实验四__人类染色体的识别与核型分析

实验四人类染色体的识别与核型分析

一、实验目的

1.学习染色体核型的分析方法；

2.了解人类染色体的特征。

二、实验原理

1．染色体组型(核型)是指生物体细胞所有可测定的染色体表型特征的总称。包括：染色体的总数，染色体组的数目，组内染色体基数，每条染色体的形态、长度、着丝粒的位置，随体或次缢痕等。染色体组型是物种特有的染色体信息之一，具有很高的稳定性和再现性。组型分析能进行染色体分组外，还能对染色体的各种特征做出定量和定性的描述，是研究染色体的基本手段之一。利用这一方法可以鉴别染色体结构变异、染色体数目变异，同时也是研究物种的起源、遗传与进化，细胞遗传学，现代分类学的重要手段。

2．人类的单倍体染色体组(n=23)上约有30000-40000个结构基因。平均每条染色体上有上千个基因。各染色体上的基因都有严格的排列顺序，各基因间的毗邻关系也是较为恒定的。人类的24种染色体形成了24个基因连锁群，所以，染色体上发生任何数目异常、甚至是微小的结构变异，都必将导致许多获某些基因的增加或减少，从而产生临床效应。染色体异常常表现为具有多种畸形的综合征，称为染色体综合征，其症状表现为多发畸形、智力低下和生长发育异常，此外还可看到一些特征性皮肤纹理改变。染色体畸变还将导致胎儿死产或流产。染色体病已成为临床上较常见的危害较为严重的病种之一，染色体病的检查、诊断已经成为临床实验室检查的重要内容。

1960年，在美国Denver市召开了第一届国际遗传学会议，讨论并确定正常人核型(karyotype)的基本特点即Denver体制，并成为识别人类各种染色体病的基础。按照Denver 体制，将待测细胞的染色体进行分析和确定是否正常，以及异常特点即为核型分析。人类染色体分组及形态特征见表1。

表1 人类染色体分组及形态特征（非显带标本）

A组：1-3号，可以区分。1号，最大，M，长臂近侧有一次缢痕；2号，较大，SM；3号，较大，比1号染色体段1/3-1/4）。

B组：4-5号，体积较大，SM，短臂相对较短，两者不容易区分。

C组：6-12，X。中等大小，SM，较难区分。6、7、8、11和X染色体的着丝粒略近中央，短臂相对较长，9、10、12染色体的着丝粒偏离中央。9号染色体长臂有较大次缢痕。

X 染色体介于7-8之间，但在非显带标本中难以区分。

D 组：13-14号，中等大小，ST ，均具有随体，但不一定显现或同时显现，随体的大小存在个体的差异。在非显带标本中难以区分13-15号染色体。

E 组：16-18。染色体小。16，M ，长臂近着丝粒处有一次缢痕，其存在使16号染色体的大小存在较大差异；17，SM ，短臂较长；18，SM ，是SM 中最短的一对染色体，短臂较短。在质量较好的标本中，一般可以区分16-18染色体。

F 组：19-20，次小的M 。在非显带标本中难以区分。

G 组：21-22，Y ，最小的ST 。21、22染色体的长度略有差别，但为适应临床上已将Down 综合征沿用为21三体（而显带证明与此综合征相关的是较小的那条染色体）综合征的叫法，巴黎会议（1971）建议，把这最小的一对改称为第21号（而稍大的一对称为22号），而把这较小的这对第21号染色体排在稍大的22号前面。

Y 染色体的特征，无随体，染色体一般比21、22长；两条姊妹染色单体长臂常平行并拢，而21、22则相互叉开；长臂端部常呈现绒毛状，形态不清晰；与其他染色体相比，着色往往较深；着丝粒不明显。

根据Denver 体制规定，正常核型的描述方式为：46，XX ；46，XY 。

3．人们用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（banding technique ）。

本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中（Q 带、G 带、C 带、R 带、T 带）。G 带是目前被广泛应用的一种带型。染色体标本经胰蛋白酶、NaOH 、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa 染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，因为它主要是被Giemsa 染料染色后而显带，故称之为G 显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G 显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。

三、材料与试剂

人类染色体非显带、显带标本。直尺，剪刀等。

四、实验步骤

1．分析的主要依据

着丝粒指数(%)——短臂占整条染色体的百分比：

%100⨯+q

p p

臂比——长臂与短臂的比值(q/p)。反映着丝粒位置的指标。SAT(随体)

1.0-1.7(M); 1.7-3.0(SM); 3.0-7.0(St); 7.0-(Ot);

相对长度（%）——某条染色体的相对长度为该染色体长度占染色体总长度的百分比。

人类某条染色体的相对长度(%) =该条染色体长度/∑22条染色体长度+X 染色体长 2．分析的主要步骤

① 测量、计算，。 ② 配对 ③ 剪贴

④ 排列——原则：从大到小；短臂向上；着丝粒在一条线上；性染色体单排 ⑤ 画出模式图——(相对比例)原则同上。 3．图像分析方法

20世纪60年代起，人们开始将图像处理技术应用于核型分析中来。目前已实现计算机

自动检测染色体分散良好的中期细胞，并自动完成核型分析。但这样的软件往往价格高昂，一般的单位是不具有的。Abode Photoshop 是一款流行的功能强大的图像处理软件，它比专门的核型分析软件容易获得。用这款软件，可以很容易的完成染色体的排列、测量等工作。程序远较传统方法简单。同时，他还具备传统方法所不具备的诸多功能，诸如去除原照片中的斑点、划痕，调整亮度、对比，对交叉重叠的染色体臂进行修整等，使分析结果比较完美。基本方法如下：

（1）图片获得

将图片输入电脑中。有两种获得图片的方法：一是选择染色体分散良好的有丝分裂中期的细胞，用数码相机进行拍摄（100万像素即可），然后输入电脑；一是按传统方法拍摄，再用300dpi或更高的分辨率将照片扫描进计算机。

（2）图片处理

用剪裁工具（Crop tool）将不需要的部分裁去，调整图像的位置，视情况调整亮度、对比度；去除斑点、划痕等，然后储存图像，名之为“原始图”。在进一步分析前，用橡皮工具（Eraser tool）等将照片中除染色体以外的其他区域擦除干净。然后将图像另存为“核型图”，利用这张背景干净的“核型图”进行核型分析。

（3）图片分析

根据目测，对染色体进行大致归拢。首先将一组染色体中非常明显（如最长、最短，具有随体等）、较易分辨的同源染色体进行配对，归类。其余的染色体可以根据自己的判断，暂且将它们配对。按从长到短的顺序或其他规则，将这些配对的染色体排列起来。然后，测量各条染色体的总长及各臂长度。根据测量结果，再对第一步中“误配”的染色体进行调整。

将染色体大致归类的过程仅需要反复使用套索（Lasso）与自由变形（Free transform）两个工具即可。用套索工具从图中圈选同源染色体，从Edit菜单中选择Free transform，此时被圈选的染色体外出现一个矩形的框，用鼠标按住矩形框的一个角可自由地旋转被圈选中的染色体，使短臂朝上，长臂朝下。而将鼠标伸入矩形框中并按住，则可将选中的染色体拖向任何位置。移动到目的地后，按回车键又可回到套索工具中来。自由变形的快捷键是Ctrl+T，使用此快捷键可省力不少。重复上述过程，将所有同源染色体配成对。在配对过程中，可借助放大工具（zoom tool），看清染色体的细节。

染色体间如存在交叉重叠，我们可以同时处理几个染色体重叠较少的细胞，先用套索工具小心地将叠在上面的染色体圈选、移走，再从另一张照片找到相应的细节，用橡皮图章工具（clone stamp tool）仔细地“克隆”到因“分离”而造成的“断臂”处。注意，克隆前要将两个染色体的尺寸调整成一样大。这样“修补”后的染色体比“嵌合体”式的染色体特征更典型。

视需要在画布中拉一条或几条参考线，选用套索与自由变形两种工具，按核型分析中染色体排列的规则，圈选并拖动配好对的染色体排列，将着丝点排在参考线上。

测量每条染色体的总长与臂长，调整“误配”的染色体。在菜单中选Edit→preference →Guide、Grid&Slice，将其中的Grid line every设为1cm，Subdivision则可视精度需要设为10或其他值，在菜单中选View→Ruler、View→Show→Grid显示标尺与网格，将图像放大到300%左右，根据网格线标示准确测量每条染色体的长度及相应的臂长，并做记录。由此读出的尺寸即是被扫描的原始照片中的染色体的尺寸，虽然显示在屏幕上的染色体要比原始照片中的大。如果一条染色体臂是弯曲的，可按前文叙述的方法圈选并旋转染色体，分段测量。这种测量方法既简便又准确。

算出每条染色体的总长、臂长、臂比等参数。这些参数最为接近的两条染色体为同源染色体。根据这些结果，对目测有误的配对结果进行调整。