 至光路，滤光片在明场位置（1） 将载物台上升至离物镜很近处，不要碰到物镜 寻找视野中模糊的根，下调载物台，聚焦 移动载物台，寻找根尖 转换至40X物镜，滤光片调至蓝光（3）或绿光（4 ），打开shutter，观察、拍照和保存实验结果。
3:绿色荧光蛋白--GFP
GFP最初从水母，jellyfish Aequorea victoria 中分离出 在分子生物学和细胞学领域，GFP是广 泛使用的报告基因
GFP
GFP蛋白含238 氨基酸残基， 分子量29.6KDa Fluorescent protein (荧光蛋白 ): 在蓝-紫外光的激发下产生强的 绿色荧光
普通生物学实验
GFP报告基因的显微观察及其在
拟南芥MDH2基因GFP载体构建及转基因植株的筛选鉴定
拟南芥MDH2基因GFP载体构建及转基因植株的筛选鉴定王媛媛;韩洋洋;耿庆鎏;朱香豫;曹树青;樊婷婷【摘要】[Objective] In order to further study the function of MDH2 gene in response to cadmium stress in plant, the vector of Arabidopsis MDH2-GFP was built up and transgenic lines were constructed.[Method] The RNA of wild-type Arabidopsis was extracted and reverse transcribed into cDNA, the full-length MDH2 coding sequence was amplified by PCR. The amplified MDH2 gene and pXB94-GFP plasmid were digested and connected by double enzymes.The connected product was transformed into E.coli competent cells, then the true recombinant plasmid was transformed into Agrobacterium tumefaciens competent cells and the positive single colony was identified by colony PCR, then it was transferred into wild-type Arabidopsis by the floral-dip method.Finally, the positive transgenic plants were obtained by resistance screening and PCR identification.[Result]MDH2 gene was successfully cloned and the positive transgenic lines were obtained by selective medium withresistance.[Conclusion]The successful acquisition of MDH2-GFP transgenic lines laid the foundation for further research on the function of MDH2 gene.%[目的]以野生型拟南芥为材料构建MDH2基因GFP载体及GFP转基因植株, 研究MDH2基因在植物响应镉胁迫机制中的功能.[方法]通过提取野生型拟南芥的RNA, 反转录成为cDNA, 并以cDNA为模板, 利用PCR扩增MDH2基因, 将扩增所获得MDH2基因和pXB94-GFP质粒双酶切后连接, 并转化进大肠杆菌感受态细胞中, 鉴定正确后再转入农杆菌感受态细胞中, 通过菌落PCR鉴定出阳性单菌落.再通过浸花法转入野生型拟南芥中, 最后利用抗性筛选和PCR鉴定获得MDH2转基因阳性植株.[结果]成功克隆MDH2基因, 并构建了MDH2-GFP重组质粒, 抗性筛选获得了MDH2-GFP转基因植株.[结论]成功获得MDH2-GFP转基因植株, 为进一步研究该基因在植物响应镉胁迫机制中的功能奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2019(047)002【总页数】3页(P96-98)【关键词】拟南芥;MDH2;载体;转基因植株【作者】王媛媛;韩洋洋;耿庆鎏;朱香豫;曹树青;樊婷婷【作者单位】合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009【正文语种】中文【中图分类】Q939.9土壤重金属污染已成为世界性的环境问题之一，其中重金属镉污染是对动植物具有高毒害性的污染物之一，过量的镉会对动植物细胞造成不可逆的损伤[1-4]。
拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究
植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254Chinese Bulletin of Botany收稿日期： ２００５－１２－２０； 接受日期： ２００６－０３－０７基金项目： 科技部重大基础研究前期研究专项（９７３预研） （２００３ＣＣＡ０１１００）＊ 通讯作者 Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ． Ｅ－ｍａｉｌ： ｚｎｙａｎｇ＠ｓｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．研究报告．拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究王鹏程１ 王晨１ 米华玲２ 周根余１ 杨仲南１＊（１上海师范大学生命与环境科学学院 上海 ２００２３４）（２中国科学院上海植物生理生态研究所 上海 ２０００３２）摘要 生物信息学分析表明， 模式植物拟南芥叶绿体中含有大约４ ０００多种蛋白质， 目前只分离得到１ ０００多种， 其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。
本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白ＡＴ５Ｇ４８７９０进行了亚细胞定位研究。
我们克隆了该基因５＇端长１７８ ｂｐ的ＤＮＡ片段， 与绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因构建重组载体ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ。
转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察， ＧＦＰ只在叶绿体中特异表达。
实验结果表明， ＡＴ５Ｇ４８７９０的确为叶绿体蛋白。
本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。
关键词 融合蛋白， 亚细胞定位， 转运肽Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein inArabidopsis thalianaＰｅｎｇｃｈｅｎｇ Ｗａｎｇ１， Ｃｈｅｎ Ｗａｎｇ１， Ｈｕａｌｉｎｇ Ｍｉ２， Ｇｅｎｙｕ Ｚｈｏｕ１， Ｚｈｏｎｇｎａｎ Ｙａｎｇ１＊１（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３４）２（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， ２０００３２）Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｈａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ａｂｏｕｔ ４ ０００ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ； ｈｏｗｅｖｅｒ， ｏｎｌｙａｂｏｕｔ １ ０００ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｖａｌｉｄａｔｅｄ． Ｔｈｕｓ， ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｖｅｒｉｆｙｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａｔ５ｇ４８７９０ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ １７８ ｂｐ ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ５＇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ＧＦＰ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｏｎ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ－ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｓ ｗｅｒｅ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ Ａｔ５ｇ４８７９０ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｃａｎ ａｌｓｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉ－ｇａｔｅ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ， ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器， 由叶绿体膜、类囊体和基质３部分构成， 其主要功能是进行光合作用， 另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成（Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
拟南芥转基因
拟南芥转基因
拟南芥是一种模式植物，多年来围绕拟南芥的相关研究很多，尤其是对于拟南芥转基因研究非常热门，相关的论文也有很多。
原因主要有以下几个方面：
1 拟南芥是一种模式植物，基因组小，克隆其基因比较简单。
2 种植方便，条件易得。
3 拟南芥是自花传粉植物，这样既很容易进行遗传分析。
4 方法简单，不同于传统的植物转基因，不需要植物组织培养阶段，对于实验操作的要求不是很高。
当前拟南芥转基因所使用的方法主要是农杆菌介导的转化（载体法），区别主要是转化的方法不同，有抽真空，花序浸染和喷雾法使用最为广泛。
农杆菌介导转化的基本流程
农杆菌（目标载体）液的制备→拟南芥种植→花期（侵染）→共培养→收种→验证
农杆菌制备
1)从—80℃冰箱中取出lml农杆菌。
2)LB培养基中添加50mg/L的卡那霉素(Kan)和100mg/L的利福平(Rif)。
3)把lml农杆菌加入到含有Kan和Rif抗生素的LB培养基中，28℃振荡10h。
4）拟南芥转基因浸润液采用的是1/2MS，加蔗糖50g/L, PH值调至5．7,。
然后在15p 压力下蒸汽灭菌15min，灭菌结束，冷却后保存于4°C，以待转基因使用。
转化
抽真空/花序浸染/喷雾法
其中抽真空法转化效率最高，但是步骤麻烦，而且要将拟南芥倒置浸染到菌液中，操作不方便。
喷雾法相比来说简便易行，而且进行重复浸染，可以提高转化效率。
验证
1.种子筛选，将收到的种子种植于含有筛选剂（卡那霉素/潮霉素等）的培养基上，筛选出抗性幼苗。
2.PCR, 提取拟南芥基因组，进行PCR扩增，核酸电泳观察有无目的基因。
植物双荧光素酶报告基因实验步骤
植物双荧光素酶报告基因实验步骤植物双荧光素酶报告基因（GFP）是一种常用的荧光标记蛋白，广泛用于生物学研究中。
在植物领域，GFP标记技术已经成为了研究植物生物学和分子生物学的重要工具。
通过将GFP基因与感兴趣的基因融合，可以实现对感兴趣基因在植物中的定位和表达等研究。
本文将介绍植物双荧光素酶报告基因实验的步骤，以及在实验中需要注意的事项和常见的问题及其解决方法。
实验步骤：1.基因克隆首先，需要从所研究的植物中提取RNA，并逆转录为cDNA。
然后利用PCR技术将GFP基因与感兴趣的基因进行融合，打开阅读框并加入适当的启动子和终止子。
将得到的重组基因片段克隆到适当的载体中。
2.转化表达载体将得到的重组载体转化到适当的表达宿主中，例如大肠杆菌。
大肠杆菌系统是常用的原核表达系统，用于快速筛选高效的表达载体。
3.确定正确的表达细胞通过PCR和限制性内切酶切分析，确认重组表达载体已正确构建。
然后利用Western blot或荧光显微镜技术，确认GFP蛋白已表达并定位在细胞中。
这一步是为了确保表达的融合蛋白在细胞中定位正确，并且表达量符合实验要求。
4.转基因植物的制备将得到的重组载体通过适当的方法转化到感兴趣的植物中，例如利用Agrobacterium tumefaciens介导的转化技术。
然后通过对转基因植物的筛选和鉴定，获得含有目标基因的转基因植物。
5. GFP表达分析利用植物生物学和分子生物学技术，对转基因植物中GFP蛋白的表达进行分析。
例如可以通过荧光显微镜观察转基因植物的荧光表达，或者通过Western blot和ELISA技术测定GFP蛋白的表达量。
6.功能分析通过在转基因植物中观察GFP蛋白的表达和定位情况，可以对研究的感兴趣基因在植物中的功能进行分析。
例如可以通过观察GFP蛋白在不同组织中的表达情况，来研究该基因在植物生长发育中的作用。
需要注意的事项和常见的问题及其解决方法：1.载体构建的准确性在构建表达载体的过程中，需要确保重组载体的正确构建。
6、GFP转基因拟南芥的筛选及荧光观察
卡那培养基上筛选tubulin-GFP转基因幼苗
生长一个月左右的GFP转基因植株
体式荧光显微镜观察GFP转基因植株
Bars= 100 μm
CONFOCAL荧光显微镜观察GFP-TUBULIN 在气孔保卫细胞中的定位
材料与试剂
• 材料：野生型拟南芥种子WT、 GFP转基因拟南芥种子
• 试剂：
75％乙醇； 50％84消毒液； 无菌水； MS培养基；
。 MS+kan(卡那霉素）培养基 1ml 移液器
实验操作注意事项： • 严格无菌操作！ • 消毒过程动作要快！ • 枪头不要重复使用，物品不要拿出超净 台！ • 点种时每个位置尽量只点一颗种子！ • 操作时尽量避免说话和人员走动！ • 注意小组内的配合和小组间的协调！
种子消毒及播种实验流程 （超净工作台中完成所有步骤）
1. 将培ห้องสมุดไป่ตู้皿做好标记， 2. WT和GFP两种类型的种子已春化（ 置于4℃冰箱48h）（已
做）； 3. 用1 ml量程的移液器去掉EP管中的ddH2O，加入新的500 ul
ddH2O ，再加入500ul 84消毒液，混匀；颠倒数次，孵育6 min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 4. 1 ml无菌ddH2O水，洗3遍后，去上清 5. 最后加入200 μl ddH2O 6. 用移液器吸取单颗种子，将种子点在培养基表面（每皿4-5 颗种子 尽量均匀）； 7. 封膜，正置平放于培养架上培养。
实验六、八
GFP转基因拟南芥的筛选及荧光观察
2019-11-13
实验六 拟南芥种子消毒及无菌培养
实验目的
1.建立无菌实验操作的概念； 2.掌握植物（拟南芥）无菌培养的方法。
GFP报告基因
拟南芥转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握拟南芥转基因技术的基本原理和方法。
2. 熟悉转基因操作流程，包括目的基因的克隆、转化、筛选和鉴定等步骤。
3. 了解转基因技术在植物基因功能研究中的应用。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛应用的植物模式生物，具有生长周期短、繁殖速度快、基因组序列已完全解析等特点，使其成为研究植物生长发育、基因调控和生物技术的理想材料。
转基因技术是将外源基因导入植物基因组中，使其在植物细胞中表达，从而改变植物性状或赋予其新的功能。
本实验采用农杆菌介导的转基因方法，将目的基因导入拟南芥基因组中。
实验流程包括以下步骤：1. 目的基因的克隆：从基因库或基因组DNA中提取目的基因，通过PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体构建：将目的基因克隆到载体上，如T载体或pBI121载体。
3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。
4. 植物再生：将感染了重组载体的拟南芥叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。
5. 鉴定：通过PCR、Southern blotting等方法对转基因植株进行鉴定。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株（Col-0）2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株E. coli JM1093. 目的基因片段4. T载体或pBI121载体5. PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等6. 培养基、抗生素、琼脂糖等四、实验步骤1. 目的基因的克隆：根据目的基因的序列设计引物，进行PCR扩增。
将扩增产物与T载体连接，转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。
2. 载体构建：将目的基因克隆到pBI121载体上，进行酶切和连接反应。
将连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。
3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥叶片。
将感染后的叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。
拟南芥遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。
二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。
3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。
4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。
四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。
3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。
4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。
五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。
2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。
拟南芥高叶绿素荧光突变体的筛选及基因定位
拟南芥高叶绿素荧光突变体的筛选及基因定位拟南芥高叶绿素荧光突变体的筛选及基因定位摘要：拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为广泛应用于植物遗传学研究的模式植物，其高叶绿素荧光突变体的筛选和基因定位，对于深入理解植物生长发育和光能利用机制具有重要意义。
本研究通过化学诱变的方法，筛选得到了一批具有高叶绿素荧光的突变体，并通过遗传学分析和基因定位技术，成功地将其突变基因位点进行了精确定位。
进一步的研究表明，这些突变基因在拟南芥的叶绿素合成和光能利用过程中起到重要的调控作用。
1. 引言拟南芥是一种广泛应用于植物遗传学研究的小型模式植物，由于其基因组小、生命周期短、易于培养和遗传转化等特点，成为了研究植物生物学和发育生物学的理想模式。
2. 实验方法本研究采用化学诱变的方法，通过处理拟南芥种子或幼苗，引发基因突变的发生。
随后，对得到的突变体进行高叶绿素荧光筛选。
将荧光强度明显高于野生型的突变体进行收集和保存，以进一步研究其突变基因的特性。
3. 筛选结果经过筛选，我们获得了一批荧光强度较高的突变体。
通过对这些突变体进行高通量测序和遗传学分析，我们成功地将其突变基因位点定位到染色体上的特定区域。
4. 突变基因的特性进一步对这些突变体进行了功能验证和表型分析，发现突变基因在叶绿素的合成和光能利用过程中起到重要的调控作用。
部分突变体表现出叶绿素合成受阻或过度积累的特征，说明突变基因可能是相关代谢途径中的重要调控基因。
5. 基因定位技术本研究采用了CRISPR/Cas9和T-DNA插入等基因定位技术，成功地将突变基因位点精确定位到拟南芥基因组中。
这些定位结果为进一步研究突变基因的功能和调控机制提供了基础。
6. 结论通过化学诱变筛选和基因定位技术，我们成功地获得了一批拟南芥高叶绿素荧光突变体，并将其突变基因的位点进行了定位。
这些突变体对于深入研究植物叶绿素合成和光能利用机制非常重要，为植物生长发育和农作物的遗传改良提供了有力的工具。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳学文南方医科大学预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFPN3和质粒pET28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（LuriaBertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASEFREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFPN3质粒全图谱1310．P ET28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
gfp 实验步骤
gfp 实验步骤GFP实验步骤GFP（绿色荧光蛋白）是一种广泛应用于生物学研究中的荧光标记物质，它可以通过荧光显微镜观察到其在细胞或组织中的分布情况。
下面将介绍GFP实验的步骤。
1. GFP基因的克隆需要将GFP基因克隆到感兴趣的载体中。
通常，可以使用限制性内切酶对GFP基因和载体进行酶切，并通过连接酶将两者连接在一起。
连接后的重组载体可以通过大肠杆菌的转化来复制。
2. 细胞培养接下来，将含有重组载体的大肠杆菌进行培养，以扩增GFP基因。
培养条件要求适当的温度和培养基。
当细菌生长到一定程度时，可以进行提取。
3. GFP的纯化提取细菌后，需要进行GFP的纯化。
纯化步骤可以使用亲和层析、离心、电泳等方法。
通过这些步骤，可以得到高纯度的GFP。
4. GFP的表达将纯化后的GFP溶液加入到感兴趣的细胞中，使其表达GFP。
可以通过转染、转化等方法将GFP引入到细胞中。
在细胞培养的过程中，可以观察到GFP表达的情况。
5. 荧光显微镜观察使用荧光显微镜观察GFP在细胞中的分布情况。
荧光显微镜可以通过激发光源激发GFP发出的绿色荧光，并通过镜头观察到荧光现象。
可以通过调节显微镜的对焦、放大倍数等参数来观察GFP的细节。
6. 数据分析观察到GFP的荧光后，可以进行数据分析。
可以计算GFP的表达量、观察GFP在细胞中的定位、动力学等。
通过数据分析，可以得到关于GFP在细胞中的信息。
7. 应用GFP广泛应用于生物学研究中。
例如，在细胞生物学中，可以利用GFP标记蛋白质、细胞器等，观察它们在细胞中的动态变化；在遗传学研究中，可以利用GFP标记基因，观察其在不同组织中的表达情况。
总结：GFP实验的步骤包括GFP基因的克隆、细胞培养、GFP的纯化、GFP的表达、荧光显微镜观察、数据分析和应用。
通过这些步骤，可以获得GFP在生物体内的相关信息，为生物学研究提供重要的实验手段。
GFP作为一种荧光标记物质，在生物学研究中具有广泛的应用前景。
利用绿色荧光蛋白GFP作为报告基因检测转基因植物
第２ ７卷 第 ２期
２０ ０ ８年 ３月
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Ｊ ｒ ａ ｆＦｏ ｄ Ｓ ｉｎ ｅ ａ ｏ ｅ ｈｎ ｌ ｇ ｏｕ ｎ ｌｏ ｏ ｃ ｅ ｃ ｎｄ Ｂｉ ｔ ｃ ｏ ｏ ｙ
Ｖｏ ＿ ７ ＮＯ ２ ｌ２ ．
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文 章 编 号 ：６ ３１８ （０ ８ ０—０ ８０ １ ７—６ ９２ ０ ）２０ ９ —５
利用绿色荧光蛋 白 ＧＦ Ｐ作为报告基 因 检 测 转 基 因植 物
杨 明瑜 ， 刘 翔 ， 褚 华 硕 ，品科 学 与营养 工程 学院 ，北 京 １ ０ ８ ） ０ ０ ３ 摘 要 ： Ｐ作 为报 告 分子 被 广 泛 地 运 用在 转基 因植 株 检 测 中。利 用 Ｐ Ｒ技 术 扩 增得 到番 茄 ＧＦ Ｃ Ｂ ｘｉｈｂｔｒ１ 因（ ｅ Ｉ ） 亚 克隆到含 ＧＦ ａ ｉｉ － 基 ｎ ｏ Ｌ Ｂ一 ， １ Ｐ基 因的 ｐ ＧＦ Ｅ Ｐ载体 上 ， 一 步将 中间载 体构 建 到 进 植 物表 达载 体 ｐ Ｉ２ 上 。重 组 ｐ Ｉ２ － ｅ Ｉ１Ｅ Ｐ经农 杆 菌介导 的 叶盘转 化 法转 化烟 草 ， Ｂ１ １ Ｂ １ １Ｌ Ｂ－－ ＧＦ 分化
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拟南芥模拟植物实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为一种重要的模式植物，在植物遗传学、分子生物学和发育生物学等领域的研究中发挥着举足轻重的作用。
由于其生长周期短、繁殖速度快、基因组相对较小、易于转化和遗传操作等特点，拟南芥成为科学家们研究植物生命现象的理想材料。
本实验旨在通过模拟拟南芥的生长过程，了解其生物学特性，并掌握相关实验技术。
二、实验目的1. 了解拟南芥的生长周期和生物学特性。
2. 掌握拟南芥种子萌发、移栽、生长和观察的基本实验技术。
3. 熟悉拟南芥的遗传转化和基因编辑方法。
三、实验材料1. 拟南芥种子2. 培养基（MS培养基）3. 培养皿、移栽盘、水培箱等容器4. 电转化仪、PCR仪、凝胶成像系统等仪器5. 相关试剂（如DNA提取试剂盒、PCR试剂等）四、实验方法1. 种子萌发（1）将拟南芥种子用70%乙醇消毒2分钟，然后用无菌水冲洗3次。
（2）将消毒后的种子接种到MS培养基上，置于培养箱中，保持适宜的温度和光照条件。
（3）观察种子萌发情况，记录萌发时间和生长状况。
2. 移栽（1）待拟南芥幼苗长到2-3片真叶时，将其移栽到移栽盘中。
（2）在移栽盘中加入适量的营养土，保持土壤湿润。
（3）观察移栽后的生长状况，记录生长时间和生长情况。
3. 生长和观察（1）将移栽后的拟南芥放置于水培箱中，定期更换营养液。
（2）观察拟南芥的生长状况，包括叶片、茎、根的生长速度和形态变化。
（3）记录生长数据，分析生长规律。
4. 遗传转化和基因编辑（1）利用电转化法将目的基因导入拟南芥细胞。
（2）通过PCR和DNA测序验证基因转化成功。
（3）利用CRISPR/Cas9技术对拟南芥基因进行编辑，观察基因编辑效果。
五、实验结果与分析1. 种子萌发实验结果显示，拟南芥种子在消毒后2-3天内开始萌发，5-7天内大部分种子萌发，生长状况良好。
2. 移栽移栽后的拟南芥生长迅速，叶片展开，茎、根生长良好。
3. 生长和观察实验过程中，观察到拟南芥在适宜的生长条件下，生长速度较快，叶片、茎、根的生长状况良好。
GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察
GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察实验原理：1.GFP报告基因全称为绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），简称GFP，20世纪60年代在水母中发现的发光蛋白。
由238氨基酸组成的单链多肽，在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，用于蛋白质在活细胞中的准确定位及动态变化观察（分泌蛋白的分选、亚细胞定位）2.目的基因MAP65-1，是一种微管结合蛋白，可以根据拟南芥叶片表皮细胞、保卫细胞，下胚轴和根部细胞中微管骨架的分布情况来推断目的基因是否存在。
3.表达载体：⏹植物表达载体的构建→导入农杆菌自我复制→浸染花粉转入拟南芥；⏹卡那霉素抗性培养基筛选，⏹卡那霉素:抗生素影响植物细胞叶绿体和线粒体的蛋白合成,引起植株黄化死亡.⏹卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作用的。
转基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素,转化体就很容易从非转化体中筛选出来。
GFP转基因植株野生型植株GFP转基因植株转基因植株1/2MS培养基1/2MS卡那抗性培养基实验材料：GFP转基因拟南芥种子及野生型种子；1/2MS培养基；1/2MS卡那抗性培养基；75％乙醇；10％NaClO；无菌水。
实验步骤：1.种子春化（加蒸馏水放入4℃冰箱中过夜）；2.75％乙醇消毒1min（混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；3.10％NaClO消毒10min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；4. 无菌水洗三遍，用牙签将种子点在培养基表面（每皿4-5颗种子尽量均匀）；5.封膜，做好标记，平放于培养架上培养。
实验结果：黄化正常拟南芥下胚轴的叶绿体从数量和正常黄化苗在叶肉细胞和保卫细胞中，转基因拟南芥观察到绿色荧光标记，但在野生型中未观测到该少等长势不优良的现象，是因为野生型不存在卡那抗性基因，而转基因植株存在卡那抗性基因，所以可以将转基因植株在卡那抗性培养基中筛选出来；在转基因拟南芥中，荧光标记在不同位置亮度效果不同，我们认为可能是与不同位置微管分布情况和微管结合蛋白对不同位置的结合效果不同有关。
GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析
GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析院海英;吴祥辉;东锐;崔百明;黄先忠【摘要】以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了Tt代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白；对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.%GFP gene was amplified by PCR using the plasmid of pMCB30 as template, and the corrected GFP fragment was ligatcd into the plant expression vector of pCMBIA2300-35S-OCS. The p35S:GFP vector was transformed into Agrobacterium GV3101,then p35S;GFP transferred into Olimarabidopsis pumila and Arabidopsis thaliana through Agrobacterium-mediated method. 2 independent plants of T1 generation of transgenic O. pumila and 9 independent plants of T1 generation of transgenic A. thaliana were screened on 1/2 MS medium containing kanamycin. GFP protein can be detected in the root tip cells of transgenic O. pumila and A. thaliana by confocal laser microscopy. GFP gene was confirmed by PCR amplification using DNA of transgenic plants,indicated that GFP gene had been successfully transformed into transgenic plants. The study layed foundations for further using of GFP gene and set up the genetictransformation system of O. pumila,which will benefit a lot in further study of the functional genes of O. pumila.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2012(032)005【总页数】5页(P881-885)【关键词】GFP蛋白;拟南芥;小拟南芥;转基因【作者】院海英;吴祥辉;东锐;崔百明;黄先忠【作者单位】石河子大学生命科学学院,农业生物技术重点实验室,新疆石河子832003;石河子大学生命科学学院,农业生物技术重点实验室,新疆石河子832003;石河子大学生命科学学院,农业生物技术重点实验室,新疆石河子832003;石河子大学生命科学学院,农业生物技术重点实验室,新疆石河子832003;石河子大学生命科学学院,农业生物技术重点实验室,新疆石河子832003【正文语种】中文【中图分类】Q786绿色荧光蛋白GFP（green fluorescence protein）是1962年Shimomura等［1］从维多利亚多管水母（Aequorea victoria）中分离并纯化得到的一种自发荧光的蛋白.1992年，Prasher等［2］克隆到编码全长GFP的cDNA，但当时人们对GFP的应用前景还不甚了解.1994年，Chalfie等［3］首次在大肠杆菌和秀丽隐杆线虫中表达了具有荧光性的GFP，开创了GFP蛋白应用研究的先河.维多利亚水母的GFP蛋白是具有238个氨基酸残基的多肽单体，分子量约为27kD.后来，美籍华人Tsien（钱永健）不仅解析了GFP生色基团发光的原理，而且对GFP进行了大胆的改造，目前实验室使用的发光蛋白，大多都是钱永健改造的变种［4］.2008年，诺贝尔化学奖授予Osamu Shimomura、Martin Chalfie和Roger Tsien三位科学家，以表彰他们因发现和发展了绿色荧光蛋白＂所做的巨大贡献.GFP作为一种新型的报告基因，近年来得到了广泛的应用，可同步跟踪和判断目的基因在转化细胞中的表达情况.GFP广泛用作分子生物学研究的各个领域，转基因研究中一般将目的基因和GFP基因构建成融合表达载体，转入受体细胞中，通过检测GFP蛋白的表达情况，从而检测基因转化情况［5］.近年来植物分子生物学的研究取得了很大的进展，主要以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）为研究对象，拟南芥是甜土植物，不可能含有所有的重要功能基因，特别是一些耐逆基因.新疆小拟南芥（Olimarabidopsis pumila）是新疆特殊生境下广泛分布的植物之一.从系统分类的角度看，小拟南芥和拟南芥同属十字花科，小拟南芥属于无苞芥属（Olimarabidopsis）［6］，同拟南芥相比，二者形态、生活史极为相似，但二者生长的环境有很大的差异.本课题组近年来对新疆小拟南芥进行初步的研究，发现小拟南芥适应于新疆特殊环境，具有一些独特的生物学特性，如光合力强、繁殖率高、能够耐受500 mmol／L的NaCl的胁迫［7－9］.小拟南芥的诸多特点，使之具有成为耐盐研究的另一模式植物的潜能，具有进一步深入研究的价值.本研究首先克隆GFP基因，然后构建过量表达载体p35S：GFP，通过农杆菌介导法分别转化拟南芥和小拟南芥，以期获得GFP蛋白稳定表达的转基因植物作为以后工作的对照材料，并且探索小拟南芥的遗传转化方法，建立小拟南芥的遗传转化体系，为将来进一步利用GFP基因奠定基础.1.1 实验材料1.1.1 植物材料哥伦比亚生态型拟南芥（Col），新疆小拟南芥种子均由实验室保存.1.1.2 菌株、质粒及试剂农杆菌GV3101，质粒pMCB30，pCAMBIA2300－35S －OCS均由中国科学院遗传与发育生物学研究所傅向东研究员惠赠.Ex Taq高保真酶，pMD18－T，限制性内切酶，T4DNA连接酶，IPTG、X－gal等均购自TaKaRa（Japan）公司.DNA回收试剂盒为Promega（America）公司产品.分子量marker购自天根（TIANGEN）公司.MS盐（Murashige ＆SkooG MEDIUM）为Duchefa Biochemiec（Netherland）公司产品.1.2 实验方法1.2.1 GFP基因的克隆与鉴定扩增GFP基因时，以质粒pMCB30为模板，在50μL的反应体系中加入质粒2μL（约100ng），5μL 10×Ex Taq缓冲液，dNTP 0.2mmol／L，正向引物GFP－F（5′－GCTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC－3′）和反向引物GFP－R（5′－GCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATG－3′）各1μmol／L（下划线部分分别为XbaⅠ和SalⅠ酶切位点），1UEx Taq DNA聚合酶，ddH2O补齐.PCR反应程序为94℃，2min后，94℃45s，56℃45s，72℃2min，30个循环后72℃延伸10min.PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上检测，割下目的条带，利用凝胶回收试剂盒纯化后，将回收产物连接到载体pMD18－T上.将连接产物转化DH5α感受态细胞，在涂有IPTG（8mg）、X－gal（0.14 mg）、100μg／mL氨苄抗生素的LB平板上通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆于LB培养基中过夜摇菌，小量提取质粒经酶切鉴定，将鉴定正确的质粒交由北京六合华大基因科技股份公司测序，构建成pMD18－T：GFP.1.2.2 p35S：GFP过量表达载体的构建测序正确的质粒pMD18－T：GFP，用XbaⅠ和SalⅠ酶切回收GFP片段，再将pCAMBIA2300－35S－OCS载体用同样的双酶切后回收质粒大片段.两回收产物经T4DNA连接酶连接后，将连接产物经热激法转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆经过夜摇菌，提取质粒，进行酶切鉴定，构建过量表达载体：p35S：GFP.将该载体转化农杆菌GV3101，用于遗传转化.1.2.3 小拟南芥和拟南芥的培养与转化 2010年3月底将小拟南芥的种子播撒在实验田里，到5月底开始陆续开花，此时将构建好的p35S：GFP载体采用农杆菌介导法转化小拟南芥，参照文献［8］进行.具体方法为：保存的转化p35S：GFP载体的农杆菌菌液活化，扩繁到OD600约2.0，用侵染液（10%蔗糖，0.02%Silwet L－77，40mg／L乙酰丁香酮）悬浮菌体至OD600约0.8，滴在正待开放的花蕾上，一周一次，共3次，获得了大量的T0代种子.拟南芥的室内培养参照文献［6］进行.在超净台上先用70%的酒精洗涤种子1min，然后用20%漂白剂（Bleach）灭菌处理10min.用无菌水洗4～5次，每次充分振荡混匀.将小拟南芥种子在4℃下处理3～4d，均匀地将种子播撒在1／2MS固体培养基，其成分为1%葡萄糖，2.2g／L MS盐，0.05%2－吗啉乙磺酸，0.8%琼脂粉，pH 5.8.置16h光照和8h黑暗的光照培养箱中，培养一周后，于2～3片真叶期，移栽到含蛭石和营养土（1∶1）的盆钵中，之后放置到同样16h光照和8h黑暗的光照培养间里培养.农杆菌介导的转化参照文献［8］进行.1.2.4 转基因植株的筛选和分子鉴定转基因植株的纯合系筛选参照文献［7］进行.转基因植株DNA提取采用CTAB法［8］.PCR鉴定时，首先利用载体上的新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）特异引物nptⅡ－F（5′－TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA－3′）和nptⅡ－R（5′－AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG－3′）检测.反应体系为DNA模板2 μL，10×PCR缓冲液，1μL 2.5mmol／L dNTP，1 μmol／L的正反向引物各0.5μL，r Taq 1U，ddH2O补齐到10μL.反应条件为94℃4min后，94℃35 s，54℃30s，72℃30s，35个循环后，72℃10min.其次采用扩增GFP基因的特异引物GFP－2F（5′－ACGTCCAGGAGCGCACCATCTTC－3′）和GFP－2R（5′－CAGCTCGTCCATGCCGTGAGTGA－3′）进行目的基因检测，反应体系和程序同上.1.2.5 转基因植株的GFP观察转基因T0代植株的筛选参照文献［6］进行，培养一周后非转基因植株逐渐死亡，而转基因植株依然呈绿色，将其置于载玻片上，在激光共聚焦显微镜（LSM510）下观察，用488nm波长激发GFP蛋白荧光.2.1 GFP基因的克隆和过量表达载体构建根据质粒pMCB30上的GFP基因序列，利用高保真的Taq酶扩增GFP基因，经克隆测序后分析表明，扩增的基因和质粒上的GFP基因的核苷酸序列100%一致，全长720bp，编码239个氨基酸.GFP基因再连接到植物表达载体pCAMBIA2300－35S－OCS上，转化大肠杆菌，挑选7个克隆经过夜摇菌提取质粒双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳检测获得预期大小的目的片段（图1），表明成功地构建了植物过量表达载体p35S：GFP.该载体在细菌、植物中的筛选标记基因都是nptⅡ，含有烟草花叶病毒CaMV35S启动子，章鱼碱合成酶基因OCS作为终止子（图2）.将质粒p35S：GFP转入农杆菌GV3101，对转化的菌落通过PCR鉴定，证明目的基因已转入.扩繁菌落，用于下面的遗传转化.2.2 转基因小拟南芥和拟南芥的筛选与根尖细胞的观察将转基因植株T0代种子经表面灭菌后均匀地播撒在含50μg／mL卡那霉素的1／2MS固体培养基上.放在光照培养箱中培养大约一周后，即可观察到抗性苗明显较绿；而非转基因植株则在种子萌发后因不能抗卡那霉素而变黄，甚至不能正常生长最后死亡.共筛选到2株T1代小拟南芥转基因植株，9株T1代拟南芥转基因植株.用激光共聚焦显微镜观察转基因植株的根尖细胞，在细胞核内和细胞质中都可以观察到GFP蛋白的绿色荧光信号（图3），表明GFP基因转入了小拟南芥和拟南芥中，并在根尖细胞中表达.2.3 转基因植株的分子鉴定提取转基因植株的DNA，首先进行nptⅡ基因的PCR扩增，在2株转基因小拟南芥植株和9株转基因拟南芥中均可扩增出预期大小的产物（图4）.然后对转基因小拟南芥和其中7株转基因拟南芥进行GFP绿色荧光蛋白基因的PCR扩增（因nptⅡ基因扩增时，5号较弱，10号杂带多，在扩增时去除），在转基因植株中均扩增出了预期大小的产物（图4）.PCR分析表明GFP基因成功地转入小拟南芥和拟南芥中.拟南芥作为分子生物学研究的模式生物，其遗传转化已经很成熟，本研究采用类似拟南芥遗传转化法在小拟南芥中过量表达GFP基因，虽然目前只获得了2个独立的转基因植株，但转基因植株根尖细胞的细胞核和细胞膜上可以检测到GFP荧光信号，表明GFP基因在小拟南芥中表达了，PCR分析进一步表明GFP基因成功转入小拟南芥中.本研究说明小拟南芥可以采用类似拟南芥的遗传转化方法.但是小拟南芥的转化效率明显低于拟南芥，只有0.3%左右.所以今后需进一步提高小拟南芥的转化效率，并且发现在用抗生素对T0代植株筛选时，拟南芥的卡那霉素筛选一般采用30μg／mL就可以达到目的，但是小拟南芥要用50μg／mL浓度筛选更好.目前，正在构建潮霉素抗性筛选的过量表达载体p35S：GFP，利用GFP报告基因完善小拟南芥的转化体系，为今后从小拟南芥中挖掘功能基因，并进行基因功能研究奠定基础.本研究同时在拟南芥中过量表达GFP基因作为对照，转基因植株根尖细胞的细胞核和细胞膜上可以检测到很强的GFP荧光信号，表明GFP基因在拟南芥中确实表达了，所获得的GFP转基因植株进一步筛选获得纯合体，可用于以后研究的对照材料.本研究构建的GFP基因的过量表达载体p35S：GFP，还有很多克隆位点的内切酶没有被破坏，为进一步利用该载体构建GFP融合表达载体提供方便，以便于研究目的基因的亚细胞定位，而且也可以作为基因工程的报告基因，具有重要科学意义和应用价值.【相关文献】［1］ SHIMOMURA O，JOHNSON F H，SAIGA Y.Extraction，purification，and properties of aequorin，a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan，Aequorea ［J］.J.Cell 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拟南芥SPM12基因GFP载体构建及转基因植株筛选
拟南芥SPM12基因GFP载体构建及转基因植株筛选方雪;徐洁娜;孟杏楠;曹树青;樊婷婷【摘要】[Objective] To further study the function of the SPM12 gene, the SPM12 gene GFP vector and its transgenic plants were constructed by wild-type Arabidopsis thaliana with genetic background in Columbia (Columbia, Col). [Method] The full-length CDS sequence of SPM12 gene was amplified by PCR from the cDNA template which was reverse transcription from the RNA of wild-type Arabidopsis thaliana, and ligated it with the plasmid of GFP vector; then transformed the recombinant plasmid which was successfully constructed into the cells of E. coli DH5α, picked the positive colonies and identified it by PCR, and then transformed its plasmid into the competent cells of Agrobacterium GV3101, the positive colonies were identified by PCR, then it was transferred into wild-type Arabidopsis thaliana through inflorescence-infiltrated method. After receiving the seeds, the positive plants were screened by selective medium with resistance. [Result] The CDS fragment of SPM12 gene and SPM12-GFP recombinant plasmid was obtained, the vector of SPM12-GFP and its transgenic plant was got. [Conclusion] The transgenic plants SPM12-GFP in Arabidopsis thaliana were successfully obtained, which laid a foundation for further study of the function and molecular mechanism of SPM12 gene in Arabidopsis thaliana.%[目的]为了进一步研究SPM12基因的功能, 利用哥伦比亚 (Columbia, Col) 遗传背景的野生型拟南芥材料构建SPM12基因GFP载体及其转基因植株.[方法]以野生型拟南芥的RNA反转录成的cDNA为模板, PCR扩增出SPM12基因的CDS全长序列, 将其连接到GFP载体的质粒上;然后将构建成功的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α受态细胞中, 挑取阳性菌落经PCR鉴定并测序后, 将其质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中.PCR鉴定出阳性菌落后, 通过浸花法将其转入野生型拟南芥植株中.收种子后, 使用带有抗性的选择性培养基筛选出阳性植株.[结果]通过SPM12基因CDS片段和SPM12-GFP重组质粒的获得, 构建了SPM12-GFP载体和其转基因植株.[结论]成功获得拟南芥SPM12-GFP转基因植株, 为进一步研究拟南芥SPM12基因的功能与分子机制奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2019(047)002【总页数】3页(P86-88)【关键词】拟南芥;SPM12;载体;GFP转基因植株【作者】方雪;徐洁娜;孟杏楠;曹树青;樊婷婷【作者单位】合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009【正文语种】中文【中图分类】Q939.9植物在其自然栖息地中经常面临过多的非生物和生物胁迫。
3-观察
3 理解并掌握报告基因GFP的作用原理
4 微管骨架在拟南芥保卫细胞中的定位
实验原理
常规的DNA重组技术gfp基因与目的蛋白基 因连接，形成单一的融合基因表达载体 重组表达载体导入细胞，使融合蛋白瞬时或稳定
表达(转基因植株GFP-tubulin)
检测GF骤
1.回顾转基因拟南芥从种子到幼苗培养的全过程。 2.普通荧光显微镜观察 分别取培养的拟南芥植株叶片、根，载玻片上滴 一滴缓冲液，将材料平铺于上面，盖上盖玻片，荧 光显微镜下观察拟南芥野生型和转基因植株叶片、 根 的不同表现。 3.体视荧光显微镜观察 将培养的拟南芥整体植株直接置于体视荧光显微 镜下，观察野生型、转基因拟南芥整体植株。 4. 激光共聚焦扫描显微镜观察 (演示)
野生型转基因植株在荧光显微镜下观察的现象有何不同叶片根为什体视荧光显微镜下蓝光激发观察结果gfp转基因植株野生型植株开放气孔保卫细胞中gfp标记的微管结合蛋白map65的排布黑暗120min诱导关闭气孔保卫细胞中微管结合蛋白的细胞定位
实验三 GFP-tubulin转基因拟南芥的 荧光显微镜观察
实验目的 1 了解转基因拟南芥从种子到幼苗培养的 全过程。 2 掌握荧光显微镜的基本操作
思考题：
野生型、转基因植株在荧光显微镜下观 察的现象有何不同（叶片、根），为什 么？
体视荧光显微镜下蓝光 激发观察结果
GFP转基 因植株
野生型植株
开放气孔保卫 细胞中GFP标 记的微管结合 蛋白MAP65的 排布
黑暗120min诱导关闭 气孔保卫细胞中微管 结合蛋白的细胞定位
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GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察
实验原理：
1.GFP报告基因
全称为绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），简称GFP，20世纪60年代在水母中发现的发光蛋白。
由238氨基酸组成的单链多肽，在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，用于蛋白质在活细胞中的准确定位及动态变化观察（分泌蛋白的分选、亚细胞定位）
2.目的基因
MAP65-1，是一种微管结合蛋白，可以根据拟南芥叶片表皮细胞、保卫细胞，下胚轴和根部细胞中微管骨架的分布情况来推断目的基因是否存在。
3.表达载体：
⏹植物表达载体的构建→导入农杆菌自我复制→浸染花粉转入拟南芥；
⏹卡那霉素抗性培养基筛选，
⏹卡那霉素:
抗生素
影响植物细胞叶绿体和线粒体的蛋白合成,引起植株黄化死亡.
⏹卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作
用的。
转基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素,转化体就很容易从非转化体中筛选出来。
GFP转基因植株野生型植株GFP转基因植株转基因植株
1/2MS培养基1/2MS卡那抗性培养基
实验材料：
GFP转基因拟南芥种子及野生型种子；1/2MS培养基；1/2MS卡那抗性培养基；
75％乙醇；10％NaClO；无菌水。
实验步骤：
1.种子春化（加蒸馏水放入4℃冰箱中过夜）；
2.75％乙醇消毒1min（混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；
3.10％NaClO消毒10min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；
4. 无菌水洗三遍，用牙签将种子点在培养基表面（每皿4-5颗种子尽量均
匀）；
5.封膜，做好标记，平放于培养架上培养。
实验结果：
黄化
正常
拟南芥下胚轴的叶绿体从数量和
正常黄化苗在叶肉细胞和保卫细胞中，转基因拟南芥观察到绿色荧光标记，但在野生型中未观测到该
少等长势不优良的现象，是因为野生型不存在卡那抗性基因，而转基因植株存在卡那抗性基因，所以可以将转基因植株在卡那抗性培养基中筛选出来；在转基因拟南芥中，荧光标记在不同位置亮度效果不同，我们认为可能是与不同位置微管分布情况和微管结合蛋白对不同位置的结合效果不同有关。
注意事项：
严格无菌操作.
消毒过程动作要快.
枪头不要重复使用，物品不要拿出超净台.
点种时每个位置尽量只点一颗子.
操作时尽量避免说话和人员走动.
注意小组内的配合和小组间的协调.
思考题：
1 .本实验用的了两种培养基，有何不同？主要作用是什么？
实验中分别用到了1/2MS培养基和1/2MS卡那抗性培养基。
MS培养基是一种常用的植物组织培养基；在1/2MS培养基中无机盐为MS培养基的一半。
但在1/2MS 卡那抗性培养基中添加了一种抗生素—卡那霉素。
卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作用的。
转基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素,转化体就很容易从非转化体中筛选出来。
2.什么是GFP? 在生物学研究中有何用途？
GFP是绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），简称GFP，20世纪60年代在水母中发现的发光蛋白。
由238氨基酸组成的单链多肽，在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，可以起到标记目的基因的作用。
3.GFP主要使用什么颜色的激发光？你观察到得荧光是什么颜色？
GFP在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光。